认识大肠杆菌

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大肠杆菌

生物学分类

细菌域(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-

变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目

(Enterobacteriales)、肠杆菌科

(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)、

大肠杆菌种(E. coli)

学名:Escherichia coli (T. Escherich 1885)

大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的,在相当长的一段时间内,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼畜(禽),常引起严重腹泻和败血症,它是一种普通的原核生物,是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻,根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(E.I"IEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。

大肠杆菌0 157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌,自1982年在美国首先发现以来,包括我国等许多国家都有报道,且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发,格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中,目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌O 157:H7引起肠出血性腹泻,约2%~7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征,儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行,病情严重者,可危急生命。

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周身鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖,几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。因此,大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂,可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)

和表面抗原(K),后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同,可将大肠杆菌分为150多型,其中有16个血清型为致病性大肠杆菌,常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料,如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格(Lederberg)采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验,奠定了研究细菌接合方法学上的基础,以及基因工程的研究。

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,主要寄生在大肠内。它侵入人体一些部位时,可引起感染,如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的,尤其是对孩子及老人。

大肠细菌(E. coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病,为人和动物肠道中的常居菌,在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强,引起腹泻,统称病致病大肠杆菌。

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强,55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月,在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感,但易耐药,是由带有R因子的质粒转移而获得的。

致病物质

大肠杆菌的致病物质为定居因子,即大肠杆菌的菌毛和肠毒素,此外胞壁脂多糖的类脂A具有毒性,O特异多糖有抵抗宿主防御屏障的作用。大肠杆菌的K抗原有吞噬作用。

由大肠杆菌导致的疾病:

1、肠道外感染。

多为内源性感染,以泌尿系感染为主,如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等。婴儿、年老体弱、慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者,大肠杆菌可侵入血流,引起败血症。早产儿,尤其是生后30天内的新生儿,易患大肠杆菌性脑膜炎;

2、急性腹泻。某些血清型大肠杆菌能引起人类腹泻。其中肠产毒性大肠杆菌会引起婴幼儿和旅游者腹泻,出现轻度水泻,也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性,一般2~3天即愈,营养不良者可达数周,也可反复发作。肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死。细菌侵入

肠道后,主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。此外,肠出血性大肠杆菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎,可产生志贺氏毒素样细胞毒素。

举例

病原体:大肠杆菌O157 : H7是大肠杆菌的其中一个类型,该种病菌常见于牛只等温血动物的肠内。这一型的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素,并可能导致肠管出现严重症状,如带血腹泻。

病征:患者可能出现各种症状,包括严重的水泻、带血腹泻、发烧、腹绞痛及呕吐。情况严重时,更可能并发急性肾病。5岁以下的儿童出现该等并发症的风险较高。若治疗不当,可能会致命。

传播途径:

该种疾病可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物(特别是免治牛肉、汉堡扒及烤牛肉)而感染。饮用或进食未经消毒的奶类、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的个案亦有发现。此外,若个人卫生欠佳,亦可能会通过人传人的途径,或经进食受粪便污染的食物而感染该种病菌。

潜伏期:

通常为3至4日,但亦会长达9日。

治理方法:

感染大肠杆菌O157 :H7的临床治理方法主要属支持性治疗。若患者出现腹泻,补充失去的水份及电解质十分重要。约50%有肾并发症的患者在出现急性症状时需要特别治疗或输血。

大肠杆菌在生物技术中的应用

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系

真核基因在大肠杆菌中表达,必须有合适的表达载体,常用载体:pBV220,pET系统

目的基因在大肠杆菌中表达的情况:

大肠杆菌更适合原核基因的表达,外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的,而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率,外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在动态平衡,单个细胞

的产量又与外源基因拷贝数,基因表达效率,表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。

预防方法:

1.保持地方及厨房器皿清洁,并把垃圾妥为弃臵。

2.保持双手清洁,经常修剪指甲。

3.进食或处理食物前,应用肥皂及清水洗净双手,如厕或更换尿片后亦应洗手。

4.食水应采用自来水,并最好煮沸后才饮用。

5.应从可靠的地方购买新鲜食物,不要光顾无牌小贩。

6.避免进食高危食物,例如未经低温消毒法处理的牛奶,以及未熟透的汉堡扒、碎牛肉和其它肉类食品。

7.烹调食物时,应穿清洁、可洗涤的围裙,并戴上帽子。

8.食物应彻底清洗。

9.易腐坏食物应用盖盖好,存放于雪柜中。

10.生的食物及熟食,尤其是牛肉及牛的内脏,应分开处理和存放(雪柜上层存放熟食,下层存放生的食物),避免交叉污染。

11.雪柜应定期清洁和融雪,温度应保持于摄氏4度或以下。

12.若食物的所有部分均加热至摄氏75度,便可消灭大肠杆菌O157 : H7;因此,碎牛肉及汉堡扒应彻底煮至摄氏75度达2至3分钟,直至煮熟的肉完全转为褐色,而肉汁亦变得清澈。

