DGGE银染溶液配制、银染步骤及切胶回收解读
溶液配制
固定液：乙醇90ml，冰醋酸4.5ml，定容至900ml（各组分含量：10%乙醇，0.5%
冰醋酸）
注：如果显影完后不进行终止显影，那么固定液可以回收使用。
染色液：AgNO3 1.4g，甲醛600μl，加入去离子水700ml，振荡混匀，甲醛在使用前加入。
每次使用需新鲜配制，在固定步骤快结束时配制即可。
显色液：NaOH 9g，甲醛1200μl，加去离子水600ml。
显影液的配制可以先配成NaOH溶液放入4℃冰箱贮存，待要用时取出
再加入甲醛并混匀。预冷的显影液可以让条带显影更漂亮清晰，但是显影速度会变慢一些。
银染步骤
1.固定
将胶放入固定液中，摇床振荡15min。摇床速度无需很快，小档即可。
2.银染
固定液中取出胶，去离子水快速清洗两次，固定液此时可回收。
将胶放入配制好的染色液中，摇床振荡20min。尽量在通风橱中进行并避光。有时候胶会飘在水面导致染色结果不好，可调整摇床速度使染色液没过胶。
3.显影
染色液中将胶取出，去离子水快速清洗一到两次，尽量迅速！放入预冷过的显影液中显影，并马上迅速振荡容器，使胶周围的银离子扩散均匀，待溶液颜色均匀不变，摇床开小档振荡直至条带显色完全。
4.终止显影
将胶取出清洗两次，放入固定液中，即可终止显影，但固定液不可回收了。如果不需要保存胶的话，这一步可以省略。
5.拍照
将胶放在白光透射仪上，轻轻抚去底下的气泡，铺平摆正胶，数码相机拍照。注意：银染全程，手指不可碰到胶，尤其是染色~显影这一段步骤，摸一下胶就会留下手印。
切胶回收步骤
在白光透射仪上用干净的手术刀片切胶，放入灭菌的0.5ml离心管中，加入灭菌水50μl后，用黄枪头捣碎，离心后60~65℃水浴3~6h，取出离心后可以进行PCR实验，如果时间不能安排马上做PCR也可放4℃过夜，第二天做PCR。
DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)
DNA银染 一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释) 1、固定液：50ml乙醇 2、前处理液（敏化液）：5ml HNO3 3、染色液：0.5g 硝酸银（避光配制） 4、显色液：无水Na2CO3 12.5g 甲醛200ul 加水至500ml 5、终止液：50ml 冰醋酸 二、银染步骤（摇床设置52rpm左右） 1、准备好放有双蒸水的塑料盒，将电泳后的变性胶放入盒中在摇床上轻摇1min； 2、凝胶固定：倒掉盒中的水，加入100ml左右的固定液，摇床上缓缓摇动10min； 3、洗胶：弃固定液，用双蒸水洗2次，每次30S； 4、凝胶氧化：弃双蒸水，加入100ml左右前处理液氧化6min； 5、洗胶：弃前处理液，用双蒸水洗2次每次10S； 6、凝胶染色：弃双蒸水，加入100ml左右的染色液避光摇20min； 7、洗胶：弃染色液，用双蒸水洗1次10S； 8、凝胶显色：加入100ml显色液摇到看到清晰的条带为止； 9、终止：弃显色液，迅速加入终止液100ml左右，摇2-3min； 10、洗胶：弃终止液，用双蒸水洗2次每次1min。 三、变性聚丙酰胺凝胶的配制（两块、使用1.0BioRad胶板） 1.2%的凝胶可以跑微卫星，和基因组DNA 1、尿素：7.2g 2、30%聚丙酰胺，4.68ml 3、10×TBE，1.5ml (Tris碱108g；硼酸55g；EDTA 40ml 0.5mol/L,Ph=8.0；加水至1L) 4、30%AP，35ul 5、TEMED,4ul 四、下图：左为果蝇正常基因组DNA与损伤后基因组DNA；右为果蝇微卫星电泳 12h Treatment24h Treatment M CT 0 5 10 200 5 10 20 Protein银染 一、银染试剂500ml/瓶(双蒸水稀释) 1、固定液：200ml甲醇，50ml冰醋酸 2、前处理液（敏化液）：150ml 乙醇，34g醋酸钠，1g硫代硫酸钠（使用前加入） 3、染色液：1.25g 硝酸银（避光配制）
SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项
SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项 银染注意事项: 1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。 2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。 3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。 4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm. 5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。 6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS 的去离子水。 7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。 8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。 9. 在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。 10. 室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。 11. 当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。 12. SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。 13. 凭借戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。 14. 染色使用的玻璃器皿必须非常干净，用酸浸泡可以满足要求。 15. 银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。 我们做蛋白质电泳的人都知道，银染色很灵敏，有很强的说服力，但通常胶背景较深，不易扫描。在这里介绍一下低背景的蛋白质银染方法。 AgNO3, 0.075% HCHO(现用现加) 20 min -15 min ：说明，此步中洗涤过程要控制好，时间太长，可能显色时间太长甚至染不出色；反之，时间太短，银没有洗干净，背景变深。但做几次以后就很快掌握了。
考染与银染
