食品科学论文外文翻译(水解蛋白)中文译文新

核桃（核桃L.）水解蛋白的抗氧化肽的分离纯化和鉴定

陈宁a,b杨红梅a,b孙毅a,b牛军a,b刘淑莹a,c

a张俊应用化学研究所，中国科学院研究所，人民街5625号，长春130022，中华人民共和国

b中国社科院研究生院，北京100039，中国人民共和国

c长春中医大学，长春，中国人民共和国

文章信息：

二零一二年八月二十八日收到稿件

二零一二年九月十四日收到修改稿件

二零一二年九月十四日得到公认

二零一二年九月二十六日在线可用

关键词：

核桃蛋白水解物、清除自由基的活性、纯化、抗氧化肽

摘要：

通过使用三种不同的蛋白酶水解核桃中的蛋白质，来得到抗氧化剂。使用1,1 - 二苯基-2 - 苦肼（DPPH）法来测水解物的抗氧化活性。

其中胃蛋白酶水解物，水解3小时获得具有最高的抗氧化活性，因此可以抑制羟基自由基，亚铁离子螯合物，具有还原性与抑制过氧化脂质的能力。

然后，3小时的胃蛋白酶水解产物顺序通过超滤，凝胶过滤和反相高效液相色谱法纯化。具有最高的抗氧化活性的肽序列被检测为丙氨酸- 天冬氨酸- 丙氨酸- 苯丙氨酸（423.23 Da）的RP-HPLC-ESI-MS，这首次被认定为来自核桃蛋白水解物。

最后，肽对脂质过氧化抑制作用类似于对还原型谷胱甘肽（GSH）的作用。这些结果也表明蛋白水解产物和/或其有效分离的肽可以用作食品添加剂。

1介绍

生物分子的氧化一直被被认为是自由基介导的过程，在所有生物体都是一个重要的反应。自由基是原子，分子或离子的未成对电子或开壳层结构，如羟基自由基（?OH），超氧阴离子自由基（O2?- ）[6,34]。过量自由基的合成，可导致细胞损伤和死亡，从而导致许多疾病，如癌症，中风，心肌梗死，糖尿病和主要障碍[2,4,21]。因此，重要的是要抑制的过度自由基形成。

许多合成抗氧化剂如丁基化羟基苯甲醚（BHA），丁基羟基甲苯（BHT），没食子酸丙酯已被用来清除自由基[28,32]。然而，使用合成抗氧化剂已很可能威胁健康造成肝损伤和致癌作用[9,23]。因此，人们在从源代码中发现的天然抗氧化剂的兴趣与日俱增。许多蛋白质水解物中的肽合物，如大豆蛋白[5,15]，鹰嘴豆蛋白[12,34]，小麦蛋白[18,35]，油菜籽蛋白质[17]，水稻胚乳中的蛋白质[33]，鱼蛋白[10,23,24,29,32]，蛋清蛋白[4,7]和牛蛙的皮肤[20]的抗氧化能力已得到评估。这些水解物的抗氧化性能归于许多性能的共同作用。包括他们清除自由基的能力，作为金属离子螯合剂，氧淬灭剂或供氢，抑制脂质过氧化的能力[4,12,15]。一般肽包括3-20个氨基酸残基，并且它们的活性依赖于组成，结构和疏水性[4,5,19,26,27]。

核桃（核桃L.）是世界上最普遍坚果树[14]。这是营养密集的食物，主要是由于其脂肪含量以及蛋白质，维生素和矿物质的比例构成。一些生物活性，如抗动脉粥样硬化，抗炎和

抗突变特性和抗氧化活性[14]，核桃中的以上成分一直被报道。多酚和维生素E被认为是抗氧化活性[1,3]的主要来源。然而，很少有实验尝试评估核桃蛋白的抗氧化活性。

在本研究中，蛋白质水解物和它们的核桃隔离的肽进行了调查。此外，针对不同的自由基，其抗氧化效果进行了测试。利用超滤，凝胶过滤色谱法和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）纯化抗氧化肽。通过LC-MS/MS确定肽的序列。

2材料与方法

2.1材料

核桃是从中国吉林省当地市场购买的，中性蛋白酶和碱性蛋白酶从诺维信公司（北京，中国）采购。胃蛋白酶获得来自鼎国生物技术有限责任公司（北京，中国）。DPPH（1,1 - 二苯基-2 - 苦基偕腙肼）和GSH（L-谷胱甘肽减少），采购自西格玛化工有限公司的产品（圣圣路易斯，密苏里州，美国）。乙腈（色谱纯）采购自费舍尔化工公司（NJ，USA）。所有其他化学品所用试剂均为分析级。

