CRISPR-Cas9操作流程

Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Protocol No. PT140726-1

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

pGK1.1

U6 CACC G CAAA 4 5

5’ -5’

3’

-3’ -

- ～20bp

2，操作步骤

实验前，请您务必做好以下验证实验：

A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。

B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分

析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列

首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：

●麻省理工学院的CRISPR Design：https://www.360docs.net/doc/e39594886.html,/

●德国癌症研究中心的E-Crisp：https://www.360docs.net/doc/e39594886.html,/E-CRISP/designcrispr

下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”Array

根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）：

Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCC

Fut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC

※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp 的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2. T4 DNA Ligase连接

将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化

载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

Protocol No. PT140726-1

Protocol No. PT140726-1

退火反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于PCR 仪中95℃孵育3min ，孵育后自然冷却20min 。取1.75μl 的杂交后的双链DNA 进行T4 DNA Ligase 连接反应，反应体系如下：

pGK1.1 linear vector 2μl

双链DNA

1.75μl T4 DNA Ligase 1μl 10xT4 DNA Ligase Buffer 1μl ddH 2O 4.25μl 10μl

※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo 序列和负链Oligo 序列，合成后的2条单链 oligo DNA 退火复性成双链DNA ，再进行T4 DNA Ligase 连接反应。

连接产物可以直接转化DH5a 高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。

3. 电转染靶细胞(推荐)

转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg /μl 浓度，再取4～7μg 进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix 细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。

另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

4. 混合克隆pool 检测

48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS 洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS 中，煮5min 后模板就制备好了，剩余的pool 细胞冻存。

PCR 检测（以Fut8基因为例）：

11步骤所制备的模板 5ul

Fut8-seq-F(10mM): 1ul Fut8-seq-R(10mM): 1ul dNTP Mixture(10mM each): 1ul Taq 酶： 0.5ul 10XTaq 酶buffer ： 5ul Mgcl 2 3ul

H2O: 33.5ul Total 50ul 程序： 95℃ 2min cycles 1x 95℃ 20S

X ℃ 20S

72℃ 30S

72℃ 5min cycles 1x 95℃ 变性 5min

PCR 产物使用Cruiser TM 酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。

正链Oligo(100μM) 0.5μl

负链Oligo(100μM)

0.5μl ddH 2O

18μl Annealing Buffer(20x)

1μl 20μl

}

cycles 35x

上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。

5. Cruiser TM筛选阳性克隆

将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza?(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用Genloci TNA抽提试剂盒(Cat.No.: GL10851S)。

然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用Genloci Cruiser TM突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对Cruiser TM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。

Protocol No. PT140726-1

IV．FAQ

Q-1：靶位点设计有哪些注意事项

A-1：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用Zhang Feng lab：https://www.360docs.net/doc/e39594886.html,/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。

Q-2：转染效率低，怎么办？

A-2：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的CTX-1500A电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。

Q-3：单个细胞不生长，怎么办？

A-3：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用Cell Plaza TM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？

A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：Cruiser TM酶、T7E I 和Surveyor酶。其中，Cruiser TM酶和Surveyor酶属于Cel I家族，这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐Cruiser TM酶，它特异性高且价格合理。

Protocol No. PT140726-1

Protocol No. PT140726-1

VI ．附录

附录A pGK1.1 linear Vector

以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为Bbs I 。

Figure 3. pGK1.1插入位点图示

Figure 4. pGK1.1质粒图谱

pGK1.1

：

VII Cruiser TM操作说明

1，操作步骤

1）基因组D NA 的准备

提取细胞的基因组DNA，推荐使用Genloci 公司专为阳性克隆筛选设计的TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S），只需500 个左右的细胞即可提取全基因组D NA，详细实验步骤请参看G enloci TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S）说明书。

2）杂交D NA 的准备

a) 第一轮和第二轮（巢式）PCR 引物设计

分别设计F irst Primers 和N ested Primers。其中F irst Primers 要求具有较高的特异性，其扩增产物推荐为500～1000 bp，Nested Primers 推荐扩增产物长度为300～600bp。First Primers 和N ested Primers 引物对应目的序列的位置如下：

