拟南芥
实验一拟南芥种植和形态观察
一、实验原理
拟南芥属(Arabidopsis thaliana）十字花科，被子植物门，双子叶植物纲。二年生草本，高7～40厘米。基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。长角果线形，长1～1.5厘米。花期3～5月。我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的优点是植株小（1个茶杯可种植好几棵）、每代时间短（从发芽到开花不超过6周）、结子多（每棵植物可产很多粒种子）、生活力强（用普通培养基就可作人工培养）。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组的1/80，这就使克隆它的的有关基因相对说来比较容易。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。由于上述这些优点，所以，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料：拟南芥种子
（二）试剂：
PNS营养液母液配方
母液1：1M KNO3 101.1g
母液2：1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15 g
母液3：1M MgSO4˙7H2O，246.48 g
母液4：20mM Fe.EDTA：
FeSO4 5.57g
EDTA 7.45g
注意先各自配成溶液，再混合。
母液5：1M磷酸缓冲液（pH5.5）：
磷酸二氢钾 130.4g
磷酸氢二钾 9.12g
母液6：MS 微量元素
硼酸 0.434g
硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626g
CuSO4˙H2O 0.0798g
ZnSO4˙7H2O 0.172g
NaMoO4˙2H2O 0.0432g
NaCl 0.585g
CoCl˙6H2O 0.00129g
以上母液均配至1L，配制时使用灭菌的双蒸水。配制后4℃冰箱中保存备用。
人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合。
（三）仪器设备：培养皿，镊子，托盘，保鲜膜，花盆，人工气候箱。
三、实验步骤
1. 将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。
2.人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。
四、实验结果
五、思考题
1.绘制拟南芥的株高的生长曲线。
2.为什么说拟南芥是模式植物？
3.拟南芥的特点？
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥
拟南芥种植及处理基本方法
培养基 MS培养基 (Sigma公司) B5培养基 (pH 5.5) Content mg/L Content mg/L Content mg/L KNO3 2500 ZnSO47H2O 2.0 Nicoti nic 1 CaCl22H2O 150 H3BO3 3.0 Thiami ne HCl 10 MgSO47H2O 250 KI 0.75 Pyri ndox ine 1 NaH2PO4'H2O 150 Na2MoO42H2O 0.25 m-I no sitol 100 FeSC47H2O 27.8 CoCl26H2O 0.025 Glyci ne 200 MnSO4H2O 10 Na2EDTA 37.3 Ki netin 0.1 CuSO45H2O 0.025 IAA 0.1-1 改良的1/4 Hoagland 培养液(mM, pH6.0): Content mM Content mM KNO3 1.25 Zn SO40.002 Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050 MgSO40.75 KCl 0.050 KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7°24 0.075 FeSq 0.072 CuSO40.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1 2植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 o 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 C，16/8 h的光照培养间中生长。 3拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/ 皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagla nd培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换 一次培养液。 5拟南芥T-DNAS入突变体的筛选方法 到网站输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB : LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP + RP, BP+ RP扩增基因组DNA 方法: 1）将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。 2） DNA提取缓冲液的配制： Genome\ /Flankira SaaiifincfiL Pa N pZme Exl5Ext3pZcne EPa w
拟南芥植物组织培养
拟南芥植物组织培养 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】
