8、细胞转染(脂质体介导法)
细胞转染（脂质体介导法）
细胞转染可以：（1）真核细胞可以掺入外源DNA而获得新的遗传标志；（2）应用于转基因动植物；（3）应用于生物制药、基因治疗、RNA干扰。
实验材料：293T细胞、MyoD表达质粒、EGFP表达质粒
试剂、试剂盒：DMEM培养基、青霉素、FCS、PBS、EDTA、转染试剂、链霉素、小牛血清仪器、耗材：微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、培养皿、转染管、离心管、观察用倒置显微镜、荧光显微镜、CCD
其他：
研究进展
1. 转染技术
国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效转染试剂率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。
2. 转染效率
线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。
GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。
二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。
本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。
三、实验材料与器材
1、材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素（双抗）
FCS（小牛血清）
PBS（磷酸盐缓冲溶液）
胰酶/EDTA消化液
转染试剂（TransFast）
2、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头
酒精灯
废液缸
血球计数板
涡旋振荡器
恒温水浴箱
台式离心机
35mm培养皿
转染管
15ml离心管
观察用倒置显微镜
荧光显微镜和CCD
四、实验步骤
1、细胞传代
（1）试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
（2）弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
（3）用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO2 ）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
（4）加入1ml的含血清培养基终止反应。
（5）用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
（6）将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
（7）用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
（8）将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。（9）将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
2、细胞转染
（1）转染试剂的准备
A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在-20℃保存，使用前还需震荡，。
（2）选择合适的混合比例（1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
（3）将混合液在室温放置10-15分钟。
（4）吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
（5）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
（6）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
3、第二次细胞传代
（1）在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
（2）再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。
（3）在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
（4）转染条件优化可以参考TransFast的使用说明书。
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(亲手整理)
Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂 产品描述 Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice ）运输。产品4oC 保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA （μg ）: Hieff Trans TM （μl ）比值在1：0.5-1：5。 操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一） 【注】：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。 贴壁细胞：转染前一天（20-24小时），胰酶消化细胞并计数，细胞铺板（不含抗生素），使其在转染时密度为90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate ）。 c c l 整 理
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次 摘要: 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品,上生物帮 >> >> 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高 5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。 用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
脂质体制备方法
微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂体(又称脂质体) 微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer) 所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。 微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，
Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书
Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
脂质体转染实验原理与操作步骤总
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection
贴壁细胞的脂质体转染
一、实验材料 1、宿主细胞CHO（贴壁细胞） 2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！ 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是 3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min） 3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul） 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。 三、个人经验： 我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。 1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
脂质体转染
二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。 (4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 (5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]： (1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。 (2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo 质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。 (3) (3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。 (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时， (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。 (6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 (7) 3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS 的DMEM，37℃培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法 细菌粘附侵入实验 1、将细胞按1.0×10? cells/ml的量接种于24孔板中，每孔1ml，置于37°的培养箱中培养3天直至细胞均勾铺满孔底，长满单层的细胞显微镜下可见细胞之间接触紧密，形成该细胞所特有的紧密连接。 2、实验前一天取E.coli菌株接种于含有相应抗生素的BHI培养基中，于37°培养箱中静置培养过夜。 3、取长满单层的HBMEC细胞，用预热的WXM培养基轻柔地将细胞洗3遍，以去除培养基中的双抗。 4、然后每孔中加入400μL培养基，于37°温箱中 5、静置期间取过夜培养的细菌，3000r/min离心5min收集菌体。弃去培养基，将菌体沉淀重悬于1mlXM培养基中。并用培养基调整菌液的OD???至0.2约为1.0×10? CFU/ml。 6、分别向24孔板中每孔细胞加入100μL细菌悬液（10?CFU,MOI约为100，使总体积达到500μL。轻轻晃动24孔板使细菌均勾分散。（若为侵入实验，则将24孔板于水平离心机中,1000r/min离心5min促使细菌与细胞的接触；若为粘附实验，则该步离心省略。
脂质体介导IL22