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。 蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。 我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。 试剂 固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为Sigma公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品。甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。 仪器 IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。 细胞总蛋白质的提取 取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中（8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。 单向定量电泳 取蛋白质分子量标准物，第一次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15μl 上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。 双向电泳 取300μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45 分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11～16小时。溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为：快速升压，250 V，0.5小时;500 V，0.5小时;10000
银染操作步骤
银染操作步骤 1. 固定： 电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为 60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。 固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液，可大量配制室温存放。 2. 30%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。 3. 水洗涤：（洗2次） 弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 4. 增敏：（辅染）现配现用 弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。 银染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸钠溶液，需用黑袋包裹避光保存。 5. 水洗涤(共2次)： 弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。 弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为 60-70rpm。 6. 银染： 弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 银溶液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。银溶液(1X)配制后需在2小时内使用，最好是现配现用。 银溶液（100 X）的配制：称取5g硝酸银，加水溶解并稀释至500ml，摇匀即得1%的硝酸银溶液，需用黑袋包裹避光保存。 7. 水洗涤： 弃原有溶液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度
核仁组成区嗜银蛋白染色液(AgNOR Stain)
核仁组成区嗜银蛋白染色液(AgNOR Stain) 简介: 核仁组成区(NORs)是染色体上的一个编码核糖体RNA(rRNA)的片段，存在于DNA 特异性环上，凸向核仁。硝酸银染色法可确定组织切片上的核仁组成区，可显示与NORs 有关的酸性蛋白。然而，这些银染色NOR 相关蛋白(AgNOR)位点仅代表在每个核仁中的部分核仁组成区，并非全部。在电镜下，核仁组成区为在电子致密区中的境界不清的浅染区域。在石蜡切片上，在核仁中见到的每一个点状反应颗粒有可能代表多个AgNOR 位点，这是因为正常或两性细胞核仁AgNOR 易紧密聚集，所以银染色后，一个点状颗粒实际上是多个AgNOR 的聚集。 核仁组成区嗜银蛋白染色主要特点是操作简便、批量染色的较为经济，AgNOR 位点的数量增加与细胞增殖性增加有关，对于良恶性肿瘤的鉴别具有一定的意义。 组成： 自备材料： 1、10%中性福尔马林固定液 2、显微镜 3、蒸馏水 参考操作(仅供参考)： 1、 切片脱蜡入水，再至蒸馏水。 2、 蒸馏水洗片。 3、 入AgNOR 染色工作液，室温孵育。 4、 蒸馏水洗片。 5、 (可选)甲基绿染色液复染，水洗凉干。 6、 常规脱水，常规透明，非水溶性封片剂封片。 编号 名称 DK0047 2×50ml Storage 试剂(A1): AgNOR 银溶液 25ml 4℃ 避光 试剂(A2): AgNOR 胶溶液 25ml RT 避光 临用前，A1，A2混合，即为AgNOR 染色工作液，即配即用。 试剂(B): 甲基绿染色液 50ml RT 避光 使用说明书 1份
染色结果： AgNOR位点核内黑色点状 背景根据复染液不同而不同 注意事项： 1、组织固定宜采用10%福尔马林或中性福尔马林。 2、本染色液适用于石蜡切片，切片厚度在3～4μ为宜。 3、如需复染，可在步骤4之后用中性红复染，但应注意避免过染。 4、配制好的AgNOR染色工作液易退化，所以最好即配即用，不易久置。 5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 DF0111 中性福尔马林固定液(10%) DG0005 糖原PAS染色液 DH0001 改良Lillie-Mayer苏木素染色液 DJ0001 普鲁士蓝染色液(核固红法) PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)
银染方法总汇及注意事项
