免疫组化详细配方及步骤

免疫组化液体配制

1.封闭液（0.3％H2O2溶液）：

2. 洗涤液（0.1M磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2－7.4））现在洗液改用蒸馏水

3.柠檬酸抗原修复液(pH6.0)

A液

免疫组化步骤

1．石蜡切片常规脱蜡至水。

2．切片浸入0.3％H2O2封闭液置于摇床封闭15分钟，蒸馏水摇洗3min×3遍；

3．抗原修复：

A：高压修复(有时易掉片)：加热修复液至沸腾后降功率至800瓦，将切片放入加盖,至喷气开始计时2分半后停止加热。置空气或水浴中缓慢冷却40分钟，温度降至室温左右时开锅洗涤，蒸馏水摇洗3min×3遍；

B：酶抗原修复，切片蜡笔划圈，滴加酶消化液50-100ul。37℃消化60分钟（掌握时间）后蒸馏水摇洗3min×3遍。

4．滴加稀释后的一抗50-100ul（依据组织大小计算），湿盒37℃1小时，或4度过夜。

5. 蒸馏水洗涤3min×3遍。；

6. 滴加二抗复合物，每张切片50-100ul，室温60分钟。

7. 蒸馏水摇洗3min×3遍，等待显色；

8. DAB配制：B液和C液按50：1混合配制后，加到玻片组织上显色，显微镜下观察至阳性结果出现而背景尚未着色时及时中止显色，蒸馏水反复冲洗（勿直接冲洗组织，防止脱片）；

10．苏木素复染15min后冲洗，盐酸酒精分化至淡蓝色后冲洗，温水反蓝5min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

注意：操作中的任何一个步骤不应出现切片表面干燥的现象，否则容易出现阴阳脸或者假阴性。