最新微生物工程

微生物工程

一.名词解释

微生物工程：指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。拮抗作用：当多种物质联合作用时，其中的一种物质会通过一定渠道降低另一种物质的作用（通常是有害作用），使机体维持平衡状态。例如当人体血糖含量较高时，胰岛素分泌增加，胰高血糖素分泌减少，两种激素桔抗作用使血糖的含量降低。当血糖含量较低时，胰岛素分泌减少，胰高血糖素分泌增加，结果是使血糖的含量升高。

生物测定：利用某些生物对某些物质(如维生素、氨基酸)的特殊需要，或对某些物质(如激素、抗生素、药物等)的特殊反应来定性、定量测定这些物质的方法。载体：可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。

质粒：细胞中独立于染色体之外，能够独立复制的共价闭合环状DNA.

菌落原位杂交：是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与放射性同位素标记过的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。效价：抗生素的计量单位，是抗生素等生物制品有效成分含量高低的指标，可以通过仪器的方法测得。

复制起始位点：指在DNA转录时RNA聚合酶与之结合，起始转录的特定核苷酸序列，决定转录起始位点和转录频率。

BOD（生物需氧量）：通常表示水中有机物等需氧污染物质含量的一个综合指示。水中有机物由于微生物的生化作用进行氧化分解，使之无机化或气体化时所消耗水中溶解氧的总数量。

半连续发酵：指在发酵过程的后期周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法。这种发酵可以重复多次。

半连续发酵semi-continuous fermentation：是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。

补充发酵：指在发酵过程中以一定的速率排出成熟的发酵液，同时以相同的速率加入新鲜培养基，使整个发酵过程基本维持在稳定期的发酵方法。抗生素：是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。

下游处理：特指生物工程产品生产程序中的后期加工。指的是生物产品特别是发酵液的分离、纯化、加工、剂型制备等，直至达到产品质量要求的整个处理过程。

二.简答题

1.基因工程在微生物工程的应用表现在哪些方面？每一方面举例1-2个说明。答：①生产药物疫苗中的引用：这类基因工程药物的生产是当前基因工程最重要的应用领域，发展迅速。例如：有抗肿瘤.抗病毒功能干扰素.白细胞等；用于生理调节的胰岛素和其他生长激素等。

②改造传统工业发酵菌种：例如生产抗生素.氨基酸.有机酸.酶制剂等，这类菌种基本上都要经过长期的诱变或重组育种，生产性能很难再大幅度的提高。要打破这一局面，必须使用基因工程的手段才能解决。目前在氨基酸.酶制剂等领域已有大量成功的例子。

③环境保护：在环境保护方面，利用基因工程可培育同时能分解多种有毒物质的遗传工程菌。如：1975年，有人把降解芳烃，萜烃和多环芳烃的质粒转移到能降解Pesudomonas.sp（一种假单胞菌）中，获得了能同时降解4种烃类的‘超级菌’，它能把原油2/3的烃分解掉。

2.作为基因工程载体系统，其载体需要具备哪些条件？

答：载体：外源DNA不易进入受体细胞，他需要与某种工具重组后才能导入宿主细胞，以进行克隆和保存或者表达外源DNA中的遗传信息。这种将外源DNA 携带进受体细胞的工具称为载体。理想的载体应具备以下几个条件：①能稳定复制，目的基因的插入基本不影响载体的复制能力；②应具有一个以上的单一限制酶位点，以便目的基因的插入；③具有某些容易检测的遗传标记，以便利用这些标记筛选克隆；④插入目的基因的幅度较宽；⑤分力量小，拷贝数高；⑥从生物防护角度考虑是安全的。

3.质粒构建的策略要考虑哪些方面。

答：（1）构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。为此，构建的质粒克隆载体必须含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori），最好是松弛型质粒的复制起始位点。

（2构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并且这样的克隆位点应尽可能多。

（3）构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。一个质粒克隆载体最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。当外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。

（4）构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能的小。由于质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质粒的转化效率高，大于15kb的质粒转化效率明显下降。质粒克隆载体DNA分子小，意味着可承载较大的外源DNA

片段。

（5）根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片段），构建成不同用途的质粒克隆载体。

4.目的基因的检测与鉴定要开展哪些方面着手？简述之。

答：①耐药性标志筛选择（插入失活法）：如果克隆载体携带耐药性标志基因，转化后只有含有耐药基因的转化子细菌才能在含有该抗生素的培养基上面形成菌落，这样可以将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA的外源基因插入基因内，标志基因失活。

②标志补救：如果克隆基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么久可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救。

③分子杂交法：这是利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。

④PCR筛选法：根据目的基因两端已知核苷酸序列设计合成一对引物，依据实验目的的与要求的不同，快速抽提宿主细胞质粒DNA或染色体DNA作为模板进行PCR扩增反应，将扩增反应产物进行凝胶电泳分析，若出现特异片段的扩增条带，即说明该克隆为阳性克隆。

⑤免疫学方法：如果克隆基因的蛋白产物已知的，可利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，因此属非直接选择法。