ptotocol是这样的，请看哪里不妥： 蛋白银染步骤 步骤溶液时间 固定甲醇100ml 冰醋酸25ml 加双蒸水至250ml 30min 冲洗双蒸水3次 敏化甲醇75ml 戊二醛（25%w/）1.25ml 硫代硫酸钠(5%w/) 10ml 醋酸钠（17g） 加双蒸水至250ml 30min 冲洗双蒸水3次 银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml 甲醛(37%w/) 0.1ml 加双蒸水至250ml 20min 冲洗双蒸水2次 显色碳酸钠(6.25g) 甲醛(37%w/) 0.05ml 加双蒸水至250ml 2-5min 终止EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min 冲洗双蒸水3次 建议使用silia的方法！！ 简单，快！ 本人的银染方法： 1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟； 2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟； 3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟； 4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒； 5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟； 6. 水洗：同上； 7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟； 8. 水洗：同上； 9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。 以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。谢谢！！！ 5.2.2.3 银染色 1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％ 甲醇500ml 冰醋酸120ml
蛋白质染色(银染法)标准操作规程
蛋白质染色（银染法）标准操作规程（编号：041） 1、目的及适用范围 检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，实验原理是在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。 2、主要仪器 摇床、避光盒 3、试剂及配制方法 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛，去离子水 固定液：100mL乙醇（40%乙醇），25mL冰醋酸（10%冰醋酸）加水到250mL； 致敏液：75mL 乙醇（30%乙醇）17g 乙酸钠，28.2g 三水乙酸钠（34g乙酸钠），0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250mL； 银染液：0.625g AgNO3，100 uL37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL； 显色液：6.25 g Na2CO3，50 μL 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250mL； 终止液：3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250mL 保存液：1% 冰醋酸 4、操作步骤 4.1固定：50mL固定液中固定30min或者更长时间 4.2致敏：50mL致敏液中致敏30min 4.3水洗：3 x 10min 4.4银染：50mL银染液中染20min （保持避光） 4.5水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色) 4.6显色：50mL显色液中显色，时间视显色程度而定 4.7终止：50mL终止液中终止10min 4.8保存：1% 冰醋酸，4 ℃ 5、注意事项 88
P0017S 快速银染试剂盒
快速银染试剂盒 产品简介： 快速银染试剂盒(Fast Silver Stain Kit)是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白银染的试剂盒。 本试剂盒也可以用于2D凝胶的银染，并且染色后和后续的质谱检测兼容。 本试剂盒只需一小时左右即可观察到蛋白条带，90分钟内可以完成2块凝胶的银染。 对于BSA蛋白，检测灵敏度可以达到0.3ng蛋白。 无需使用有毒的甲醇。 本试剂盒可足够用于25块常规的8×10cm凝胶的银染。 保存条件： 室温保存，一年有效。银溶液(100X)和银染显色加速液(2000X)需避光保存。 注意事项： 由于银染非常灵敏，操作时请注意尽量使用高纯度的水，并确保所使用的器皿非常清洁，最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套，避免皮肤和凝胶直接接触。 需自备乙醇、乙酸及MilliQ级纯水或双蒸水。 下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10cm厚度为0.75-1mm的凝胶。对于更大的凝胶，各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大，对于更厚的凝胶，作用时间需按照厚度的比例适当延长。 本说明书所指的室温为20-25℃，操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降，各步骤需适当延长时间。 银染基本显色液(10X)在低温环境下可能会出现沉淀，可在30-37℃水浴中溶解，并充分混匀后使用。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.固定： 电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。 固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液。 2.30%乙醇洗涤： 弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 30%乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30%乙醇。 3.水洗涤： 弃30%乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。 4.增敏： 弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。 银染增敏液(1X)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2小时内使用。 5.水洗涤(共2次)： 弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
银染步骤及注意事项