13.不要徒手处理熟食;如有需要,应戴上手套。

14.食物煮熟后应尽快食用。

15.如有需要保留吃剩的熟食,应该加以冷藏,并尽快食用。食用前应彻底翻热。变质的食物应该弃掉。

大肠菌群

大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表

某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 原理: 转化(Transformation):将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-),可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法,如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高,成为感受态细胞(Compenent cells),使外源DNA分子得以进入。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法,RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入无菌甘油至总体积15%,于-70℃保存半年之久,因此CaCl2法为使用更广泛。 准备: 1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30%甘油等体积混合) 混合溶液,高温高压灭菌; 注:CaCl2必须为分析纯以上。 2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净, 高温高压灭菌; 注:最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。 3、受体菌的培养:从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基 ( )中,37℃振荡培养过 夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注:培养时间不宜超过2.5小时,否则不能达到最高转化效率。 实验步骤: 1、细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,4℃5000g离心5分钟。 注:(1)冰浴时间不要超过10分钟;(2)或者4℃8000g离心2分钟,速度太快或时间太长对细菌状态不利,并且不利于下步洗涤。(3)若出现很多黑色沉淀(细菌碎片),说明有多量细菌死亡,此时细菌状态并不好,但若只有少量黑色沉淀,或对转化效率要求不高,亦可继续进行。 2、用预冷的去离子水洗涤沉淀,4℃5000g离心5分钟。 注:(1)洗去细菌碎片和残留的培养液;(2)洗涤时间宜短不宜长。 3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分 钟,4℃5000g离心5分钟。 注:此时可见细菌沉淀为白色,体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。 4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感 受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

大肠杆菌

大肠杆菌 目录 生物学分类 学名 常见种类介绍 大肠杆菌导致的疾病 大肠杆菌的传播途径 大肠杆菌在生物技术中的应用 [编辑本段]生物学分类 细菌域(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌种(E. coli) [编辑本段]学名 Escherichia coli (T. Escherich 1885) [编辑本段]常见种类介绍 大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的,在相当长的一段时间内,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼畜(禽),常引起严重腹泻和败血症,它是一种普通的原核生物,是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻,根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附

性大肠杆菌(EAEC)。 大肠杆菌0 157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌,自1982年在美国首先发现以来,包括我国等许多国家都有报道,且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发,格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中,目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌O 157:H7引起肠出血性腹泻,约2%~7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征,儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行,病情严重者,可危急生命。 大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周身鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖,几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。因此,大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂,可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K),后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同,可将大肠杆菌分为150多型,其中有16个血清型为致病性大肠杆菌,常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料,如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格(Lederberg)采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验,奠定了研究细菌接合方法学上的基础,以及基因工程的研究。 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,主要寄生在大肠内。它侵入人体一些部位时,可引起感染,如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的,尤其是对孩子及老人。 大肠细菌(E. coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病,为人和动物肠道中的常居菌,在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强,引起腹泻,统称致病性大肠杆菌。 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强,55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月,在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感,但易耐药,是由带有R因子的质粒转移而获得的。 致病物质: 大肠杆菌具有很多毒力因子,包括内毒素,荚膜,〣型分泌系统,黏附素和外毒素等。(〣型分泌系统是指能向真核靶细胞内输送毒性基因产物的细菌效应系统。约由20余种蛋白质组成。) 黏附素能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上,避免因排尿时尿液的冲刷

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。 4、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。 7、倒出培养液,将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验,也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化,活细胞数务必少于108个细胞/mL,对于大多散大脑杆菌来说,这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20 min测定OD600值来监测,用监测的时间及OD值列一个图表,以便预测培养物的OD600值到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间,OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大,因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并

常见大肠杆菌感受态的特点和用途

1:DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2:BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3:BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLysS ,Camr 4:JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15] 5:TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80 ,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 , araΔ139Δ(ara-leu)7697,galU ,galK ,rps,(Strr) endA1,nupG 6:HB101菌株 该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验 基因型:supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1 7:M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基,后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm,从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割,如FbaI和MboI等,一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割,而有些会影响,如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列,以XbaI为例,只有在位点序列旁出现GA或TC,该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法: (1)选用上述酶的同功酶,如Sau3AI,DNA识别切割位点与MboI相同;但不受甲基化影响; (2)利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备,如E.coli JM110和链霉菌等,前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出,而后者细胞内本就没有甲基化酶,从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8:E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响,需要用特定的dam-,dcm-的菌株,如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒,则不会被甲基化.

