抗体的选择和留存指南
抗体选择指南
抗体保存指南
抗体说明书样本
一 抗体选择指南
:检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：
1. 分析或应用的类型
2.
样本蛋白的结构性质
3. 样本的种属
4. 抗体宿主的种类
5.
抗体的标记和检测
1分析试验的应用类型 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
2 样本蛋白的结构性质 了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑
(1)..待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS 流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择
含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。
(2)样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识
别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书
上应用部分标示出来
3 样本的物种 应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST 来进行不同物种
蛋白同源性比对。
4 一抗宿主物种的选择 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG 。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG 的细胞裂解物样本的western blotting 检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培
、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标等，要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行
高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
荧光素
颜色激发波发射波长分子量Aminomethylcoumarin (AMCA)
Blue 353440410Fluorescein (FITC)Green 495528390Fluorescein (DTAF)Green 495528530Rhodamine (TRITC)
Red 550570444Texas Redtm
Red
596620625Cy2tm Green 489505897Cy3tm Orange 552565949Cy3.5tm Scarlet 5815961,286Cy5tm Far-Red 650667975Cy5.5tm Near Infra-Red 6787031,312Cy7tm
Near Infra-Red
7437671,001R-Phycoerythrin (RPE)Red 488575240,000B-Phycoerythrin (BPE)
Red 545575240,000C-Phycocyanin Red 618640110,000R-Phycocyanin
Red
615
620
110,000
二抗连接标记酶HRP and AP 与其底物产生有颜色的沉淀物
辣根过氧化物酶Horseradish peroxidase (HRP)碱性磷酸酶
Alkaline phosphatase (AP)
AEC (red)Fast red (pink)DAB (brown)
INT (yellow / brown) NBT (brown / purple) New Fuchsin (red) TNBT (purple)
Vega red (pink)
吊顶层配置不规范高中资料试卷问题卷要求，对电气设备进行空载与带负荷技术是指机组在进行继电保护高中资料
?对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20度 or -80度对绝大多数抗体来说，保存在-20度是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80度 会有更多的好处，
?
分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul 每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4度，避免再冻起来！ 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4度 尽量不要超过1天。
绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上
3. 大部分抗体收到后4度短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。
如果抗体很快（1-2周）会使用，推荐在4度保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则最好是在-20度 or -80度。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！
但是，腹水形式的产品请在收到后立即冻起来！因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4度保存会导致抗体的降解！
4.
大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4度的条件下来完成的。
4度运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程）。所以运输过程中绝对避免干冰运输！
特殊抗体的保存条件：
6.酶联抗体：永远保存在4度，避免冻起来。否则会导致酶活性的下降或者丧失
7.
偶联抗体：所有偶联抗体都是在棕色管中或使用锡箔纸避光保存。尤其是荧光抗体，对光极为敏感，因此在所有
的实验阶段也是要避光操作的！
8.IgG3的同型对照：永远保存在4度，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体
、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标等，要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行
高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
关于加入甘油保存：有些人会加50%的甘油到抗体中来避免反复冻融，甘油在-20度 会降低冰点。这对很多抗体可能是可行
的。但是abcam 仅对非常小的一部分抗体检测过其在这种条件下的稳定性；而abcam 只对按照推荐条件保存的抗体提供质量
保证！加入甘油的溶液不建议在-80度保存，因为这已经超过了甘油的冰点。如果您要加入甘油来保存抗体的话，请谨慎注意
无菌操作，避免污染！
关于蛋白保护剂：
蛋白在高浓度时更不容易降解（1 mg/ml 或者更高），这就是为什么在抗体中加入BSA 之类作为稳定剂的原因了；另一方面，
加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，则不能加入蛋白稳定剂，因为这些稳
定剂会和抗体一起竞争结合标记物。
关于叠氮化钠（sodium azide ）的使用：
为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中（终浓度0.02% (w/v)）。Abcam 的很多抗体已经含有了0.02％-0.05%的
叠氮化钠，在说明书的“Storage buffer”中有标明的。
在下述情况中不能使用叠氮化钠：
?
如果抗体用于染色或处理活细胞，用于体内研究：
叠氮化钠在抵抗微生物的同时，对其它大部分有机物也是有毒的，因为它阻断了线粒体的cytochrome electron transport
system.
?