银染步骤是1 固定10冰乙酸min。2 清洗双蒸水冲洗凝胶次每次1min。3 染色染色液1g硝酸银.5mL37甲醛1L双蒸水。现配染色30min。4 清洗迅速洗凝胶次。 5 显影30g 碳酸钠1.5mL37甲醛200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括 1 用超纯水比如NANOpure或Milli-Q纯化或者是双蒸水作银染。2 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。3 在染色后水清洗所用时间的长短很重要用不超过5-10秒的时间清洗胶然后放入显色溶液中一般在水里浸一下就好。 4 甲醛和硫代硫酸钠ul/1ml在使用前及时加入到显色液中。 5 在使用前及时配染色液。银染的方法种类很多目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高可染出胶上低于1 ng/蛋白质点故广泛的用在2D 凝胶分析上及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法对关键操作及要求做了补充主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测如内源性GST-Pulldown、Co-IP 等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验目的检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。实验原理在碱性条件下用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子还原成金属银以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有
关不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。试剂乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序固定30min或者更长时间o 100ml 乙醇40 乙醇o 25ml冰醋酸10 冰醋酸o 加水到250ml 致敏30min o 75ml 乙醇30 乙醇o 17g 乙酸钠28.2g 三水乙酸钠o 0.5g硫代硫酸钠o 加水到终体积250ml 水洗3 x 10min 银染20min o 0.625g AgNO3 o 100 ul 37甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 水洗2 x 1 min 注意把握时间水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色显色视情况而定o 6.25 g Na2CO3 o 50 ul 37 甲醛在使用前加入o 加水到终体积250ml 终止10min o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸o 加水到终体积250ml 保存1 冰醋酸4 ℃注意事项1固定时间较长则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。2甲醛在使用前加入。3 最好多配制一份显色液第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液显色到点清晰。 4 显色过程很快要注意把握时间避免染色过度。5银染液和显色液需要预冷。 6 所用器皿要很洁净不用手直接接触以免杂蛋白污染7 清洗用水尽量用高纯度去离子水蒸馏水更佳可以减少背景着色。
我们实验室用的银染方法
我们实验室用的银染方法 1.50%甲醇浸泡15分钟（置于摇摆床上，以下省略，本步骤两次，每15分钟更换一次） 2.10%甲醇浸泡10分钟 3.水漂洗3次，每次数秒 4.2 gM DTT溶液浸泡20分钟 5.0.1%硝酸银溶液浸泡20分钟 6.水漂洗3次，每次不超过15秒（每次约150ML） 7.显色液漂洗3次，每次不超过15秒（每次约100ML） 8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带（约200ML） 9.10G柠檬酸定影 显色液:15G无水碳酸钠溶于500ml水，用前加入250 g L福尔马林搅拌均匀 水用双蒸水就可以，纯度越高越好，其他试剂用分析纯，据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏 此方法岀自冷泉港蛋白质技术指南（实际上是其蛋白质技术会议的总结）灵敏度稍低于分子克隆上老方法，但是非常方便，也比其他方法快速，只需要1.5小时，我染岀来的胶非常漂亮，有需要的话可以上传给大家看看 一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。 其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净 大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白 1.取下凝胶，蒸馏水冼胶30秒. 2.0.1% 硝酸银染色10分钟. 3.弃去染色液，蒸馏水洗胶1分钟. 4.显色液显色15秒，换用新的显色液，显清条带为止. 显色液配方：10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液，定溶到500ml. 这个染色方法挺好的，我用过.注意染色时间不能长 材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。 液体的量一般是胶体积的5倍，比如13X13X 0.1cm的胶，用一百ml 一定够，80也行
PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明
PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明 货号:G7210 规格:1L 保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月。 试剂盒内容：G7210 染色液A200ml 染色液B1ml 染色液C100ml 显色液D100ml 试剂E2g 注：1L规格指可配制的银染液的体积，实际使用次数根据PAGE胶大小不同而不同。 产品说明: 蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把蛋白电泳带染成黑褐色。它主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。其灵敏度比考马斯亮蓝高，PAGE凝胶快速银染试剂盒整个过程操作简单，灵敏度高，能检测到10ng以下的蛋白条带。 操作步骤: 一、染色液配制(无水乙醇自备) 需要配制的染色液体积根据PAGE胶的大小而定，一般的mini-PAGE胶需要20-30mL。配制用的器皿清洗干净后用去离子水涮洗，染色液须用去离子水配制，现用现配。如果配制的溶液体积不是100mL，可以按比例改变各成分用量。
