双缩脲法测定蛋白质含量

实验二十蛋白质含量测定一一双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的

学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。

、实验原理

在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一CO-NH2)，或与此相似的基团［如一CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —)，可发生双缩脲反应，

且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定

范围为1?10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近, 敏度

以及干扰物质少。主要的缺点是灵差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、实验试剂和器材

［试剂］

1 ?双缩脲试剂：取CuSO4 ? 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加

2.5mol/L NaOH溶液300ml, KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。

2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10g/L的标

准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。

牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。

［器材］

1. 试管：15X 150mm试管7只；

2. 1ml，5ml 移液管；

3. 坐标纸;

4. 721分光光度计。

四、实验操作

取试管7支，编号，按下表操作:

混匀，37C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。1?5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。

［注意事项］

1 ?双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+

形成稳定的络合铜离子，以防止CuS04?5H20不稳定形成Cu（0H）2沉淀。酒石酸钾钠与CuS04 ? 5H20之比不低于3 : 1，加入KI作为抗氧化试剂。

2.双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。

3?本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。

4.黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。

［思考题］

1.双缩脲法测定蛋白质的原理是什么？其它还有什么方法测定蛋白质的含量？

2.请用双缩脲法，设计

一个测定蛋白质含量的定量方法（除标准曲线法外）。