要偶联带有氨基基团的抗体：
叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，
但是浓度只能是0.01％。对于需要偶联的抗体，thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂！
注：叠氮化钠的去除方式：
可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除！IgG 的分子量是150kDa (IgM 是~ 600kDa); 叠氮化钠的分子量只有65Da 。使用cut off
14kDa 的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除
、管路敷通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层，要求技术交底。管线敷设技术中包解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技，当不同电压回路交叉时，应采用金槽内强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行
高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设，编写重要设备高中资料试卷试验方启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资程中高中资料试卷技术问题，作为调试料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况
，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
、电气设备调试高中资料试卷电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自资料试卷保护装置动作，并且拒绝动卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护护装置高中资料试卷调试技术是指发障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
抗体说明书样本
Product Name NFkB p105 / p50 antibody [E381] (注:E381是指克隆号)
Product type Primary antibodies
Description Rabbit monoclonal [E381] to NFkB p105 / p50
Immunogen A synthetic peptide corresponding to residues in the nuclear factor NFkB p50 subunit.
Reacts with Hu, Ms, Rat (注:人小鼠大鼠)
Specificity This antibody will detect both forms: p50 and p105.
Tested applications Flow Cyt, ICC, IHC-P, WB(流式细胞分析免疫细胞化学免疫组织化学-石蜡包埋western
bloting)
Application notes Recommended dilutions
Flow Cyt: 1/30.
ICC: 1/250 - 1/500.
IHC-P: 1/250 - 1/500.
WB: 1/5000. Detects bands of approximately 50 and 105 kDa (predicted molecular
weight: 50 and 105 kDa).
Is unsuitable for IP.
Not yet tested in other applications.
Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.
Positive control HeLa cell lysate; human prostate carcinoma
Cellular localization Nuclear, but also found in the cytoplasm in an inactive form complexed to an inhibitor (I
kappa B).
Research areas Cancer>>Signal transduction>>Nuclear signaling>>NFkB pathway
Chromatin>>Transcription>>Transcription Factors
Nuclear Signaling>>Nuclear Signaling Pathways>>NFkB pathway
Nuclear Signaling>>Transcription>>Other factors
Cell Biology>>Signal Transduction>>Nuclear Signaling>>NFkB Pathway
Immunology>>Innate Immunity>>Macrophage / Inflamm.
Cell Biology>>Apoptosis>>Intracellular>>NFkB>>p50
Relevance NFkB is a transcription regulator that is activated by various intra and extra cellular
stimuli such as cytokines, oxidant free radicals, ultraviolet irradiation, and bacterial or
viral products. NFkB is a family of transcription factors that consists of homo and
heterodimers of NFkB1/p50 and RelA/p65 subunits, and controls a variety of cellular
events including development and immune responses. All members share a conserved
amino terminus domain that includes dimerization, nuclear localization, and DNA binding
regions, and a carboxy terminal transactivation domain. Serines 529 and 536 in the
transactivation domain of RelA/p65 are phosphorylated in response to several stimuli
including phorbol ester, IL1 alpha and TNF alpha as mediated by IkB kinase and p38
MAPK. Serine 529 is located in a negatively charged region (amino acids 422-540) that
is phosphorylated in response to phorbol myristate acetate plus calcium ionophore activation. Phosphorylation of serines 529 and 536 is critical for RelA/p65 transcriptional activity. Activated NFkB translocates into the nucleus and stimulates the expression of genes involved in a wide variety of biological functions. Inappropriate activation of NFkB has been associated with a number of inflammatory diseases while persistent inhibition of NFkB leads to inappropriate immune cell development or delayed cell growth.Alternative names for NFkB p105 / p50 antibody [E381] (ab32360)
Database links
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Entrez Gene
4790 (Human)
18033 (Mouse)81736 (Rat)
GeneCard GC04P103880 (Human)Omim
164011 (Human)
SwissProt P19838 (Human)
P25799 (Mouse)Q63369 (Rat)
Unigene 431926 (Human)Raised in Rabbit Clonality Monoclonal Clone number E381Isotype IgG
Purity
Protein A purified
Storage buffer
Preservative: 0.01% Sodium Azide
Constituents: 40% Glycerol, 0.05% BSA, 0.15M Sodium chloride, 50mM Tris glycine. pH 7.4
Material safety datasheets (MSDS) for this product:
Form
Liquid
Storage instructions
Shipped at 4°C. Upon delivery aliquot and store at -20°C. Avoid freeze / thaw cycles.