1.固定液：取40ml无水乙醇，10ml染色液A加去离子水至100ml，混匀； 2.敏化液：取30ml无水乙醇，10ml染色液C加去离子水至100ml，混匀； 3.银染液：称取0.12g试剂E，用50ml去离子水溶解，加入10ul染色液B混匀，加去离子水至100ml现用现配。 4.显色液：10ml显色液D和30ul染色液B加入去离子水至100ml，混匀，现用现配。 5.终止液：取5ml染色液A加去离子水稀释至100ml，现用现配。 二、染色： 1.PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min。 2.将PAGE胶转移至敏化液中，使染液没过PAGE胶，室温作用30min。可置于摇床上缓慢摇晃 3.弃去敏化液，用去离子水漂洗三次，每次10min。 4.将PAGE胶转移至银染液中，使染液没过PAGE胶，室温摇晃40min。 5.将PAGE胶转移至显色液中，使显色液没过PAGE胶，室温摇晃，该显色一般在10min 左右。 6.再选择合适的时间进行终止，弃去显色液，加入终止液即可。最后可进行信号收集保存。注意事项： 1.银染主要出现在PAGE胶的表面，使用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。 2.对于考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。考染过程中的乙酸会干扰银染，因此要确保将PAGE凝胶中残留的乙酸彻底洗净。 3.不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。 4.染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60rpm.
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤审批稿
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步 骤 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影：
基本银染和微波快速银染步骤-中文翻译
基本的银染步骤：（90min） 材料： 超纯水（>18 megohm/cm全程）、塑料染色托盘、摇床、塑料搅拌棒、10mL 一次性管、干净的玻璃杯、量筒、30%乙醇、100%乙醇、固定液（40%乙醇、10%乙酸） 注意事项： 1.在拿胶前确定用去离子水清洗橡胶手套。 2.用干净的容器，并标明银染专用。 3.当摇动时，确保容器大小可使胶在里面自由移动，染色时溶液能完全沫过胶面。 4.在拿胶或换溶液时，避免徒手摸胶或用金属物品接触，及避免对胶施加压力。 5.用有铁氟龙图层的棒和干净的玻璃容器准备试剂。 6.避免试剂交叉污染。 7.用新鲜配置的溶液。 样品含有高浓度的DTT： 如果你的样品含有高浓度的DTT （>50mM）,银染时可能导致条带拖尾和黄色背景。为避免拖尾按照下面的方法还原和烷基化样品： 1. 用新鲜配制的DTT还原你的样品到终浓度为17mM，并在70℃加热10min. 2. 用新鲜配制的碘乙酰胺烷基化你的样品到终浓度为35mM，并在70℃加热10min. 3. 加不含DTT的SDS样品buffer到还原和烷基化后的样品中。进行电泳，并按手册进行银染。 在开始之前： 用试剂盒中的试剂准备如下溶液用于银染： 程序：下面的程序用于8*8厘米预制胶，1.0mm厚。如果要染两块小胶或1.0mm厚的大胶（18*18），保证孵育时间，将所有溶液的体积加倍。 注意：如果你的胶的尺寸和上面提到的不一样，你可能必须通过调整孵育时间和溶液体积来选择银染策略。 所有的孵育应该在一个旋转摇床上进行，以1圈/秒的速度在室温下进行。确保每个胶有100ml的溶液。 1. 电泳后，将胶取出至合适尺寸的银染托盘内，用超纯水简单的清洗一下。 2. 用100ml固定液在摇床上缓慢旋转，固定胶20min。如果你用的是Tricine 胶，那么就固定1小时。 注意：如果没有足够的时间完成银染程序，胶可以在固定液中存放一夜。长时间的固定在某些情况下可能会改善灵敏度和背景。 3. 倒出固定液，用30%乙醇洗胶10min。 4. 倒出乙醇，加入100ml敏化液，孵育10min. 5. 倒出敏化液，100ml 30%乙醇洗胶10min. 6. 用100ml超纯水洗胶10min. 7. 用100ml 染色液孵育胶15min. 8. 染色完成后，倒掉染色液，用100ml 蒸馏水洗胶20-60秒。 注意：如果洗胶超过1min会使银离子减少，影响灵敏度。 9.在100ml 的显影液中孵育胶4-8min，直到条带开始出现，想要的条带强度达到。 10. 当适当的染色强度达到后，立刻加
凝胶成像及Quantity One中文操作说明
第一章简介 凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，要向大家介绍的是Bio-Rad公司的1D凝胶分析软件Quantity One（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest）。Quantity One软件是常用1D凝胶分析软件中功能最强大，自动化程度最高的软件。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的网 （https://www.360docs.net/doc/f710697343.html,）免费下载，以供试用或用户升级之用。 Quantity One软件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等，此外，还可以直接控制Bio-Rad公司的各类图像仪和ExQuest自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。 Quantity One软件拥有与windows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。 插入密码狗，打开Quantity One软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。 File 图像打开、保存、引入、打印等操作 Ma tch 分子量估算、条带匹配分析 Edit 图像普通编辑操作Vo lumn 定量分析 View 图像缩放、三维视图、看光密度值等操作 An alysis 浓度估算、克隆计数等分析