拟南芥组织培养 一、种子消毒： 方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸 馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。 方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。 消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。 方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。 二、选用的培养基 选用1/2MS培养基对种子进行培养。（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。 MS培养基配料表： 三：接种方法 拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。（如不行，可适当添加琼
脂）。 四、培养得无菌苗 接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。3天后即可取材用于器官离体再生实验。萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。（短日照光照条件8小时光照，16小时黑暗，长日照光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度均为22℃。）此处获得无菌苗的时间有异议，应该为2--3周？ 五、外植体的选取 B5 + 5 mg／L2 ，4-D+ 0 .5 mg／L KT 培养基上诱导愈伤组织,莲座叶作外植体出愈慢，出愈率低，愈伤组织质量较差；叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快，且愈伤组织质量好，后期易分化。 由于叶柄、下胚轴相对较短，难于收集，为了便于操作，减少污染，试验中采用根作为外植体诱导愈伤组织和诱导分化试验。 所取外植体的大小为5mm左右，不宜过大或过小。 滴落种子形成的两条直线位于平皿的上半部，可以避免伸长的根被培养基中渗出的水分所淹。无菌苗的苗龄太短不易得到足够多的外植体，苗龄太长则外植体脱分化的时间明显延长，最适苗龄以2 --3 周为宜。 六、胚性和非胚性愈伤组织的诱导 1、以MS 为诱导培养基, 附加2, 4一D 2mg/L,KT、NAA各L,水解酪蛋白300mg/L，6%蔗糖，琼脂， 2、接种幼穗长度为1--2cm 左右, 置于2 8 ℃恒温箱内暗培养。
拟南芥种植方法
拟南芥种植方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
培养基上点种子： 1.种子处理 1.1 种子消毒处理 在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。 1.2 点样 将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。 1.3 春化 种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。 土培法： 1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。 2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子） 3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后
就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。 4.植株生长条件的控制 幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。 浇水注意事项： 1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿； 2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水； 3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起； 4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水； 5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来； 6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等； 7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。 注：温室202光照时间：9:00—19:00为短日照，有利于营养生长
营养胁迫对拟南芥4CL基因表达的影响研究
第38卷 第3期2011年3月 湖南大学学报(自然科学版) Journal of H unan U niversity(Nat ur al Sciences) Vo l.38,N o.3 M ar 2011 文章编号:1674 2974(2011)03 0073 04 营养胁迫对拟南芥4CL基因表达的影响研究* 向 静1,2,林建中1,赵小英1,唐冬英1,刘选明1 (1.湖南大学生物学院,湖南长沙 410082;2.长沙大学生物工程与环境科学系,湖南长沙 410003) 摘 要:将拟南芥分别播种在N,P,K,Ca,Mg,Fe和Sucro se营养元素缺乏的培养基 上,在长日照(16h光照/8h黑暗)22 条件下培养10d,不同营养元素缺乏的培养基中的 拟南芥幼苗表现出相应的的表型.通过G US的组织化学染色和采用Q PCR检测分析 4CL1,4CL2,4CL3基因在不同营养元素缺乏植株中的表达差异,研究4CL对不同营养元素 胁迫的响应.研究结果表明钾元素的缺乏对参与木质素和黄酮类合成相关的4CL基因有诱 导作用. 