路习题到位。在管路敷设过程中，要；对设备进行调整使其在正常工况下与最大限度内来确保机组高中资料试卷安
经典——教你如何选择流式抗体
经典——教你如何选择流式抗体 一、如何搭配流式抗体荧光标记 流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪 的通道越多，那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多. A、如何根据流式细胞仪搭配流式抗体 流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的，所以首先需要注意两点： 流式细胞仪有哪些激光。 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的. B、搭配荧光素原则 搭配流式荧光素有2个原则：每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度。 C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？ 如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。 二、同型对照（Isotypy Control）编辑本段回目录 1、为什么要用同型对照？ 同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染 色。同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前，染色方式如下： 样本管：一抗＋样本 同型对照管：同型对照＋样本 2、如何选择同型对照？ 一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56 APC标记的抗体，货号是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,κ，货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体，货号是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ，货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下： 样本管：纯化的CDw25＋PE标记的抗Mouse IgG1 ＋样本 同型对照管：纯化的同型对照＋PE标记的抗Mouse IgG1＋样本 如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类 别。比如，某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。 3、哪些人需要使用同型对照？ A 对流式不是非常熟悉的人。 B 做胞内流式人，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。
抗体纯化的方法有哪些
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法： 基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白； 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐； 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱； 5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度； 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa 基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体； 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节； 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂； 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液； 5.用PBS透析；
常见肿瘤病理诊断中免疫组化抗体选择
泌尿与男性生殖系统肿瘤 1.前列腺癌：CK、P63、34?E12、PSA、P504S(9AMAC)、AR 2.前列腺增生/腺瘤：CK、P63、34BE12、P504S 3.肾癌：CK、EMA、Inhibin、Melan-A、CK7、Vimentin、PAX2、CD10 4.肾母细胞瘤：WT-1、CK、P53、Ki-67 5.膀胱尿路上皮癌：CK7、CK20、P53、Ki-67、P63 6.精原细胞瘤：CK、PLAP、CD117、LCA、OCT3/4 淋巴造血系统肿瘤 7.胸腺肿瘤：CK、CD3、CD5、CD20、TdT、EBV* 8.霍奇金淋巴瘤：CD30、CD15、ALK-1、EMA、CD3、CD20、EBV*、PAX-5 9.非霍奇金淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、TdT、CD43 10.间变大细胞淋巴瘤：CD30、CD15、ALK-1、EMA、CD3、CD20、EBV* 11.弥漫性大B细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD30、Ki-67 12.小B细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD79α、CyclinD1、TdT 13.T细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD43、CD45RO、CD79α、TdT、TiA-1、Perforin 14.套细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD20、CD79α、CyclinD1、TdT、Bcl-2、Ki-67 15.T/NK细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD56、TiA-1、Perforin、粒酶B 16.