每个菜单的主要功能如下： 往 下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表： Quantity One 软件Help àQuick Guide 快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等。快捷指南下有1，2，3…步骤，根据提示完成。 使用Quantity One 软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。图像获取就是通过软件控制扫描仪（GS-800、PharosFX 等）或凝胶成像系统（GelDoc 、ChemiDoc 、VersaDoc 等），图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能，得到我们想要的结果。Quantity One 软件提供了多种结果输出方式。在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件。 Imag e 图像旋转、翻转、裁切等操作 Re ports 分析结果输出 Lane 泳道分析 Wi ndow 窗口分析 Band 条带分析 He lp 帮助、快捷菜单、软件注册等
SDS-PAGE电泳操作流程—含考染 银染 碘染
SDS-PAGE操作流程——考染 1、准备溶液 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】 各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml 29%Acrylamide(丙烯酰 290g 29g 胺) 10g 1g 1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰 胺) 【配制方法】 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存 【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1MTris-HCL 名称用量备注 Tris 12.1g 去离子水80ml 浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定 去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存 【配制方法】 称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 【保存条件】 4℃保存。 【注意事项】 对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5MTris-HCL 名称用量备注
银染方法
A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry The growing availability of genomic sequence information,together with improvements in analytical methodology,have enabled high throughput,high sensitivity protein identi-fication.Silver staining remains the most sensitive method for visualization of proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-D PAGE).Several silver staining protocols have been developed which offer improved compatibility with subsequent mass spectrometric analysis.We describe a modified silver staining method that is available as a commercial kit (Silver Stain PlusOne;Amersham Pharmacia Biotech,Amersham,UK).The 2-D patterns abtained with this modified protocol are comparable to those from other silver staining methods.Omitting the sensitizing reagent allows higher loading without saturation,which facilitates protein identification and quantita-tion.We show that tryptic digests of proteins visualized by the modified stain afford excellent mass spectra by both matrix-assisted laser desorption/ionization and tandem electrospray ionization.We conclude that the modified silver staining protocol is highly compatible with subsequent mass spectrometric analysis. Keywords:Proteomics /Two-dimensional gel electrophoresis /Silver stain /Mass spectrometry /Protein identification /Matrix assisted laser desorption/ionization ±time of flight /Electrospray ionization ±time of flight EL 4190 Jun X.Yan 1Robin Wait 2 Tom Berkelman 3Rachel A.Harry 1 Jules A.Westbrook 1Colin H.Wheeler 1Michael J.Dunn 1 1 Department of Cardiothoracic Surgery,National Heart and Lung Institute,Imperial College School of Medicine,Heart Science Center,Harefield Hospital, Harefield,Middlesex,UK 2 Kennedy Institute of Rheumatology,Hammersmith,London,UK 3 Amersham