关键词:营养;胁迫;拟南芥;4CL基因 中图分类号:Q786 文献标识码:A Effect of Nutrient Stress on the Ex pression of4CL Gene in A rabid op sis Seedling s XIANG Jing1,2,LIN Jian zhong1,ZHAO Xiao ying1,TANG Dong ying1,LIU Xuan ming1 (1.School of Biology,Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082,China; 2.Dept of Bioengineering and Environmental Sciences,Changsha Univ,Changsha,H unan 410003,China) Abstract:Seeds o f A r abidop sis w ere planted separately in the medium of different nutr ient element de ficiency of N,P,K,Ca,M g,Fe and Sucro se,in the conditio n of22 long day(16h lig ht/8h dark)10 days.T he A r abid op sis seeding s had the corresponding phenoty pe.H isto chemical assay of G US activity and Q PCR were used to analyze and examine the ex pr ession o f the4CL1,4CL2and4CL3gene.T he re search results hav e show ed that the po tassium(K)can induct the ex pression of the4CL gene involved in the synthesis pathw ay o f the lig nin and flavo noid. Key words:nutrients;stress;A rabidop sis;4CL gene 在植物整个生长期内所必需的营养元素有碳、氢、氧、氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、钼、硼、氯等16种.它们在植物体内的生理作用概括为两类:一类是细胞结构物质的组成成分,如非金属离子碳、氢、氧、氮、磷、硫等是组成糖类、脂质和蛋白质等有机物质的元素;另一类是对生命的代谢活动起调节作用,如金属离子镁、锌等促进酶的活性,调节细胞的渗透,影响原生质的胶体状况和膜的电位平衡等.它们是植物新陈代谢、生长发育所必须的.每一种元素在植物的生命活动中,都有其特殊的生理作用,缺乏任何一种必需元素都会引起特有的生理症状. 植物在与不同环境相互作用的长期进化过程中,逐渐形成了对外界压力的抵抗能力.植物可以通过诱导次生代谢产物的积累提高对逆境的抗性,积累的次 *收稿日期:2010 06 30 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30770200);湖南省教育厅资助项目(07C132);长沙大学科研基金资助项目(CDJ J08010201)作者简介:向 静(1975-),女,湖南平江人,湖南大学博士研究生,长沙大学副教授 通讯联系人,E mail:s w_x ml@https://www.360docs.net/doc/ff14640554.html,
LYH综述模式植物拟南芥的初步研究
本科毕业论文(设计)文献综述 题目模式植物拟南芥的初步研究 姓名刘云慧学号062101033 专业生物工程 指导教师陈春丽职称副教授 中国·武汉 二○一○年五月
模式植物拟南芥的初步研究 摘要：拟南芥（Arabidopsis thaliana）属于十字花科(Brassicaceae)。由于其具有其他植物无法替代的特点，拟南芥是一种著名的研究有花植物的遗传、细胞、发育、分子生物学研究的模式植物。另外，拟南芥基因组是第一个经过完全测序的高等植物基因组,这就奠定了拟南芥研究的必要性和重要性。在过去的20年中，拟南芥作为模式植物广泛用于植物生命科学研究。 关键词：拟南芥；模式植物；基因组；研究 拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科，与白菜、油菜、甘蓝等经济作物同属一科。拟南芥本身并无明显的经济价值，但拟南芥的全基因组测序工作于2000年完成，是个其成为植物界第一个被完整测序的物种[1]，使得它越来越多地被作为一种模式生物加以研究。 拟南芥的研究历史 在自然界中，拟南芥主要分布于温带，一般生长在野外干燥的土壤中。历史上对拟南芥科学研究的记载最早可追溯至16世纪，由德国学者Thal在德国北部的哈茨山区中首次发现并记录了这个物种。19世纪分类学家Heynhold将其命名为Arabidopsis thaliana。现在人们在世界各地共收集到750多个拟南芥生态型，这些生态型在形态发育、生理反应方面存在很大差异。在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是Landsberg erecta(Ler)、Columbia(Col)、Wassilewskija(Ws)。在1873年，Braun报道了他在柏林郊外发现的一种拟南芥突变体，这可能是拟南芥研究历史中所发表的最早一项在分类学之外的研究工作。Laibach在1907年首次报道的对拟南芥染色体的研究并最终确定了拟南芥具有5条染色体。Laibach于1943年详细阐述了拟南芥作为模式生物的优点，并在他之后的工作中大力推动了对拟南芥的研究。1986年，Meyerowitz实验室首次报道了对拟南芥中一个基因的克隆。同年，Horsch实验室报道了根癌农杆菌介导的T-DNA对拟南芥进行的遗传转化[2]。在之后的几年中，相继报道了T-DNA插入突变基因的克隆、基于基因组图谱的基因克隆。这些突破使人们逐渐认识到拟南芥作为实验材料对植物生命进行探索的价值。 1.拟南芥的特点 拟南芥作为一种模式植物,具有其它植物无法替代的优点:(1)生长周期短, 整个生长周期,从发芽、莲座叶的长成,到主花序的形成、第一粒种子的成熟可在6周内完成;(2)基因组小,125Mbp(水稻基因组430Mb,玉米基因组4500Mb),约25900个基因;(3)基因组仅有5条染色体,113亿个碱基对,其染色体数量是玉米的1/20;(4)具有双子叶植物的所有特性,整个生命周期同样经过细胞的分裂、生长发育、分化、衰老、死亡等一系列生物学现象;(5)有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源;(6)在有限的空间内可大量种植，体形小,占地少，成熟植株一般15cm～20cm高,莲座叶长度不超过5cm；(7)收获大量的种子每株拟南芥可产生多达5000粒种子；(8)生活力强，用普通培养基就可作人工培养[3]。由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料。
拟南芥Arabidopsis