淋巴上皮病变/癌：CK、EMA、S-100、Ki-67、P53、EBV*、P63、CD30、CD20 17.Burkitt淋巴瘤：CD3、CD20、CD79α、CD10、Bcl-2、Bcl-6、Ki-67、EBV*、TdT 18滤泡性淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD10、Bcl-2、Bcl-6、Ki67 19.脂膜炎样T细胞淋巴瘤:CD2、CD3、CD7、CD20、CD43、Perforin、TiA-1、EBV* 20.浆细胞瘤：CD3、CD20、CD38、CD138、CD79α、EMA、κ*、λ* 21.坏死性淋巴结炎：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD68、Mac387、CD163 22.粘膜相关淋巴瘤：CK、CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD43、CD79a、CyclinD1 23.血管免疫母细胞性淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD43、CD79α 24.组织细胞肉瘤：S100、CD10、CD21、CD35、CD68、Lysozyme、MPO、CD33、CD34、CD11c、CD14、CD45R O 25.朗格罕氏细胞增生症/肉瘤：S100、CD1α、CD68、CD35、HMB45、CK、EMA、Ki67、CD45 26.指状突树突细胞肉瘤/肿瘤：S100、CD1α、CD68、CD21、CD35、CD3、CD20、CD30、CK、EMA、Ki67、C D45 27.滤泡树突细胞肉瘤/肿瘤：CD21、CD35、S100、CD1α、CD68、CD3、CD23、EMA、VIM、MPO、CD34、CD7 9α、CK、HMB45 28.肥大细胞肿瘤：CD117、CD45、CD33、CD68、CD15、CD3、CD20 消化系统肿瘤 29.胃癌：CK7、CK20、Villin、CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、AB/PAS** 30.肠癌：CK7、CK20、Villin、CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、AB/PAS** 31.肝细胞癌：AFP、CD34、CEA、CK8/18、CK19、Ki-67、P53、HbsAg、Hepatocyte 32.肝胆管细胞癌：CK7、CK20、Villin、AFP、CD34、CEA、CK8/18、CK19、Ki-67、Hepatocyte、HbsAg 33.食道癌：P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、P63 34.胰腺癌：CEA、P53、Ki-67、CDX-2、GST-π、Villin、CK7、CK20、 35.胰岛细胞瘤：CD56、Syn、CgA、Ki-67、Insulin、CK8/18、CK19 39.肝炎病毒：HbsAg、HbcAg、HCV 涎腺肿瘤 37.涎腺粘液性囊腺癌：CK、P63、SMA、Vimentin、Myosin-heavy chain
抗体选择题
1. 关于轻链的叙述，哪项是错误的 (A) A、Ig根据V L抗原特异性不同分为两个型 B、Ig的轻链均相同 C、轻链有两型 D、同一个天然Ig分子上两条轻链的型总是相同的 E、人血清中各类Ig所含κ链和λ链的比例约为2:1 2. 免疫球蛋白的结构是由 (D) A、二条相同的重链组成 B、二条多肽链组成 C、以J链连接的一条轻链和一条重链组成 D、二硫键连接的二条相同重链和二条相同轻链组成 E、二硫键连接的一条重链和一条轻连组成 3.将免疫球蛋白分为两型的根据是 (A) A、轻连恒定区抗原性不同 B、重链恒定区抗原性不同 C、重链可变区抗原性不同 D、轻链可变区抗原性不同 E、超（高）变区抗原性不同 4. 抗体与抗原决定簇互补结合的部位是 (C) A、V H B、C L、C H C、V H、V L中的CDR（HVR） D、V L中的CDR E、Fc段 5. 抗原和抗体特异结合的部位在 (B) A、V H B、V L和V H C、C L和C H D、Fc段 E、C H 6. IgG与FcR结合的功能区是 (D) A、C H2 B、C H1 C、铰链区 D、C H3 E、V H、V L 7. IgG (C) A、在胚胎期即可合成 B、有CH4功能区 C、能通过胎盘 D、B细胞表面抗原识别受体属此类 E、天然血型抗体属此类 8 .铰链区位于 (A)
A、C H1与C H2之间 B、V H与C H1之间 C、C H2与C H3之间 D、C H3与C H4之间 E、V H与C H之间 9. 关于Ig分泌片的特性哪项是错误的? (E) A、以非共价键方式连接两个Ig分子单体 B、由上皮细胞合成和分泌 C、分泌片的功能是保护IgA及介导IgA的转运 D、分泌片与IgA的形成无密切关系 E、主要存在于血清中 10. 人类个体发育过程中，最早合成的免疫球蛋白是 (C) A、IgA B、IgG C、IgM D、IgD E、IgE 11. 免疫球蛋白产生的顺序是 (B) A、IgA-IgG-IgM B、IgM-IgG-IgA C、IgG-IgM-IgA D、IgM-IgA-IgG E、IgA-IgM-IgG 12 .与抗原结合后活化补体能力最强的Ig分子是 (D) A、IgD B、IgG C、IgA D、IgM E、IgE 13. IgG分子中与补体结合的部位存在于 (A) A、C H2 B、C H1 C、C H3 D、C H4 E、V H 14. 能激活补体又能与SPA结合的Ig是 (C) A、IgD B、IgA C、IgG D、IgM E、IgE 15. 合成分泌抗体的细胞是 (A) A、浆细胞
抗体工程重点总结
简答题 1.简述鼠源性单抗的改造原则及常见类型 a)改造原则：降低其免疫原性、尽量保持其亲合力 b)常见类型：人鼠嵌合抗体、CDR移植抗体、小分子抗体 2.噬菌体抗体库技术的主要流程及优点 a)噬菌体抗体库技术：借助噬菌体展示技术，将抗体V基因与噬菌体外壳蛋白基因 融合表达于噬菌体表面，从而构建噬菌体抗体库，然后通过筛选获得特异性抗体的 V区基因。 b)主要流程： i.扩增全套抗体基因 ii.构建合适的重组噬菌体表达载体 iii.转化大肠杆菌并保存 c)优点： i.省时省力 ii.筛选容量大 iii.直接得到抗体基因 iv.可制备人源抗体和其它难于制备的抗体 v.可原核表达 d)缺点： i.库容受转化效率限制：一般不超过1010 ii.一些抗体分子会抑制宿主菌生长 iii.具极高亲和力的抗体与抗原结合后，难以洗脱，造成丢失 3.简述基因工程抗体的各表达系统的优缺点 a)哺乳动物细胞表达系统： i.优点： ①. 具有完整的转录、翻译后加工及分泌机制，抗体能被准确子合成、加工和 分泌 ②. 具有完全糖基化功能和完善的重折叠机制，可表达形成良好活性的抗体分 子 ③. 可实现抗体的分泌表达 ④. 既可表达完整的抗体分子，也适合表达其它形式的小分子基因工程抗体 ii.缺点： ①. 构建周期长，操作繁琐 ②. 表达量相对低，成本较高 ③. 大规模生产受限 ④. 具潜在致癌性和病毒核酸的污染可能 iii.常用的宿主细胞 ①. 淋巴细胞：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO ②. 非淋巴细胞：常有的细胞有CHO、COS b)大肠杆菌表达系统： i.优点： ①. 遗传背景清楚 ②. 产量高：130—150mg／L