Pharmacia Biotech, San Francisco,CA,USA The increasing availability of genomic sequence informa-tion,together with improvements in protein characteriza-tion by mass spectrometry,have facilitated huge in-creases in the throughput of protein identification.Most commonly,sample components are separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-D PAGE)and protein spots are visualized by staining silver,Coomassie blue or SYPRO fluorescent dyes [1±3].Individual spots are then excised from the gel,proteolytically digested,and the masses of the resulting peptides are determined by matrix assisted laser desorption/ionization ±time of flight ±mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).The list of peptide masses thus obtained can then be used as a highly spe-cific query to interrogate a protein database [4±9].Recent advances in tandem electrospray ionization-mass spec-trometry (ESI-MS/MS),particularly the development of hybrid quadrupole /orthogonal acceleration TOF instru-ments (Q-TOF),enable routine de novo sequencing of low femtomole levels of peptides [10±13].The ability to determine 10±20amino acid lengths of sequence greatly facilitates cross-species protein identification and retrieval of homologous proteins from genomic and EST data-bases,even when an exactly matching sequence is not present.It is desirable to visualize protein spots in the gel at sensitivities which are roughly comparable to those of the subsequent MALDI-and ESI-MS analyses (usually in the range of nanograms per protein spot).Silver staining has been widely used for this purpose [14,15]since it re-quires relatively inexpensive equipment and reagents and remains one of the most sensitive methods for perma-nently staining proteins in polyacrylamide gels. For protein silver staining,a polyacrylamide gel is soaked in a solution containing soluble silver ions (Ag +)and sub-sequently developed by treatment with a reductant.Pro-tein molecules in the gel promote the reduction of silver ions to metallic silver (Ag 0),which is insoluble and visible.Initial deposition of metallic silver promotes further depo-sition by an autocatalytic process,resulting in exception-ally high sensitivity.There are many published versions of the silver staining process [16,17],which may incorpo-rate,in addition to silver impregnation and development,fixation steps,incubations with sensitivity enhancers (e.g.,glutaraldehyde or formaldehyde),stopping and preservation,and washing steps.The reagents used vary,but the silver reductant is always formaldehyde.The high sensitivity of silver staining comes at the cost of sus-ceptibility to interference from a variety of scources. Correspondence:Dr.Jun X.Yan,Heart Science Center,Hare-field Hospital,Hill End Road,Harefield,Middlesex,UB96JH,UK E-mail:jun.yan@https://www.360docs.net/doc/f710697343.html, Fax:+44-(0)1895-828-900 3666 Electrophoresis 2000,21,3666±3672 WILEY-VCH Verlag GmbH,69451Weinheim,2000 0173-0835/00/1717-3666$17.50+.50/0