拟南芥的基础探索 生科二班 李俊龙 20131678 一、拟南芥属的种类及分布 拟南芥属拥有众多种类，包括拟南芥、大夏拟南芥、短茎拟南芥、毛果拟南芥、柔拟南芥、直立拟南芥、西藏拟南芥等等。 这里就不介绍世界范围拟南芥属的分布了，下图标出了中国国内拟南芥属的分布[1]。 二、拟南芥的形态 拟南芥Arabidopsis （L.） Heynh ，拟南芥属，十字花科，白花菜目。双子叶植株，叶片互生，总状花序，花萼、花瓣各4片，雄蕊6枚，4长2短，子房 有两层心皮，中间是假隔膜，高度只有3Ocm 左右[2]。 拟南芥 拟南芥花样 拟南芥果实
三、拟南芥的培育 拟南芥生长的适宜温度白天为22℃-24℃,夜温最好比日温低2℃,适宜的湿度为60-70%,生长期适宜的光强为150μmol·s-1·m-2.拟南芥在日照长于12小时下才会开花,一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳。 1．准备发苗培养基: 1/2 MS,Sucrose:10g/L,pH5.7,agar:0.7-0.8%.灭菌后,在超净台上分装入培养皿. 2．种子消毒有两种方法： 一种是湿法NaClO水溶液消毒:种子放在 1.5ml试管中, 加入1ml10%NaClo,混匀,消毒5min,用无菌水洗5次以上(用移液枪吸)，湿法消毒后的种子要马上播；另一种是干法8%NaClO 酒精溶液，此时需用95%的酒精来配制8%NaClO 酒精溶液。在8%NaClO 酒精溶液中消毒6-8min。然后用无水酒精洗种子5次以上，吸干无水酒精后，在超净工作台上吹干透后再密闭保存。 3．播种： 对湿法NaClO水溶液消毒种子用移液枪将种子吸到培养皿上,可多加些水,将种子铺均匀(不要太密,太密根缠在一起不好移苗),用移液枪吸干水,在超净台上让培养皿干了；对干法消毒的种子，用无菌牙签将种子点播到培养基上。用Parafilm密封盖子后,请用牙签或镊子在上下两处各打4个小孔以通气。最好是在每皿<30株这样的密度下,让其生长两周后再移苗. 4.移苗及后续管理: 如果培养基质用花泥，将花泥装入花盆,将花盆放入有水的塑料周转框中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来,待花盆中的基质湿透后即可移苗.小心轻轻用镊子从培养皿中连根取出小苗,把苗种入花泥中.移苗结束后,用保鲜膜覆盖1-2天后揭膜，如果苗很弱，则在此基础上还需多覆盖1天.在花泥中种植时，苗期不需要添加营养液，开始抽苔时请及时添加营养液，一般需要添加2次，每次加入1升拟南芥营养液，2次添加最好间隔一段生长时期（7-10天），由于花泥有较好的吸附缓释能力，对间隔时间长短没有严格要求。如果盆栽密度较大或框中花盆数量较多则需要多加一次营养液。对于花泥种植来说，不要在塑料周转框中始终保持水层,一次吸足水分后，可以隔4-6天后再加水让其吸足水分，在开始收籽期,不再需要过多的水分,可保持塑料周转框干燥,此时每隔7-10天加一次水即可. 5．收籽: 在种荚变黄,变干时可以收籽.将种子抖落在纸上,用金属滤网过一下以除去杂质,将种子装入写了标记的小纸袋中,放于干燥的环境中让种子进一步干燥后,封存于1.5ml试管中，切记越干越好，长期保存的种子必需要干燥保存到4℃[3]。 拟南芥作为一种模式植物，它的研究将会对植物界乃至生物界都将产生很大程度的影响。 参考文献 [1]《石河子大学学报（自然科学版）》2001期02版王绍明李学禹 [2]《拟南芥》2004.6 曹仪植 [3]《植物学通报》2004年02期李俊华张艳春徐云远种康王辉
几种拟南芥突变体鉴定方法
HY5‐215 The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and?hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995. In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processing In hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an a HY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。 Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0 (https://www.360docs.net/doc/ff14640554.html,/dcaps/dcaps.html)
HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8 PsiI: 但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。在设计的引物有2 个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。 HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8 AluI:
拟南芥突变体的筛选与鉴定综述
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述 系别林学与园艺学院 班级园艺102班 姓名唐辉 学号103231228 答辩时间年月
新疆农业大学林园学院 拟南芥突变体的筛选综述 唐辉指导老师：王燕凌 摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试 验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na 2SeO 3 、钾、硒、NaCl等化合物或者化学 元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。 关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究 Screening Summary of Arabidopsis Mutants Tang Hui Instructor:Wang Yanling Abstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screening
拟南芥