2.2核桃分离蛋白（WPI）的产生

用石油醚研磨并脱脂的核桃在50?C时将脱脂粉在干燥烘箱干燥。然后将脱脂的四个分散在比为1:15（重量/体积）NaOH溶液中（pH为9.0）并在45?C萃取搅拌1小时。调整pH值至4.5后，在4000×g通过离心分离得到的沉淀物20分钟，冻干在-20?塑料袋中。

2.3制备核桃蛋白水解物（WPH）

核桃蛋白分离物溶解在蒸馏水中浓度为30毫克/毫升，在pH7.0，50 ?C使用中性蛋白酶，在pH8.0，50?C使用碱性蛋白酶和在pH=2.0，37?C使用胃蛋白酶水解4小时。在0.5-，1 - ，2 - ，3 - 和4小时的间隔取出样品，并在沸水浴中加热，在100?C进行10分钟以抑制酶活性。然后以4000×g速度将样品离心15分钟，上清液冻干。

2.4抗氧化肽的分离纯化

2.4.1超滤

对于纯化的抗氧化肽，核桃蛋白水解物通过超滤膜的截留分子量（MWCO）3000沓（Millipore公司，美国）来分馏。所有回收的馏分，冷冻干燥并命名为WPH-I（分子量>3 kDa 的）和WPH-II（<3 kDa的）。

2.4.2 凝胶过滤层析

超滤分离后具有最高的抗氧化活性的馏分在蒸馏水中再溶解，然后使用Sephadex G-25凝胶过滤层析柱分离（10毫米×600毫米，玛西亚生物技术公司，新泽西州，美国）这被用蒸馏水以0.5ml /min速度溶出，并且可监测到280nm。所期望的峰值的馏分组分被冻干并用来与抗氧化活性试验。

2.4.3 RP-HPLC

凝胶过滤色谱分析后具有最高的抗氧化活性的馏分被进一步纯化为C18 DIAMONSIL 4.6/250柱（250毫米×4.6毫米内径，5m，迪马科技，大连，中国）。该柱以乙腈线性梯度为（5-50％），含0.1％甲酸（FA）以1.0毫升/分的流速洗脱。洗脱峰值在220nm处检测到级分，然后被馏分冷冻干燥。

2.5DPPH自由基清除活性

蛋白水解物的DPPH自由基清除活性使用由张某等人描述的经过一些修改的方法进行测量[34]。在96孔盘中将100·L WPH溶液加入到99.7％的乙醇的100 L的DPPH（0.1毫米）溶液中。96孔盘涡旋混合10秒，且在25?C温育30分钟且在吸光度NACH EN515 nm 处用酶标仪GENios（奥地利Tecan公司）。乙醇取代的DPPH补充空白，同时使用蒸馏水代替样品用于控制。DPPH自由基清除能力（DRSA）计算通过以下公式求得：

DRSA (%)=﹡100（1）

其中A样品，Ablank Acontrol样品的吸光度，

2.6羟基自由基清除活性2.6。羟基自由基清除活性

羟基自由基清除活性（HRSA确定性的定义是使用Li等人描述的经过一些修改的方法[12]。反应混合物含50L的2mM1,10菲罗啉，50 L的2mMFeSO4和30L 的0.2M磷酸缓冲液（pH7.4）与在96 - 孔板中20升的样品溶液（用作对照用相同体积的蒸馏水）混合。过氧化氢（0.1％）加入到混合物中并温育在37度下进行60分钟，并用酶标仪GENios（T ecan 公司，奥地利）的结果，获得了使用以下的方程测量515 nm处的吸光度。：高温合金（％）

HRSA (%)=﹡100 (2)

其中As为样品的混合物的吸光度，A1是吸光度对照组（蒸馏水代替样品）;A0是含1,10空白溶液的吸光度- 菲罗啉硫酸亚铁。

2.7还原性检测

使用由yen和Chen [31]开发的测定方法测定水解液对铁（III）的还原能力。将样品溶于蒸馏水中，生成在不同的浓度的溶液。将等分试样（1ml）中的样品溶液与用2.5ml的0.2M 磷酸钠缓冲液和2.5毫升10毫克/毫升铁氰化钾混合。将混合物温育在50?C，30分钟，随后加入2.5ml的10％三氯乙酸溶液。然后3000×g的速度离心混合物10分钟。最后，2.5ml 的上清液混合2.5毫升蒸馏水和0.5毫升的0.1％的氯化铁水溶液和测得的吸光度在700nm 处（卡里50分光光度计，瓦里安，澳大利亚）。减少比例配置是与反应混合物的吸光度成正比的。

