良好的微生物实验室操作规范

良好的微生物实验室操作规范

简介

在微生物实验室中，良好的实验室操作规范是基于很多原则，包括以下活动：无菌技术、培养基的控制、菌种的制备、仪器设备的管理、细致的记录和数据的评估、人员的培训。众所周知，微生物测定数据的可变性、可靠性和重现性是基于公认方法的使用和坚持良好的实验室操作规范。

微生物菌种的维护

生物样本是最灵敏(d e li c a te)的,因为他们生存能力和特性是依赖于适当的处理和贮存。菌种的处理和贮存的标准是使用者的实验室制定的，采用减少污染的机会和减少生长特性变更。小心一致的处理贮存用菌种是微生物测试结果一致性的重要因素。按药典方法方法使用的菌种应该取自国家菌种保藏中心。可以包括冷冻的、冻干的、斜面培养的或是马上使用的形式。在质量控制测试使用前应进行菌种纯度的确定和菌种的鉴别。马上使用的菌种要求确定纯度、鉴别、接种体大小。鉴定的确认，对通常用的实验室菌种，理想的是进行基因水平的分析（如：使用合适的经过验证的探针进行D NA指纹,RNA基因排序,P C R光电导继电器）

菌种的制备和复壮应该参照供应商的说明书或采用己验证批准的方法。种子批技术被推荐用于贮备用菌种的保存。

从国家菌种保藏中心得到的初始菌种在合适的培养基被复壮、培养。部分的贮备菌种（第一次接种或是传代）是悬浮在抗冷冻培养基中，分装至小瓶中，在零下30°或更低的温度下冷冻，直到使用。如果冷冻在零下70°，或是冻干形式，菌种可以持续的保存。这些冷冻的贮存菌种可以每月或每周接种用作工作菌种。一旦打开，制备了工作悬浮液，不能再冷冻。不能用的部分应该丢弃，以减少繁殖能力损失带来的风险和贮存污染带来的风险。

工作用菌种的接种量应该记录，以防止过量接种增加表型变种。一代的定义是从具有繁殖能力的菌种接种微生物到一新鲜制备的具有促微生物生长能力和培养基中。任何形式的接种都被当做是一次转移传代。

实验室仪器的维护

多数的仪器（培养箱、水浴、灭菌锅）必须遵从标准验证程序包括安装确认、操作确认和性能确认。另外还要求有定期的校验（通常每年一次）。新的设备，实验室关键的，应该根据QC U批准的方案进行确认。

用于微生物实验室仪器（如：p H计和分光光度计）应按规定的进度表进行定期的校验和测试，以保证其性能。校验的频率和性能的确认是基于仪器的型号的不同和能产生实验室数据的设备的重要程度的不同。

实验室的布局和操作

实验室的布局和设计应考虑良好的微生物操作和安全。本质是最大程度的减少微生物菌种的交叉污染，微生物样本的处理环境也是重要，因为环境也能引起也污染的可能。

一般情况下，实验室应分成洁净区、无菌区和阳性室。如果可能，处理和培养灭菌产品的周围的环境区域应与阳性区完全分离。但是要将阳性和洁净区完全分开是不可能的，那么有必要采取隔离和无菌操作来减少可能的意外污染。这些隔离包括：防护衣、清洁、消毒程序和仅用于洁净无菌的生物安全柜。对于活的菌种引起的溢出和灾祸的程序应放在现场，所有相关技术人员进行上述方法的培训。

部分样品会出现微生物的生长，要求进一步分析来确定污染源。当发现有菌生长，样品应从洁净区立即转入阳性区。接种，着色、菌种鉴定或其它的调查操作应在实验室的阳性室操作。如果可能，发现有菌落生长的样品在实验室的洁净区是不能被打开的。小心隔离污染的样品和原料将减少假阳性结果。

正在进行取样操作活动的人员不能进入阳性室或在阳性室操作处理除非特别小心，包括穿防护服和手套，退出后仔细清净手。理想状态，受权人员进行样品取样操作时，特别是无菌过程的，不能在阳性操作室附近工作。同样，所有微生物样品都应采用无菌取样技术，包括非无菌样品的取样。如果可能，在规定的完全无菌的条件的取样区域进行操作。