⑥DNA序列分析法：对DNA分子序列鉴定是验证外源基因是否正确的最确凿证据。

5.限制性核酸内切酶的类型有哪些？各有何主要特征。

答：限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型、第二型及第三型。

第一型限制酶：兼具限制切割和修饰两种功能，但是识别位点并非严格专一，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做为催化反应的辅因子，在讲解DNA时，伴有ATP的水解。

第二型限制酶：其限制-修复系统由一对酶（同一序列的限制酶和甲基化酶）组成，分子量较小，仅需要Mg2+做为辅因子，不需要ATP，识别位点专一，并在识别位点内讲单链切断。因此二型限制酶在基因工程应用广泛，通常说的限制酶就是Ⅱ型酶。

第三型限制酶：兼具限制切割和修饰两种功能，识别位点专一，但是切点不专一，往往不在识别位点内部，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做为催化反应的辅因子，在讲解DNA伴随ATP水解。

6.在基因工程中，以细菌转化为例，说明其转化的原理和技术？

答：在基因工程中经历了获取目的基因及其与载体连接后，接下来是重组DNA

分子导入受体细胞。重组DNA导入细菌细胞的方法包括：转到作用和转染与转导作用。以转化作用为例：转化是微生物细胞直接吸收外源DNA的过程。

①化学转化法：在分子克隆中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA 分子的敏感细胞才能用于转化，这是细胞称为感受态细胞。0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞呈球形（感受态）；经42℃短时间热冲击后，细胞可吸收外源DNA；在丰富培养基上生长数小时，球状细胞复原，并分裂增殖；在选择型平板上可选出转化子。

②电击转化法：除化学法转化细菌外，还可采用高压脉冲电击转化法。电击法不需要预先诱导细菌的感受态，只是依靠短暂的电击来促使DNA进入细菌。

7．在载体遗传标记检测中，简述显色筛选法的基本原理

答：显色筛选法的基本原理：

显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等

8.简述发酵工程的种子质量控制有哪些主要因素。

答：影响种子质量因素：

原材料质量原材料质量波动引起种子质量不稳定波动的主要原因无机离子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）

培养温度温度过低，菌种生长发育缓慢

温度过高会使菌丝过早自溶

湿度湿度低，孢子生长快湿度大孢子生长慢

通气与搅拌足够的通气量，以报纸那个菌种代谢的正常，提高种子的质量搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶容易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。丝状微生物不宜剧烈搅拌。斜面冷藏时间对孢子的生产能力有较大影响，冷藏时间越长，生产能力下降越多。

培养基有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足的氮源和生长因子，无机氮源比例大；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收用的碳源和氮源；应考虑与发酵培养基的主要成分相近。

pH 原则是获得最大比生长速率和适当的菌量；培养最后一级种子的培养基的pH 应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。

影响种子质量的因素有哪些：1.培养基 2.培养条件3.接种量 4.孢子的质量

保证种子质量措施：1.菌种稳定性检查2.无杂菌检查

9、种子扩大培养的目的与要求、一般步骤。

答：目的：首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。

要求：对于种子应当具备以下要求：

总量及浓度能满足要求。生理状况稳定，个体与群体区隔明显。

活力强，移种发酵后，能够迅速生长。无杂菌污染。

种子扩培的一般过程是：

斜面菌种→ 一级种子培养（摇瓶）→二级种子培养(种子罐) → 发酵

14简述总大肠杆菌检测主要操作步骤

答：3.1 检样稀释

3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。

3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。

3.1.4 根据要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。

3.2 乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

3.3 分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

3.4 证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴

性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

3.5 报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

三.论述题

1.微生物基因工程菌构建的基本原理与过程

答：基本原理：①DNA是遗传物质；②DNA双螺旋结构；③中心法则和遗传密码；④基因是可以切割和转移的。

技术原理：①提供外源基因的剂量；②筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件；

③修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件；④基因工程菌的增殖及稳定生产。过程：①目的基因的获得；②DNA与载体体外连接；③导入受体细胞；④筛选、鉴定重组子；⑤目的基因的表达、检测。

4、发酵过程泡沫产生的原因有哪些？试述泡沫的控制途径。

答：1、通气搅拌的强烈程度通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。

2、培养基配比与原料组成培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。

3、菌种、种子质量和接种量

菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量

4、灭菌质量

培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。

5、细胞破碎与沉淀技术有哪些？试述超声波破碎原理。

答：机械法：高压匀浆破碎法，振荡珠击破碎法，高速搅拌珠研磨破碎法，超声波破碎法。

非机械法：渗透压冲击破碎法，冻融破碎法，酶溶破碎法，化学破碎法，去垢剂破碎法。

超声波破碎原理：将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小

炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。

6. 比较分批发酵、连续发酵和补料分批发酵的优缺点。

答：分批发酵:优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌。

连续发酵：优点是：①设备的体积可以减小；②操作时间短，总的操作管理方便，便于自动化控制；③产物稳定，人力物力节省，生产费用低。

缺点是：①对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高；②营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低；③杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。

补料分批发酵：优点：①可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。当代谢产物收率或其生产速率明显地受某种底物组分浓度影响（如用醋酸、甲醇、苯酚等作为发酵基组分而存在底物浓度的抑制）时，采用补料分批技术比分批发酵有利；②可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；③菌种的变异及杂菌污染问题易控制；④便于自动化控制。