2.8 Fe2 +的螯合作用

Fe2 +的螯合是利用张某等人的方法测量[33]。将FeCl2用1毫升m20和1毫升0.5mM 亚铁嗪试剂与0.5ml的等分试样混合。在25?C将反应混合物静置20分钟。吸光度562 nm 处读取金属离子螯合活性，计算如下：金属离子螯合作用

金属离子螯合作用=﹡100 (3)

坯料的制备方式除了使用蒸馏水代替样品外是相同的。EDTA作为阳性对照。

2.9抑制亚油酸过氧化

根据大泽并木[16]的方法测定抗氧化活性。简单地说，将样品溶于10ml的50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，并往10毫升99.5％乙醇的溶液中加入0.13毫升亚油酸。然后用蒸馏水将总体积调整至25毫升，并将混合物放在加盖存储瓶孵育在40?C黑暗环境中。将反应溶液100 L与以上介绍的4.7毫升75％乙醇，0.1毫升30％的硫氰酸铵，0.1ml的0.02M 的氯化亚铁溶液与3.5％盐酸混合。3分钟后，在500nm处读取吸光度。

2.10利用电喷雾串联质谱的肽的鉴定

RP-HPLC纯化溶于H2O/acetonitrile（85:15，体积/体积）后的馏分具有最高的抗氧化活性，然后再将其装到Agilent 1200系列RRLC配备的一个反相柱（用Eclipse Plus C18，3.5 M，2.1毫米×150毫米，安捷伦科技，美国）。流速设定为0.3毫升/分钟，柱温为30?C。流动相A为0.1％甲酸的水溶液。流动相B为100％的乙腈。为了样品分析，用作溶剂梯度如下5-70％B（0-20分钟），70％B（20-25分钟）。质谱电喷雾电离源（ESI）在安捷伦6520 Q-TOF（安捷伦科技，美国）上执行。正离子电离模式是在电压3500 V下进行的。

氮气雾化保持在40 psi和9升/分钟，在350?C的蒸发温度。.在350度下蒸发温度保持在40psi雾化和9升/分钟的氮是在。数据被收集在m / z从100到2000的质心模式。群峰查看器4.5（生物信息学解决方案公司，滑铁卢，ON，加拿大）结合使用手动用来处理MS/ MS 数据并进行肽序列从头测序。

2.11统计分析

一式三份，所有的实验数据分析采用SPSS13.0软件（SPSS公司，芝加哥，IL，US 显著的差异有95％的置信区间（P <0.05）。

3结果

3.1 WPHS制备及其抗氧化活性

在最佳水解条件下对核桃分离蛋白分别用中性蛋白酶碱性蛋白酶和胃蛋白酶水来进WPHS制备及其抗氧化活性测试。相对稳定的DPPH自由基已广泛用于测试化合物作为自由基清除剂或供氢和马尔萨斯的能力评估的抗氧化活性[12,25]。较低的吸光度代表较高的DPPH自由基清除。在图1中所示的结果显示水解物的抗氧化作用受到水解时间和酶不同的影响。在第一次则对抗氧化活性降低与增加与中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解产物的水解时间增加而减少胃蛋白酶的抗氧化活性有关。从图1，DPPH区别观察中，胃蛋白酶水解3小时获得水解活性最高，呈现75.27％DRSA。因此，3小时的胃蛋白酶的水解产物（指定WPPH）被选定为进一步研究的产物。

3.2羟3结果

羟基自由基清除活性

羟基是最活泼的自由基，可以从超氧阴离子和过氧化氢金属离子如铜或铁形成。当羟基基团与芳族化合物起反应，还可以添加对跨双键，产生自由基hydroxycyclohexadienyl。产生的自由基可以进行进一步的反应，如与氧气的反应，得到过氧自由基或分解phenoxyltype去水自由基[11,12]。如图2所示，WPPH显示了良好的HRDA 5:04±0点19毫克/毫升IC50的值，这是比GSH高1.3倍。在泥鳅和卵清蛋白[4,33]的水解产物中观察到了类似的现象，但在以前的文献中WPPH比的IDENTIFIED的每个水解产物的活性相对较高。