大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1)掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2)学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS,则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器:恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂:LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L,121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液:100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基:(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉,将配好的LB固体培养基高压灭菌后,冷却至60℃左右,加入长那霉素储存液,使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板,每皿倒15mL,室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1)从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株,接种于3~5mL LB液体培养基中,37℃下震荡过夜培养,12h左右,直至对数生长后期。

2)将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3)将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下,5000rpm离心5min。 4)弃去上清液,用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~20min后,40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化,待冷却至60℃左右后,加入长那霉素储存液,使其终温度为50μg/mL,摇匀后铺板,每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1)取100μl感受态细胞悬浮液,加入5μLpBS质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30min。 2)42℃水浴热激70s,热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3)向管中加入400μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4)将上述菌液摇匀,取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上,正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿,37℃培养16~24h, 5)对照实验: 对照组1:以同体积的无菌二次水代替DNA溶液,其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2:以同体积的无菌二次水代替DNA溶液,取5μl菌液,稀释100万倍,涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,各培养皿中的菌落数如下表所示:

实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备(新)

实验三大肠杆菌感受态细胞的制备 【课前预习】 1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么? 2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法? 【目的要求】 1、了解感受态细胞生理特性及制备条件; 2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法; 【基本原理】 所谓感受态,是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物,只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体,能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术,虽然对其基本原理仍然不完全清楚,但是比较认同的看法是,细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀形成球状,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,之后细菌在富含营养的培养基上生长,球状细胞复原并分裂繁殖,重组质粒在转化的细菌中,表达目的基因,因而在选择性培养基平板中,可以选出阳性细菌转化子。Ca2+处理的感受态细胞,一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小,转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是:简单快速,重复性好,菌株适用范围广。 另外,电击法也可用于转化过程,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依赖短暂的电击,利用瞬时高压电流(数千伏特)处理细胞悬浮液,使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化,产生微孔,悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部,转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效

大肠杆菌感受态

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。本实验室一般用TSS法制备感受态。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外

大肠杆菌生化实验

细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 1葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌,有气泡并变为黄色;右边为大肠杆菌, 2V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP,图为右边为大肠杆菌,溶液变红,为阳性菌。 3吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌,出现红色阳性菌;右边为产气杆菌,颜色不变,阴 性菌。 4硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液,如过溶液变红说明有亚硝酸盐,为硝酸盐还原阳性菌,如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂,如果变蓝,说明此菌为阴性菌;如果不变色,说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌. 右下方恶臭假单胞菌,加入革里斯试剂A、B后不变色,再加入二苯 胺试剂后变蓝,为阴性菌;左上方大肠杆菌为红色。 5柠檬酸盐实验 直接观察斜面,斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌,不变者为阴性菌.

左边产生蓝色,产气杆菌阳性;右边为大肠杆菌,阴性。 6明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌. 左边为大肠杆菌,出现透明圈,阳性;右边为枯草杆菌,阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌.

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备 标签: tr..,Ca..,co.. 分类:细胞技术> 感受态细胞 来源: 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 (R-,M-),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基

大肠杆菌

大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核,细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同,细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚,无荚膜,多产生外毒素;革兰氏阴性菌细胞壁薄,有荚膜,多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害,但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统,都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用,它的质粒是最常用的运载体,它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物,但不一定需要外界补充,有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌,培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤: 1.称量:准确称取各成分。蛋白胨0.5g,酵母提取物0.25g,氯化钠0.5g,加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2.溶化:加热熔化,用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂,整个过程不断用玻棒搅拌,目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3.调pH:用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4.灭菌:在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基,加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内,1kg压力灭菌15min。