如何购买抗体
订抗体一定要提供至少以下五个方面的信息给你的供货商,在我们公司,这五个信息不全,是无法订货的,这也是为客户负责. - 1. Antigen,也就是抗原名称,最好是英文全称,许多客户只说简称,要知道不同的抗体其简称有可能会一样的.有中文最好也提供一下. - 2. Reactivity,即反应性,也就是实验用于什么特种,是人,大鼠还是小鼠等. - 3. Host,宿主,就是抗体来源,这个主要和二抗有关系,一抗必须要和二抗搭配,比如,二抗是羊抗小鼠,一抗就要选择小鼠来源的.不少客户常常是先有二抗,再买一抗,受限制得很,其实应该先订一抗,再买二抗,毕竟一抗贵,为了将就一个100元左右的二抗,而把几千元的一抗的订购弄得很复杂,真是不划算.所以,不要为了二抗伤脑筋.- 4. Conjugate,即缀合物或标记物,如是不是需要FITC标记,HRP标记等情况,也最好说明. - 5. Applications,就是应用. 你买这个抗体用于做什么实验,是IHC还是WB,这点一定要说,要知道,抗体开发出来,不是什么实验都能用或都会效果好,抗体公司说明上写着能做的实验是经过验证的,没有写的不是说一定不能做,也可能可以做,但没有验证,厂家不会乱说的,也是科学负责的态度.例如,你要是想做IHC-P,就是石蜡切处的免疫组化,如果买不到抗体明确说可以做,你要用就得冒风险,好在现在抗体厂家众多,一般都找得到了. - 1.该定制单抗还是多抗？ 首先应该考虑的就是定制的抗体是应用于什么实验，需要的量是多少？ 对于科研用户来说 1. 抗体常常应用于WesternBlotting、IP等实验中，对于抗体的特异性有一定的要求，但并不是特别的强调 2. 往往在研究很多新的蛋白时，并不确定新蛋白是否很重要，是否会是将来很长一段时间的研究重点，所以抗体用量也不大所以针对科研用户，在定制新的蛋白的抗体时，我们强烈建议首先制备多抗用于实验，当得到了理想的实验结果并需要长期的使用该抗体时再考虑制备单抗。当然，如果您对该抗体的特异性要求特别高（多抗的特异性已无法满足实验要求，比如应用于流式细胞术等）时，还是应该定制单抗
抗体保存知多少
抗体保存知多少 通常情况下，抗体经恰当保存和处理，大多数应能保持活性数月乃至数年。当然，不同类型抗体，其保存的方法也可能不一样，以下就抗体的保存，提供一些参考! 一、保存温度和条件 对于很多抗体而言，保存在-20℃是完全足够了，没有任何证据显示保存在-80℃会有更多的好处!分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的损伤，以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次，如有剩余，可将剩余物保存于4oC. 在收到抗体时，在10,000 ×g 下离心20 秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液，并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10 μl; 等份越小，储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。 在大多数情况下，收到抗体时在4oC 下保存一至两周，然后再冷冻进行长期保存是可接受的，但也许腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而应该尽快冻存。同样，遵照说明书上的建议是重要的。
大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在4℃的条件下来完成的。 对于特殊的抗体，如酶、荧光素等偶联抗体、IgG3同型抗体等抗体的保存有其注意事项： 1、偶联抗体酶偶联抗体不应冻存，而应保存于4oC. 冻融不仅影响抗体结合能力，还会降低酶活性。无论偶联至荧光染料、酶还是生物素，偶联抗体都应保存于深色试剂瓶中或用金属箔包裹. 暴露于光线中将损害偶联物的活性。特别是荧光偶联物易受到光漂白影响，在实验的所有阶段都应避光。 2、IgG3的同型对照保存在4℃，避免冻起来。因为如果出现冻融过程，该抗体非常容易形成多聚体 二、用叠氮化钠防止污染 为了防止微生物污染，可将叠氮化钠加入抗体制备品中达到0.02% (w/v). 的终浓度。但是有时不能使用叠氮化钠，有以下两中情形：
抗体选择指南 抗体保存指南 抗体说明书样本 - 物种选择较为重要
抗体选择指南 抗体保存指南 抗体说明书样本 一抗体选择指南 :检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素： 1. 分析或应用的类型 2. 样本蛋白的结构性质 3. 样本的种属 4. 抗体宿主的种类 5. 抗体的标记和检测 1分析试验的应用类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。 2 样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑 (1)..待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。 (2)样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来 3 样本的物种应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。 4 一抗宿主物种的选择一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的
WB检测抗体如何选择(下)