要重点考虑的是样品的污染，它能导致假阳性的出现，除非在过程中特别注意无菌操作。取样间应设计好，这要原料和辅料的取样就可以在受控条件下进行，包括无菌衣和无菌取样设备。对于公用系统的取样，如水系统，在完全无菌的条件下是不太可能的；然而，当样品未采用无菌技术取样时应有记录，其可靠性不可避免的下降。

环境监测的取样方法要求对取样的设备（负载或未负载）进行最小化的无菌处理。如果可能，在对取样环境进行取样时，取样的设备应同时配备培养基，。

实验室中所有的测试，对关键的测试操作，如：最终剂型的无菌测试，散装产品，生物产品用菌种培养，或是生物产品用细胞培养都应在受控的条件下进行，隔离技术也是可以采用的，无菌的微生物测试。己在显示，隔离技术比人为的洁净区域具有更低的环境污染水平，因此，更能减少假阳性结果的产生。隔离系统的验证是重要的，既能保证环境的完整又能防止假阴性结果的产生，假阴性的结果是由化学消毒物质带入。

实验室记录的维护

合适的数据记录和研究对成功的微生物实验室是重要的。最重要的原则是按照S OP规定操作，S OP应是书面化的，并能反映测试的实际操作是如何进行的，实验室笔记本应能提供所有详细的记录，并保证记录的完整。实验室书写至少应包括以下内容：

日期；

测试物料

微生物测试人员名称

操作程序的号码

记录测试的结果

偏差

参数的记录（使用的设备，使用微生物菌种，培养基的批号）

管理员，第二个复核人签名

每一台关键仪器的使用都应在台帐上记录，所有都应根据S OP的要求记录在校正进度表和维护记录上。日志和其它记录形式对实验室记录本起到支持和帮助。设备的温度（水浴，培养箱，灭菌锅）应有记录并可以追踪。

己签发的S OP及其版本应有清楚的记录。数据的改变应用单钱划去并签上日期和缩写。初始的数据不应抹去或复盖。

测试结果应包括初始记数，允许复核者根据最终结果重新计算。数据的分析方法在S OP中应详细描述。

所有的实验室记录应存档避免遗失，现场中应有正式的记录保存和查阅程序。

检验结果的解释

微生物试验结果难以解释，因为下列原因：

微生物是普遍存在于自然界中的，又存在于通常的环境污染，由人类支配的很多类型的特殊的有机物。

实验室分析人员在样品分析和操作中可能引入微生物污染。

微生物可能不是均匀的分布在样品和环境中。

微生物的分析结果存在相当大的可变性。

因此，从预期结果中获得的微小的不同是没有多大意义的。

因为微生物分析的这些特性，实验分析应非常小心以避免外来的污染，正如本章前面讨论的。同样重要的，从主要微生物观察考虑，结果必须要解释。不仅包括假定污染的种类，而且包括药物成分、辅料或测试环境中存在的有机物。另外，其微生物的生长特性也应该考虑。

当出现的结果与药典正文或其它建立的质量标准不一致时，就应该进行调查。没有满足标准要求的微生物污染，通常有两个明显的原因：可能是实验室的错误或是实验环境产生无效的结果，也可能是产品有一定污染或其它形式的污染使得超出规定的标准或限度。另外一种情况，实验室操作，在多数情况下，应立即通报。

应该对围绕结果的所有情况进行全面的评估。所有实验条件和因应充分考虑，包括数据的漂移，与建立的限度和标准比较。重要的是根据结果的可变性知道观察的统计意义。

实验室环境，对现场取样的保护装置，测试条件下物料的历史数据，物料的种类，特别注意物料中微生物的存活和繁殖在调查中应被考虑。另外，与实验员进行讨论，分析中的实际操作可以得到有价值的信息。来决定结果的可靠性和决定采取和措施。如果可以确定得到不一致结果的明确原因，那么应该采取纠正措施，并记录问题所在。跟踪正式批准和执行的纠正措施，并进行仔细的检查。

如果分析结果是无效的，基于一个可指出的错误，必须记录。实验室应

该有证实测试（再测试）的S OP规定，如果必要，再取样。关于再取样，法规和药典没有给出分析结果调查的操作