图（1）

图（2）

3.3还原力检测

还原力测定法通常用于评估抗氧化剂贡献电子的能力，通过这些电子可以稳定自由基[23]。水解产物的还原力随着WPPH增加而增加，且其活性可与GSH相比（图3）。因此，水解产物的还原能力依赖于WPPH的浓度。我们的研究结果与小麦胚芽，竹荚鱼和黄花鱼皮肤蛋白水解物[23,35]的报道是相似的。

图（3）

图（4）

3.4 Fe2 +的螯合作用

过渡金属，如铁，铜，作为一个电子供体很快与过氧化物反应并形成烷氧自由基。鉴于此，由抗氧化的过渡金属离子螯合延缓氧化过程[23,30]。图4显示了WPPH（1毫克/毫升），GSH（1毫克/毫升）和乙二胺四乙酸（EDTA，0.1毫克/毫升）亚铁离子的螯合能力。WPPH 表现出良好的螯合作用（40％），其结果可与乙二胺四乙酸（P <0.05）比较。WPPH亚铁螯合作用远远强于GSH（1毫克/毫升），对亚铁离子几乎没有螯合能力。金属螯合能力可能参与抗氧化活性，并影响其他功能[15,30]。因此，有几篇论文报告了不同的蛋白水解物[23,30]类似的结果。金属离子具有螯合作用的肽的抗氧化可能是一个将会有所利于发挥防止氧化损伤的机制。

3.5 抗氧化肽的分离纯化

截留分子量为3 kDa的MWCO用于将WPPH分成两部分，WPPH-I（分子量> 3 kDa）和WPPH-II（MW <3 kDa）的超滤膜。WPPH II在2毫克/毫升（60.25％）溶液中具有较

高的DPPH自由基清除活性。这与You等报告的结果是一致的[32]，他发现了这种蛋白质在MW <3 kDa的水解液比其他分子具有较高的抗氧化活性。然后通过凝胶过滤将WPPH-II 分离为4个级分（F1-F4）（图5a）。所有组分对DPPH自由基清除活性进行了测试，如在图5b所示，F3具有最高的抗氧化活性。在活性级分上利用C18柱进行了进一步的反相高效液相色谱进行并分级分离。对14峰（图6a）分别收集。各馏分收集并冻干并对DPPH 自由基清除活性的进行测量。从图6b中，一个明显的区别是可观察到产生的14个级分中F3-6有最高活性。F3-6随后服从LC-MS/MS肽识别序列，并且其氨基酸序列为丙氨酸- 天冬氨酸- 丙氨酸- 苯丙氨酸（423.23沓）（图7）。

3.6纯化的肽的抗氧化活性

使用的清除自由基的活动，降低还原性，螯合作用和抑制脂质过氧化活性对纯化肽的活性进行评价。如表1中所示，纯化的肽可有效地骤冷DPPH自由基和羟基自由基，图 5 Sephadex G-25凝胶过滤色谱法超滤后的核桃蛋白水解物（a）和DPPH自由基清除活性的洗脱峰的活性级分的抗氧化肽的分离。所有结果以均数±标准差（二）一式三份。清除活性可与谷胱甘肽相媲美。此外，纯化的肽表现出良好的还原力，比GSH活性高。纯化的肽Fe2 +的螯合能力（36.34％）在相同浓度为0.2毫克/毫升时活性低于EDTA。脂质过氧化反应是一个复杂的过程，涉及到在氧的存在下脂质自由基和脂质过氧化氢的形成和扩展（R ?，RO?或ROO·）[23]。正如在图8中所示，在亚油酸乳液体系中肽将显著抑制脂质过氧化，类似还有的谷胱甘肽。抑制脂质过氧化的化合物[5]存在的疏水性能是非常重要的。WPPH 净化大大增加了抗氧化活性[4。]在纯化步骤中获得的结果总结在表2中。纯化肽表明DPPH 自由基清除能力相比WPPH增加6.65倍。

图（5）

图（6）

图（7）

表1纯化肽的抗氧化活性

Antioxidant DRSA (%)a HRSA (%)b Reducing powerc Chelating activity (%)c Purified peptide 40.97+20.74 31.01+1.37 1.07+0.08 36.34+1.64