脂质体介导I L22、TNF2α联合基因转导体内抗肝细胞癌的实验研究① 李东复 申吉子② 闫 峻② 邵国光 (吉林大学第二医院消化内科,长春130041) 周晓琦 杨春荣 (吉林大学第二医院电诊科,长春130041) 中国图书分类号 R73517 R73013 文献标识码 A 文章编号 10002484X(2003)0720483204 [摘 要] 目的:探讨脂质体介导I L22cDNA、T NF2αcDNA联合基因转导体内抗肿瘤效果。方法:建立裸鼠肝癌动物模型,在荷瘤部位将脂质体包裹的I L22cDNA和T NF2αcDNA直接注入瘤体中,观察肿瘤大小变化,并检测此2种基因在肿瘤组织中的表达情况。结果:I L22基因和T NF2α基因联合治疗组肿瘤生长明显受到抑制,抗肿瘤效果显著优于单纯治疗组和对照组。结论:I L22和T NF2α基因联合治疗组对肿瘤生长抑制效果明显优于单纯治疗组与对照组,荷瘤鼠生存期明显延长(P<0105)。 [关键词] 肝细胞癌;脂质体;细胞因子基因;基因转导 Combined I L22cDNA with TNF2αcDNA genetherapy for hepatocellular carcinoma LI Dong2Fu,SHEN Ji2Zi,Y AN Jun et al.Second Hospital,Jilin Univer sity,Changchun130041,China [Abstract] Objective:T o explore antitum or effects of combined interleukin22(I L22)gene and tum or necrosis factor(T NF2α)gene therapy in nude mice m odel with hepatocellular carcinoma.Methods:Nude mice m odel with hepatocellualr carcinoma was established with BelH7402 cell line.Plasmid vector was used to trans fect BelH7402and nude mice m odel with the gene for human I L22or T NF2αalone or in combination by lipofectamine reagent and tum or size in nude mice m odel with BelH7402carcinoma was measured before and after treatment to evaluate the response of the different treatment and control groups.R esults:Tum or and BelH7402trans fected with I L22or T NF2αgene by lipos ome mediated were success ful.G rowth rates of BelH7402trans fected with I L22or T NF2αgene were not significantly changed,growth rate of tum or in nude mice m odel was significantly inhibited in combined I L22and T NF2αgenetherapy group as compared with the other groups(P<0105).Conclu2 sion:C ombination of the tw o genes in genetherapy may be additive of synergistic in antitum or effect. [K ey w ords] Hepatocellular carcinoma;Cellular factor gene;G ene trans fection;G enetherapy 肝癌基因治疗的方法已发展有免疫基因疗法、抑癌基因疗法、反义基因疗法和自杀基因疗法。近年来又出现前药转换基因疗法、多药耐药基因疗法和反基因策略等。但是这一新的治疗手段在技术上还存在许多问题,如缺乏高效和定向的载体系统;病毒载体应用中可能产生有传染性的野生型病毒,有可能随机整合于宿主基因,从而使癌基因活化或抑癌基因失活;基因进入人体后的可控性尚难定论,某些基因的过度表达可能会产生毒副作用;所以至今为止体内型转基因治疗尚不能在临床上应用。因此,当前重要的是发展经济有效、安全易行的基因运载体系,使目的基因能达到肿瘤部位,并且表达的产物能受机体控制,使基因治疗能够按照要求用于临床,成为肝脏肿瘤的一种有效治疗方法。本文脂质体介导I L22cDNA、T NF2αcDNA联合基因转导体内抗肝细胞癌的实验研究,旨在探讨联合基因 ①吉林省科技厅基金资助项目 ②研究生 作者简介:李东复(1956年-),男,主任医师,教授,主要从事肝病免疫学研究。 转导持续基因产物表达的抗肿瘤效应,为肝癌基因治疗的临床应用提供理论与实验依据。 1 材料与方法 111 主要材料与试剂 BelH7402人肝癌细胞,本校免疫学教研究室冻存;脂质体Lipofectamine由联星生物工程试剂公司提供;I L22、T NF2α检测试剂盒由深圳晶美公司提供;质粒型真核表达载体BMG Neo、pcDNA3由上海第二军医大学免疫学教研室、本院中心实验室提供;人I L22cDNA、人T NF2αcDNA由外周血制备;裸小鼠,6～8周龄,由北京大学医学部实验动物中心提供。 112 体外基因转导与表达细胞培养 亲本肝癌细胞BelH7402及I L22、T NF2α基因转导细胞株均培养于含10%小牛血清I M DM培养基中待用。 113 I L22cDNA、T NF2αcDNA真核表达载体构建 质粒提取、酶切,连接按《分子克隆》有关章节进行。人I L22cDNA插入到BMG Neo的XhoI位点,人T NF2αcDNA插入到pcDNA3HindⅢ与BamHI位点,提取BMG Neo2hI L22,pcDNA3hT NF酶切后,018%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
脂质体转染原理步骤
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。 上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。 293T细胞 MyoD表达质粒和EGFP表达质粒 DMEM培养基 链霉素/青霉素（双抗）
PBS（磷酸盐缓冲溶液） 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 35mm培养皿 转染管 细胞传代 (2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 (5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 细胞转染 1）转染试剂的准备 2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂， 再次震荡。 7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 第二次细胞传代 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度
脂质体转染的几个实验方法
脂质体转染的几个实验方法 关键词：脂质体转染2013-08-28 14:32 来源：互联网点击次数：731 实验原理 脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 实验步骤 1. 操作步骤(方法一)： 1) 取6孔培养板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5个细胞的培养基，37℃、18% CO 2培养基40%-60%汇合时。 2) 转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。 A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。 B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。 轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 3) 转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。 4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。 5) 其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。 6) 注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2. 快速脂质体转染法操作步骤(方法二)： 1) 将细胞以5 x 105个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。 2) 在试管中配制DNA-脂质体复合物。 a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。 b. 旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。 c. 室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。 3) 弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。 4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。 5) 吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培养24-48h。 6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
OPTI MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法 日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次 相关专题 ?MEM细胞培养基 无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。 贴壁细胞的脂质体转染 一、实验材料 1、宿主细胞CHO(贴壁细胞) 2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司) 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO) 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所
以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧! 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul无血清培养基 +10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min) 3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积 250ul) 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法 （一）脂质体转染 一、实验试剂及器材 Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM?减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。 二、实验步骤 1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染； 2. 使用Opti-MEM?减血清培养基稀释Lipofectamine? 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM?培养基为125 μL× 2，Lipofectamine? 3000为 3.75和7.5 μL）； 3. 在每管已稀释的Lipofectamine? 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）； 4. 室温孵育5分钟； 5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中； 6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。 三、注意事项 1. 在无血清培养基（如Opti-MEM?减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine? 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）； 2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；
3. Lipofectamine? 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine? 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染； 4. Lipofectamine? 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。 附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：