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构,使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性,原因是其基因发生了改变,产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下,细菌的基因突变率很低,而且突变是不定向的,因此在自然条件下,想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时,其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时,能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线(UV)有强烈的吸收作用,尤其是碱基中的嘧啶,它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此,紫外线通常作为诱变剂,用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛,诱变剂量越大,突变率高,诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键,过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下,菌株发生不定向的突变,想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株,因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变,则该菌株不能在抗性培养基上正常生长,只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外,对菌株还有较强的致死作用,因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此,通过本实验的操作,在合适的照射剂量的设置下,比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率,并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上,能了解诱变育种的机理和方法,为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种:大肠杆菌 仪器:超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂:牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml)、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基(400ml): 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min,倒平板,4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml):含抗生素50mg/L。(卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA,阻断细菌蛋白质的合成。) 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml),按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌,取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中,充分震荡混匀,倒平板,2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液(106 ~ 108个/mL) ①固体培养:大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基,37℃培养24-48h。 ②菌悬液:用适量生理盐水刮洗菌落,倒入一个无菌小三角瓶(或试管)中,充分振荡使菌

大肠杆菌论文

走近大肠杆菌 姓名:*** 班级:****** 学号:***** 上传时间:2012.11.11 引言 大肠杆菌对我们来说并不陌生,当我们出生的那一刻,大肠杆菌就随着母乳进入了我们的体内,记得上生物课时,老师再讲微生物是说到:“我们的肠道里住着很多的大肠杆菌。”当时心中很惶恐,应为在我的印象中,细菌都是有害的,而随着年龄的增长也慢慢了解了,大肠杆菌在正常的栖居条件下是不会致病的,而且,还会帮我们减少蛋白质分解所产生的有害物质,但是这位栖居者有时也会变成一枚炸弹,但我们不注意饮食、生活卫生时,它就会给我们带来疾病,总之,这位伙伴成为了我们一生不可缺少的,让我们更好地了解它,在有限的生命中与它好好相处。 摘要 原核生物、细菌、致病性、预防感染、生物技术 大肠杆菌的认识 肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的,在相当长的一段时间内,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,是非致病性的。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼畜(禽),常引起严重腹泻和败血症,根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌属于细菌。 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,周身鞭毛,能运动,无芽孢,是原核生物具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核但有拟核,细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。大肠杆菌一般多不致病,为人和动物肠道中的常居菌,能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(原理) 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法),该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase(DNA酶)的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。

餐饮企业食堂餐具碗筷如何解决消毒杀菌和大肠杆菌超标的问题

餐饮企业食堂餐具碗筷如何解决消毒杀菌和大肠杆菌超标的问题 餐具消毒企业、酒店、政府机关、学校、餐馆、家庭是为我们日常提供生活工具和服务的重要的组成部分,餐具的卫生情况关系到我们自身的身体健康。严格来说,餐具表面不能有任何残留物,如果菌落总数严重超标,说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求,很容易患痢疾等肠道疾病,可能引起呕吐、腹泻等症状,危害人体健康安全。目前较多的消毒餐具存在的问题是大肠杆菌超标,“餐具表面有大肠杆菌,就意味着被粪便污染,人在食用后,轻则腹泻、肠胃感染,重则会导致食物中毒”。 什么是大肠杆菌? 大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而是一群细菌,该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道,需氧与兼性厌氧,不形成芽孢;在35~37℃条件下,48 小时内能发酵乳糖声酸产气,革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主,埃希氏菌属教俗称为典型大肠杆菌。除直接来自粪便外,也可能来自典型大肠杆菌排出体外7~30 天后在环境中的变异。大肠菌群是粪便污染的指标菌,该菌群的检出表示可能受到粪便的直接或间接的污染。使用有大肠菌群的餐具,可能会引起人体腹泻、肠胃感染等不适症状。 餐具碗筷上的大肠菌群超标对人体的危害: 使用大肠菌群超标的餐具碗筷,最明显的症状就是腹泻,严重点的还会导致肠道外感染,抵抗力下降,容易感染其他的疾病。