GHS 46.98+1.6 34.84+1.88 0.64+0.03 3.25+0.53

EDTA 97.39+1.04

表2DPPH自由基清除活性核桃蛋白水解物和纯化倍数

Antioxidant DRSA (IC50, mg/ml)a Purification fold

WPPH 2.06+0.21 1

Ultrafiltration (WPPH-II) 1.64+0.12 1.26

Gel filtration (F3) 0.73+0.10 2.82

RP-HPLC (F3-6) 0.31+0.03 6.65

图（8）

4讨论

本研究旨在核桃蛋白抗氧化肽的分离和鉴定。为了这个目的，核桃蛋白水解使用中性蛋白酶碱性蛋白酶和胃蛋白酶。在水解过程中，依赖于酶的特异性和水解时间[4]会产生各种各样的较小的肽。将活性肽螯合氧自由基，螯合促氧化的金属离子和抑制脂质过氧化的化合物在食品体系中[8,32]。在本研究中，胃蛋白酶水解3小时，显示DPPH自由基清除能力比其他蛋白酶水解产物更强。因此，3小时的胃蛋白酶水解物被选定为进一步研究对象。采用超滤技术隔离的抗氧活性肽对核桃水解分馏。在低分子量重量多肽组分（<3 kDa的）中观察到了更高的抗氧化活性，这被认为是由于脂质自由基反应很容易发生减少自由基介导的脂质过氧化反应[4,29]。其次通过凝胶过滤和反相高效液相色谱法对水解产物进行纯化。所有组分的抗氧化测试活动如示于图（图5和图6）。最后，得到了新的抗氧化肽丙氨酸- 天冬氨酸- 丙氨酸- 苯丙氨酸。纯化肽DPPH自由基清除活性高于原油WPPH6.65倍。因此Chen等人用凝胶过滤和反相高效液相色谱法从卵蛋白水解物（EPH）中得到了两个孤立肽酪氨酸- 亮氨酸- 甘氨酸- 丙氨酸- 赖氨酸（P1）和甘- 甘- 亮氨酸- 谷氨酸-Pro的-异亮氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-谷氨酰胺（P2）。P1和P2纯化后增加了抗氧化活性（分别高于EPH的7.48和6.02倍）。一般研究结果证实了短大肽具有比他们的父母天然蛋白质或大型多肽[32]强的抗氧化活性。

生物活性肽，每分子一般包括2-20个氨基酸残基，分子量越低，越过肠屏障发挥生物学他们效果的机会越大[13,19,23,24]。抗氧化肽具有一些金属螯合或氢/电子的活动，这可能使他们与自由基和终止自由基链反应[22]。

Chen等人[5]发现通过增加脂质肽溶解度对于抑制脂质过氧化疏水性氨基酸可能发挥

重要的作用。You等[32]分离出的肽的脯氨酸-丝氨酸- 酪氨酸-缬氨酸，来自泥鳅蛋白水解产物，其中有3个序列中的疏水氨基酸（75％）：抗氧化肽酪氨酸- 丙氨酸- 谷氨酸- 谷氨酸- 精氨酸-酪氨酸-脯氨酸的-异亮氨酸-亮氨酸，酪氨酸- 甘氨酸- 精氨酸- 甘氨酸-亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸的-异亮氨酸-天冬酰胺，苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-亮氨酸，通过胃蛋白酶从蛋清制备的水解物中纯化，其中疏水性氨基酸的肽链代表分别为66.7％，50％和60％[7]。在这项研究中，分离的肽（丙氨酸- 天冬氨酸-

丙氨酸- 苯丙氨酸）有三个疏水性氨基酸的肽序列（75％），这可能是对亚油酸模型系统中的抗氧化活性产生影响的原因。芳香族氨基酸，如苯丙氨酸反应的氧气的存在允许直接电子转移（ROS）[20]。结果来源于Nazeer和[24]陈等人[4]。他们发现了苯丙氨酸肽的抗氧化活性的重要作用。

5结论

根据我们在这项研究中的研究结果，核桃蛋白水解物和/或隔离肽具有优异的抗氧化活性，如自由基清除活性，还原性和抑制脂质过氧化。此外，核桃蛋白水解物的金属离子螯合能力是高于谷胱甘肽。因此，核桃蛋白水解物和/或其孤立肽可以用于功能性食品组分和/或药品中的抗氧化剂并且很有前途。

致谢

这项工作由国家科学技术部（编号：2011BAI03B01），吉林省科学技术部（YYZX201131）和中国博士后科学基金会资助项目支持（2012M511355）。

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