第一轮PCR 产物

第二轮（巢式）

b) 第一轮P CR：获得目的片段

将已经提取的基因组作为模板，使用F irst Primers，以高保真D NA 聚合酶扩增获得目的片段，要求

目的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增

产物。推荐扩增循环数35～40 cycles，反应体系25 μl，100 ng≤模板量≤300 ng。PCR 完成后，取7～

8 μl 进

行电泳检测。

c) 第二轮（巢式）PCR：获得杂交D NA

根据第一轮P CR 电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照M arker 的亮

度估算产物中DNA 的浓度，稀释至总核酸浓度为10～20 ng/μl，一般需要稀释10～50 倍）。其中野

生型模板扩增产物标记为：WT DNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MT DNA；根据您的检测

样本量的大小取合适量的稀释产物作为第二轮P CR 的模板。小量样本的反应体系如下：

MT DNA 2.5 μl

WT DNA 2.5 μl

5×Nested Buffer 5 μl

Mg2+ Buffer 1.5 μl

dNTP（10mM each）0.5 μl

Nested Primer-F 1.2 μl

Nested Primer-R 1.2 μl

GNest DNA polymerase0.3 μl

ddH2O10.3 μl

Total Volume25 μl

大量样本的反应体系如下：

MT DNA 1 μl

WT DNA 1 μl

5×Nested Buffer 2 μl

Mg2+ Buffer0.6 μl

dNTP（10mM each）0.2 μl

Nested Primer-F0.5 μl

Nested Primer-R0.5 μl

GNest DNA polymerase0.1 μl

ddH2O 4.1 μl

Total Volume10 μl

※注意：

若第一轮P CR 的扩增模板为混合模板，即同时含有野生型和突变型模板，则在第二轮P CR 无需混合WT DNA，取稀释后的扩增产物2μl 作为第二轮P CR 的模板。

GNest DNA polymerase 置于-20℃保存，且避免操作污染。在60 s 内，GNest DNA polymerase 可扩增

1 kb 的D NA 片段。

PCR 反应程序推荐如下：

94℃ 45 s 94℃ 10 s Tm * 10 s 72℃ #

15-30 s 72℃ 45 s 95℃

3 min 自然冷却 40℃以下

10 min

35 cycles

*Tm 值由 N ested Primer 决定，一般为

55℃左右。 #

产物片段长度≤500 bp 时，建议为 72℃，15 s ；产物片段长度＞500 bp 时，建议为 72℃，30 s 。

扩增结束后，取 2 μl PCR 产物（实验组）用于下一步 C ruiser TM 酶切检测。

3） C ruiser TM 酶筛选阳性克隆

对照组和实验组杂交 D NA 同时进行 C ruiser TM 酶切，步骤如下： 1. 取一个新的 0.20 ml 的 P CR 反应管，加入 2 μl Positive control DNA ，此为阳性对照组； 2. 分别向实验组和对照组反应管中加入 C ruiser TM 核酸酶和 5×Cruiser TM 缓冲液，总体积为 10 μl ，移 液器吹打混匀，此步骤应置于冰浴上操作。酶切体系如下： 3. 将实验组和对照组置于 P CR 仪中 45℃孵育 15～20 min 。

PCR Products 2 μl 5×Cruiser TM Buffer 2 μl Cruiser TM Enzyme 1 μl ddH 2O

5 μl Total Volume

10 μl Incubation Temperature 45℃ Incubation Time

15～20 min

※注意：Cruiser TM 核酸酶、阳性对照置于-20℃保存，且避免操作污染。

V．结果分析

酶切步骤结束后，应向上述10 μl 反应体系内加入2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置于-20℃保存。当酶切后片段预计<500 bp 时，推荐使用1.5%～2%的琼脂糖凝胶电泳，若酶切片段的大小相近且需要将其分开显示，可提高琼脂糖凝胶浓度并延长电泳时间，凝胶最大浓度推荐≤2.5%。

经C ruiser TM 核酸酶切割后形成三个明显片段，分试剂盒中P ositive Control DNA 为杂交后的D NA 片段，

别为393 bp、134 bp、259 bp，其中134 bp 和259 bp 片段是酶切后片段，而393 bp 片段为杂交形成的homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点，因此，片段大小不变。

Figure 2 阳性对照的电泳结果

M：100 bp-DNA Marker CK+：

Positive Control DNA

※注意：酶切验证阳性的克隆，若需要进行测序，需以第一轮PCR 产物为模板，使用相应的高保真DNA 聚合酶、Nested Primer 引物进行扩增，回收片段送测序即可。