腹泻:某些大肠杆菌能引起人类腹泻,其中肠产毒性大肠杆菌会引起婴幼儿和旅游者腹泻,出现轻度水泻,也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性,一般2~3天即愈,营养不良者可达数周,也可反复发作。肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死。细菌侵入肠道后,主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。此外,肠出血性大肠杆菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎,可产生志贺氏毒素样细胞毒素。 肠道外感染:多为内源性感染,以泌尿系感染为主,如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等。婴儿、年老体弱、慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者,大肠杆菌可侵入血流,引起败血症。早产儿,尤其是生后30天内的新生儿,易患大肠杆菌性脑膜炎。 如何对餐具碗筷彻底消毒?清除大肠杆菌? 目前国内外餐具消毒方法一般有两类:一类是物理消毒法,即利用热力灭杀原微生物细菌常用的有煮沸、蒸汽、红外线等;另一类是化学消毒法,就是利用化学消毒剂杀灭病原微生物。 在古代,人们普遍使用银器、铜器作为酒具、餐具或装饰品;据资料记载,1千克水中,只要含有10亿分之几克的银,就能杀死大量细菌。SARS和禽流感等传染性病毒的出现造成了人们对公共卫生安全问题的恐慌,传统消毒和杀菌方法存在诸多缺点,主要表现在: 1、应用领域窄,条件限制多 2、抗菌性能差,缺乏持久性 3、不断出现高抗性菌株,影响人体健康 4、消毒不彻底 5、投入大、成本高 随着人们生活水平意识的不断提高,人们已经逐步懂得了餐具碗筷清洗消毒的重要性。对餐具专用消毒杀菌剂的研究和应用也日趋广泛。但在实践生产中,实际情况比较复杂,对杀菌剂的要求很高。单一杀菌剂都存在着一些固有的缺陷,穿透有机物能力弱,受环境温度影响大,使用浓度高。当微生物存在空间,环境、容器、管道等,病原微生物数量大、种类多,温、湿度变化大,被消毒杀菌物品表面结构各异,水质(硬度、酸碱度)差异大时,具有无毒、广谱抗菌性、抗菌时效长、不产生耐药性、不会造成二次污染的消毒剂在此时应运而生。 拜科特瑞经过多年与欧美的餐饮企业的共同努力,研究了餐饮行业餐具消毒杀菌专用剂,专为餐具消毒企业、酒店、食堂环境、空间、容器、消毒池、管道等消毒清洗设计方案,配合空间、环境、物表等可达到食堂消毒灭菌的要求,是目前最高效最安全的消毒灭菌方法,可以杀灭有害病菌、有害微生物(大肠杆菌),并且无任何药物残留、无刺激性味道。 浸泡消毒法:用“拜科特瑞”BT50D餐具消毒杀菌专用剂,按比例加入干净清水浸泡,特别适合于不耐高温的餐具,如:啤酒饮具等会遇热爆裂、变形等产品,浓度要按规定要求,浸泡时间要充足,一般需15~30分钟,浸泡后再用清水冲洗干净,最好用流动水冲洗,可以有效快速的灭杀大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、白色念珠菌等细菌和病毒,是目前最高效最安全的消毒灭菌方法,并且无任何药物残留、无刺激性味道。 使用方法 喷洒:对空间、空气、物体表面彻底的消毒、杀菌、去味。 擦拭:对物体表面擦拭表进行消毒、杀菌、去味。 洗涤:在给物体(洗涤工具、材料、抹布、设备)清洗时,加入水中,对物体消毒、杀菌、去味。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主(受体细胞)使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态:即指受体或者宿主最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一,如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107

大肠杆菌培养实验报告

大肠杆菌培养实验报告 篇一:大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理:国标法操作的原理 实验器材: 培养箱,10只移液管,1只250ml锥形瓶,5只大试管,试管架,4个平皿,500ml大烧杯1个,电子天平,纱布,脱脂棉,灭菌锅,PH计或PH试纸,100ml量筒,橡皮手套,超净台 实验药品: 磷酸盐缓冲液,蒸馏水,LB培养基,琼脂,5%NaOH,5%HCl 实验步骤: 一: 10只移液管,1只250ml锥形瓶,5只大试管,4个平皿,500ml大烧杯1个,100ml量筒进行洗涤,然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干,完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台,紫外消毒30min 二: 1:用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2:用量筒量取125ml的蒸馏水

加入该锥形瓶中,制成培养基。 3:用棉花堵住该锥形瓶的瓶口,用牛皮纸包住瓶口,用橡皮筋扎牢,再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4:灭完菌后放入超净台中备用。 三: 1:取1只无菌250ml锥形瓶,用量筒向其中加入49ml PBS 2:将1ml样品加入到该锥形瓶中,摇匀制成1:50的细菌溶液。 3:取4只试管,编号1—4 4:用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5:用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6:用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中,摇匀 7:用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取1ml细菌溶液,加入3中,摇匀......以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9:取4只平皿,编号1—4 10:分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取1ml的菌液置于4只平皿中,加入45—50摄氏度温度下的培养基,约15mm厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀;待培养基冷凝后倒置。

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