WB检测抗体如何选择 WB检测之二抗 二抗选择 二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。 二抗选择要考虑的问题有： ①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗 IgGF(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。 WB检测之内参抗体 Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。 WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。 内参使用方法 1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。 2.普通内参：当靶蛋白分子量与所选内参分子量相差不大时，可先对靶蛋白进行显色检测，然后用Strip缓冲液洗掉膜上抗体，重新对内参蛋白进行显色检测。当靶蛋白分子量与所选内参分子量相差较明显时，可对转膜预染，根据蛋白质分子量将膜剪为两部分并分开进行靶蛋白和内参蛋白的显色检测。 内参抗体选择 常用的蛋白内参有GAPDH和β-actin或β-tubulin，内参的选择原则是选择与靶蛋白分子量相差5KD以上的内参，对不同的样本则需要根据实际情况进行选择。 1.根据物种选择 哺乳动物来源的组织或细胞样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na+/K+-ATPase等。植物来源的样本常选择plant actin、Rubisco等。对于其他研究稀少的物种可参考报导的文献进行选择。以GAPDH为例，抗GAPDH单抗（ABGENT，clone 6C5）能够与非洲蟾蜍、猴、猪、羊、狗、猫、鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH反应，但不能与酵母GAPDH反应。 2.根据组织类型选择
关于博士德抗体和试剂的保存方法
试剂保存指南一、抗体的保存：抗体保存得当与否直接决定了抗体的活性和使用效果。如果抗 体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。 请按照说明书或者抗体标签上推荐的保存条件正确保存抗体！无论是保存还 是运输，绝对避免反复冻融抗体！ 1、收到抗体后请务必在1000-3000转离心1-2分钟后再打开管盖进行分装和保存！（由于运输过程中反复颠簸，管内微量抗体容易聚集在管盖处，一旦直接打开容易流失抗体。（请放心博士德抗体出厂时保证已装入足量） 2、对于Boster大部分抗体（纯化一抗），比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃冰箱。 ◇因为博士德的抗体（纯化一抗）出厂时抗体内已经加过防冻剂或抗体保护剂，即使在-20℃环境下也不会冻结成冰，反之，如果冻存过程中发现抗体能冻结成冰时请停止继续使用并及时与我们联系。 ◇分装可以最大程度降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。 ◇分装的量以一次实验用完为好，但建议最少不要少于10μL每份。分装体积越小，抗体浓度可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响，同时分装次数越多移液吸头吸附的抗体也越多，可能会误认为抗体没有足量装入。（最好用无菌的进口0.2ML离心管来分装抗体，国产的小管一般没有经过很好的硅化处理，容易吸附抗体蛋白，影响抗体活性。） ◇分装时请将无菌的微量移液器吸头先插入管底部反复吹打几次后再吸出抗体，以便抗体有效成分与抗体保护剂充分混匀。 ◇复融后的分装抗体如果一次用不完，请将剩余母液保存在4℃冰箱，避免再冻起来！ ◇绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱的冷藏室中。尽量将抗体保存在手动除霜冰箱里面，而不是在冰箱门上。 3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是基本没有影响的。如果抗体很快（1-2周内）就能使用完，推荐在4℃保存，避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则分装后-20℃保存。 4、即用型抗体请务必保存在4℃冰箱，一定不能冷冻保存。注意：即用型抗体有效期：自购买之日起1个月。
抗体的选择和保存
抗体的选择和保存 当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。 一、怎样选择适合你实验需要的抗体 1. 一抗选择要点 （1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。 （2）确定你的实验类型，ELISA，WB，IHC，ICC，还是FACS。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。 （4）样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS 流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。 （5）单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异
一抗的选择
随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。 当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。 一、抗体选择总体原则 1. 关于特异性的选择 特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。 （1）蛋白特异性 针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。
（2）种属特异性 同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。 （3）实验方法特异性 目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。同样，申请到免费的抗体样品是个很好的途径。 （4）标记物的特异性 一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如WB、IHC 等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不通的参数
抗体的保存建议
