高效液相色谱

高效液相色谱仪简介

系别：应用化学系

专业班级：应用化工技术0921

姓名：曹晋波

指导教师：贺永强

运城学院

2012年 5 月

高效液相色谱仪

摘要：高效液相色谱仪高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

关键词：流动相，色谱柱(固定相)，吸附，解吸

1 前言

高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。

1．1 高效液相色谱发展

1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手

段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

高效液相色谱原理

高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时,

经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形

式打印出来。

2 仪器简介

2.1 仪器组成

高效液相色谱仪高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

2.2 常见操作系统

2.2.1 （简单）等度系统

1234567

2.2.2 低压梯度系统

123456789 2.2.3 高压梯度系统

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3 操作步骤

1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。主要分为有机滤膜和无机滤膜，尺寸为0.45um

2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟，将流动相内的小气泡赶出，一方影响测样，及对仪器造成损伤。

3. 打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4. 进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先进行清洗。用无离子水直接冲洗吸滤头，后放入流动相中，确保滤头完全浸泡在流动相中，点击purge键进行脱气，待脱气完成后点击pump键。

6. 在进行测样前，需根据不同样对仪器的波长及流速进行设置，及对色谱柱和定量环进行更换。

7. 设计走样方法。点击file，选取se-lect users ａnd methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9. 关液相色谱仪时，先关计算机，再关液相色谱。

10. 填写登记本，由负责人签字。

4 常见问题及解决方法

4.1 HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

1. 样品量不足，解决办法为增加样品量

2. 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3. 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4. 检测器衰减太多。调整衰减即可。

5. 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

6. 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

7. 检测池中有气泡。解决办法为排气。

8. 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

9. 流动相流量不合适。调整流速即可。

10. 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

4.2 HPLC柱柱压过高

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1. 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2. 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

3. 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；

4. 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。

4.3 HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化

1. 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定

2. 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3. 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象

4. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定

5. 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

6．流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

4.4 基线噪声

4.4.1 不规则噪声

可能原因是系统不稳定或没达到化学平衡（使其平衡，若用离子对试剂，在首次使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡），流动相被污染（更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统），色谱柱被污染（为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱），检测器不稳定；

4.4.2 规则的噪声

可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当（如两种溶剂的互溶性问题），泵入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定；

4.5 峰形异常

1. 无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；

2. 色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题（瓶号错、进样体积不合适、进样错误、针头堵塞）；

3. 峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏），柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化；

4. 出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱

性能下降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏；

5. 前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱），柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效；

6. 脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题（如阀漏等），检测器时间常数设置错误；

7. 出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有稳定剂/稳定剂变化。

前景

.1 缩短分析时间,提高分离效率.应用先进的检测仪器和方法,对流动相.固定相进行调节或改变,采用梯度洗脱.柱切换技术有望解决这个问题.梯度洗脱的高效液相色谱法,能分析较宽极性范围的样品,较等度洗脱具有很大的优势,但对于成分更复杂.极性范围更宽的中药样品则有些力不从心.多柱高效液相色谱法又称多维高

效液相色谱法.除具有梯度洗脱一样的改变流动相浓度的优点外,还可以改变固定相种类.键合度.粒径.柱长.柱径等及流动相种类.浓度等.

.2 进一步向自动化.智能化及联用技术上发展.液相色谱与质谱联用在国外已成为测定低浓度生物药品中药

物及代谢物的首选方法,LC-MS-MS法测定血浆中HIV-1蛋白酶,准确高效,血浆中残留的内源性组份和其他药

物不干扰测定,既节省材料又节约时间.已经应用于体液.血浆.血清中的药物分析.中药复方注射液“清开灵”中的胆酸类物的分析采用液相色谱质谱质谱联用,效果理想.高效液相色谱-核磁共振联用在药物分析方面的

作用很不错.新近提出的智能多柱高效液相色谱系统利用切换技术的模块式分离性能,把样品分块的切换进不同性质的色谱柱,再用合适的流动相洗脱.全过程采用智能化控制.

5 结论

1. 进行实验操作时要认真，特别是称样和定容；

2. 时刻注意仪器状态，出现异常及时查找问题并寻找解决方法

致谢

感谢指导老师贺永强老师，谢谢对我的指导。感谢所有给过我只是的老师，是你们让我在这三年里给了我关心和帮助。

此外，我还要感谢在三年的学习生活中，所有给予我关心和帮助的老师、同学和朋友们。

参考文献

[1] 张红霞，崔林燕.活性炭对含酚废水吸附研究[J].科技情报开发与经济.2000，

9（6）：10-14

[2] 张术根.廉价矿物原料沸石分子筛合成研究[M].北京,化学工业出版

社.2004.1-25

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