Q-1：电泳结果仅有原片段而无酶切条带？

A-1：造成该实验结果有以下几种可能：

a．D NA 片段中无突变位点，需要重新进行上游实验，可通过对该D NA 片段进行测序验证；

b．D NA 片段中杂交D NA 含量过低，致使反应后条带不易观察到。该情况常见于c ell pool 检测中，因cell pool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低，导致获得DNA 片段中杂交DNA 含量过少，此时建议设立2-3 个重复分别进行P CR 检测，只要检测到C ruiser TM 酶切条带，则可认为敲除成功，存在阳性克隆。

c．C ruiser TM 核酸酶失活。使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。

Q-2：电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？

A-2：出现该情况表明制备的DNA 片段中含有其他杂交位点。首先，应确认制备的DNA 片段是否存在其他DNA 的污染；其次，根据酶切结果进行判定：若酶切后形成的各条带单一，可能在DNA 片段上含有其他杂交位点，需通过D NA 测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是DNA 片段扩增中，DNA 聚合酶错配扩增导致，使用高保真DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响。如果PCR 反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，建议调整PCR 反应条件，以保证只有特异性扩增的PCR 产物用于突变检测。

Q-3：反应后，酶切的条带轻微弥散？

A-3：该现象可能原因如下：

当酶切后条带<200 bp，且经较长时间的核酸电泳，条带宽度变大，亮度不足时呈现类似弥散的带型；当突变位点过长，尤其当突变长度达到50 bp 以上时，酶切后条带易出现弥散现象，此时弥散程度会因酶切后条带大小的不同而不同，片段越小弥散情况越明显。

Q-4：Cruiser TM Enzyme 检测结果是否会出现假阳性？

A-4：Cruiser TM Enzyme 是通过基因工程生产的C el I 同源核酸内切酶，具有更好的稳定性、高度的特异性和高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源DNA 双链。目前为止，尚未有文献报道使用Cruiser TM Enzyme 或C el I 会出现假阳性，或出现其他核酸酶活性。

Q-5：电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？

A-5：因为杂交的D NA 片段是通过巢式P CR 得到的，所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切条带后，不能100%判断该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。因此，需要进行P CR 片段的TA 克隆和测序验证。

附录A阳性对照说明

等量野生型和突变型DNA 片段混合，经98℃加热、自然冷却后形成的杂交DNA，该DNA 链存在两处突变，均为单碱基突变，突变点间距2 bp，如下图所示。经C ruiser TM 核酸酶切割后形成三个明显片段，分别其中134 bp、259 bp 为酶切形成的片段，393 bp 为杂交形成的h omo-duplex DNA 片段，259 bp，

134 bp、

为393 bp、

无酶切割位点，因此，片段大小不变。

阳性对照推荐用量：10 μl 体系用量200 ng。

附录B目的D NA 制备说明

提取基因组D NA 后，在设计F irst Primers 用于第一轮P CR 时，要求其具有较高的特异性，其扩增产物推荐为500～1000bp，Nested Primer 推荐扩增产物长度为300～600 bp。在设计N ested Primer 时，应

使突变位点位于片段的1/3～2/3 处，且反应后获得的片段大小不应小于100 bp，以尽可能增强酶切结果的可观察性。例如：使用第二轮（巢时）PCR 扩增获得全长为400 bp 的DNA 片段，通过调整引物位置，使得预计的突变位点位于距5’-端140 bp 处，则C ruiser TM 核酸酶酶切后获得片段应为140 bp、260 bp。若以

1.5%～

2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得3条清晰的片段，大小分别为140 bp、260 bp、400 bp。在

推荐检测的D NA 片段大小为300～进行C RISPR-Cas9、T ALEN 和Z FN 技术进行基因敲除的检测时，

600 bp；若用于长片段扩增突变检测，片段大小不受限制，但需适当延长反应时间，如调节反应时间为45 min；片段在凝胶电泳时应呈现清晰的单一条带。

附录C酶切效果说明

野生型和突变型模板D NA 混合后进行巢式P CR 是为了获得特异性的序列和足够的量，巢式P CR 必须

采用试剂盒中的5×Nested Buffer、Mg2+ Buffer 和G Nest DNA polymerase 进行反应，以确保不影响后续Cruiser TM 酶切反应。

VIII. 参考文献

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