抗体的保存建议： 抗体保存得当与否直接决定了抗体的活性和使用效果。如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。请按照说明书或者抗体标签上推荐的保存条件正确保存抗体！无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融抗体！ 1.拿到抗体后请务必在1000-3000转离心1-2分钟后再打开管盖进行分装和保存！（由于运输过程中反复颠簸，管内微量抗体容易聚集在管盖处，一旦直接打开容易流失抗体。请放心博士德抗体出厂时保证已装入足量。） 2.对于博士德大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃冰箱。 ◇分装可以最大程度降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。 ◇分装的量以一次实验用完为好，但建议最少不要少于10μL每份。分装体积越小，抗体浓度可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响，同时分装次数越多移液吸头吸附的抗体也越多，可能会误认为抗体没有足量装入。（最好用无菌的进口0.2ML离心管来分装抗体，国产的小管一般没有经过很好的硅化处理，容易吸附抗体蛋白，影响抗体活性。） ◇分装时请将无菌的微量移液器吸头先插入管底部反复吹打几次后再吸出抗体，以便抗体有效成分与抗体保护剂充分混匀。 ◇复融后的分装抗体如果一次用不完，请将剩余母液保存在4℃冰箱，避免再冻起来！ ◇绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱的冷藏室中。尽量将抗体保存在手动除霜冰箱里面，而不是在冰箱门上。 3.大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是基本没有影响的。如果抗体很快（1-2周内）就能使用完，推荐在4℃保存，避免反复冻融对抗体活性的损害。如果要长期保存则分装后-20℃保存。 4.即用型抗体请务必保存在4℃冰箱，一定不能冷冻保存。 5.特殊抗体的保存： ◇酶联抗体：一般保存在4℃，尽量避免冷冻起来。否则可能会导致酶活力的下降或者丧失。◇偶联抗体：所有偶联抗体需要4℃避光保存。尤其是荧光标记抗体，对光极为敏感，因此所有实验阶段也是要避光操作的
抗体选择题
1.关于轻链的叙述，哪项是错误的(A) A、Ig根据V L抗原特异性不同分为两个型 B、Ig的轻链均相同 C、轻链有两型 D、同一个天然Ig分子上两条轻链的型总是相同的 E、人血清中各类Ig所含?链和?链的比例约为2:1 2. 免疫球蛋白的结构是由 (D) A、二条相同的重链组成 B、二条多肽链组成 C、以J链连接的一条轻链和一条重链组成 D、二硫键连接的二条相同重链和二条相同轻链组成 E、二硫键连接的一条重链和一条轻连组成 3. 将免疫球蛋白分为两型的根据是 (A) A、轻连恒定区抗原性不同 B、重链恒定区抗原性不同 C、重链可变区抗原性不同 D、轻链可变区抗原性不同 E、超（高）变区抗原性不同 4. 抗体与抗原决定簇互补结合的部位是 (C) A、V H B、C L、C H C、V H、V L中的CDR（HVR） D、V L中的CDR E、Fc段 5. 抗原和抗体特异结合的部位在 (B) A、V H B、V L和V H C、C L和C H D、Fc段 E、C H 6. IgG与FcR结合的功能区是 (D) A、C H2 B、C H1 C、铰链区 D、C H3 E、V H、V L 7. IgG (C) A、在胚胎期即可合成 B、有CH4功能区 C、能通过胎盘 D、B细胞表面抗原识别受体属此类 E、天然血型抗体属此类 8 .铰链区位于 (A) A、C H1与C H2之间 B、V H与C H1之间 C、C H2与C H3之间 D、C H3与C H4之间 E、V H与C H之间 9. 关于Ig分泌片的特性哪项是错误的 (E) A、以非共价键方式连接两个Ig分子单体 B、由上皮细胞合成和分泌
一抗的选择
一抗的选择 检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适 的抗体，需要考虑如下几种因素： 分析试验应用的类型I 样本蛋白的结构性质I 样本的种属I 抗体宿主的种类I 抗体的标记和检测I 1?分析试验应用的类型 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，女口：可以应用于WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验， 则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。 2?样本蛋白的结构性质 了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑 待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括： 全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需 要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。I 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原 和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然 折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗 体说明书上应用部分标示出来I 3?样本的物种 应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白 同源性比对。 4.一抗宿主物种的选择 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫 球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选 兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本 的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的western blotting 检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本
GAPDH抗体说明书
GAPDH抗体 WB, Western blot; IF, Immunofluorescence; IHC, Immunohistochemistry. Mam, mammalian, including human, mouse, rat, pig, rabbit, dog, cat; C, chicken; Fi, fish; Fr, frog. 不能用于检测bovine和yeast样品。 本GAPDH抗体(GAPDH antibody，也称为G3PDH antibody)为进口分装，用从兔肌肉纯化获得的GAPDH作为抗原制备而成的抗GAPDH小鼠单克隆抗体。克隆号为6C5。 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是糖酵解(glycolysis)过程中的关键酶之一。GAPDH由4个分子量约为36kD的亚基组成，总的分子量为146kD。在SDS-PAGE凝胶电泳时解聚为单体，显示的分子量约为36kD。哺乳动物的GAPDH除了在糖酵解过程中起作用外，还和membrane fusioin，microtubule bundling, RNA出核运输，DNA复制和DNA修复等有关，并和前列腺癌、神经细胞凋亡、神经退行性疾病等相关。 GAPDH几乎在所有组织和细胞中组成性高表达。只有缺氧和糖尿病等情况可以在某些细胞中上调GAPDH的蛋白水平。 GAPDH在各种组织和细胞中都组成性高表达，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照(loading control)。 配套提供了Western一抗稀释液，可以用于Western检测时的一抗稀释。 )： 保存条件： GAPDH抗体-20℃保存，Western一抗稀释液-20℃或4℃保存，一年有效。Western一抗稀释液优先推荐4℃保存，长期不使用可以考虑-20℃保存，但冻融可能会导致出现轻微的浑浊和少量不溶物。 注意事项： 在Western实验后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western实验时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。 回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g 离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. Western检测： A. 按照1: 500-1000用碧云天提供的Western一抗稀释液稀释抗体。 B. 把经过封闭的蛋白膜与稀释好的一抗4℃缓慢摇动过夜或室温缓慢摇动1-2小时，确保稀释的抗体至少能在摇动的瞬 间覆盖蛋白膜。通常与一抗4℃缓慢摇动过夜效果更好一些。 C. 回收稀释的一抗，4℃保存以备下次继续使用。 D. 按照Western的实验步骤进行后续的洗涤、二抗孵育、洗涤和检测等操作。具体操作可以参考如下网页： h ttp://https://www.360docs.net/doc/f865063.html,/western.htm 2.免疫染色：
抗体选择
抗体选择 随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。 当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。 一、抗体选择总体原则 1. 关于特异性的选择 特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。 （1）蛋白特异性 针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。（2）种属特异性 同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。 （3）实验方法特异性 目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。同样，申请到免费的抗体样品是个很好的途径。 （4）标记物的特异性 一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如WB、IHC等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不通的参数要求选择对应的标记物。在免疫荧光双标实验中，需要选配不同的荧光标记物。 2. 抗体种属来源的选择 有人认为单抗比多抗好，其实这并不是一个严谨的观点，只能说在可能性上单抗的特异性更好一些，而多抗的亲和力会优于单抗，并且特异性并不一定就逊于单抗，主要看抗原的设计水平。目前商品化抗体里单抗主要是鼠单抗、兔单抗，多抗主要是兔多抗、山羊多抗等，其他种属来源抗体较少。不建议纠结于单抗好还是多抗好，能做出实验的抗体就是好抗体。 在选择上一般建议实验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。抗体不同种属会要影响接下来二抗的选配。特别是在免疫荧光双标实验中，需要在区别于实验种属的基础上，区分开两个指标的抗体种属来源，以便于二抗区别识别。 3. 关于性价比的选择 抗体的品质高低最终还是需要通过实验结果来呈现的，但是在选择抗体之前我们并无法准确判断抗体的效果如何。无论什么品牌的，无论进口还是国产的，都会有用得不错的产品，也都会有做不出来的产品。抗体属于异质化产品，不同品牌之间，甚至同一品牌的不同产品之间，抗体品质差异都较为明显，而且没有统一的衡量标准。这是抗体选择中最难的一个问题。很多人习惯于根据实验室传统意识或参考文献上使用的产品进行选择，但是因为不同批次间的抗体效果也是有差异的，所以并不能完全确保正确选择。在这种情况下，抗体的售后就尤为重要，遇到抗体品质障碍时，能够确保有效地解决问题，不至于影响实验的进展。现在有部分品牌可以提供免费的抗体小样的，无疑对这个问题是一个很好的解决方案。先确定抗体是否适合自己的实验，可以避免因为抗体质量投诉耽误实验安排。 在价格方面，需要谨记，最贵的不一定就是最好的，最适合你的实验的才是最好的。花很多钱买到很贵的抗体，再花上很长的时间去投诉的情况并不少见。只买对的，不买贵的。在选择价格的时候还要注意规格大小、抗体浓度、效价范围等，要综合考虑。在规格方面，根据最终可以稀释成的工作液的量的来衡量更为准确。很多老品牌提供的抗体产品基本都是以大包装为主，就单个课题的实验而言，过大的包装有时会造成很大的浪费。目前Proteintech、Bioworld、