拟南芥培养方法的进展研究 拟南芥( Arabidopsis thaliana) 是十字花科拟南芥属植物, 虽然没有经济价值, 但具有生育期短, 植株个体小及基因组小等特点, 因而长期以来一直被用来作为分子生物学和传统遗传学研究的模式 实验材料, 作为高等植物中具有最少基因组的物种,在科学研究中的地位也是极为重要得。为了与国际接轨, 近年来国内已引入了拟南芥作为实验材料。室内培养不仅可以得到试验所需的材料,也可以打破自然条件的限制对拟南芥进行各种诱导,为拟南芥新品种的培养和种性的改良提供便利条件,掌握拟南芥室内培养技术对顺利开展植物发育生物学的研究具有重要的意义。但是, 拟南芥属于较难培养的植物,许多因素制约着它的正常生长和发育，比如，拟南芥种子特别小, 幼苗很弱, 易夭折, 给它的培养带来一定的困难。目前,国内很少有实验室具备国外人工气候室培养拟南芥的全方位调控条件, 在拟南芥 培养方面存在成活率低、培养周期长等问题。因此, 掌握拟南芥的培养技术非常重要。 拟南芥室内培养方法研究 拟南芥室内培养一般从种子春化开始,经历消毒、育苗、移栽、后期管理、种子收集及保存等阶段。通常采用水培和土培两种方法。1种子的春化 春化作用(verna lization)是某些高等植物具备成花能力所必需的,即通过适当长度和强度的冷处理诱导开花抑制蛋白基因沉默,从而使植物
具备开花能力.近年来的研究已经表明春化过程中特定抑制蛋白表达沉默的原因部分是由于染色体上特定位点的组氨酸的共价修饰. 种子播前需在湿润条件下置4℃冰箱内低温处理3~4 d，对于已在冰箱内保存一个月以上的种子可不必低温处理。 2种子的消毒 拟南芥种子的消毒主要是用次氯酸钠溶液和酒精，不同浓度的溶液对种子上的病毒和细菌有不同的杀灭作用，结合文献资料，在本人第二课堂的实验中（《拟南芥三种培养方法的比较》），对比了三种不同的消毒方法，探索消毒方法旨在寻找出一种对拟南芥种子伤害最小，并且最有效的消毒方法。三种方法分别如下 2.1 70%的酒精消毒处理5分钟，然后用2.6%的次氯酸钠溶液消毒处理10分钟 2.2 75%的酒精消毒处理1分钟，1%的次氯酸钠溶液处理10分钟 2.3 5%的次氯酸钠溶液消毒处理5分钟。 实验用品 器材：培养皿，记号笔，封口膜，酒精棉，废液缸，移液枪（配枪头多个），EP管，酒精灯，镊子，吸水纸，玻璃棒，电热套，无菌操作台，高压湿热灭菌锅。 试剂：MS培养基原料(见附录)，次氯酸钠溶液，酒精（实验室的次
植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法
植物材料的固定、包埋和制片 一、植物材料的固定和包埋 在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。 300 ml量为例） 1、先打开一个60℃左右的水浴锅。 2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。 3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡 箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。 4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包 埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。 5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。 6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。 7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。 二、固定材料 1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好， 尽可能去除无用多余的部分。 2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不 好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。 3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间， 以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目 的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起； 抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在 固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见， 如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。 4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。 5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。 注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及 按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。 0.85% NaCl 冰浴，30 分钟 2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时 3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时 4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜 50%乙醇后，材料应开始脱色。 /水 4℃，5小时 2、100%乙醇 4℃，5小时 3、100%乙醇 4℃，过夜 注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥 1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。营养土和蛭石1：1比例混合。 2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。总之盖膜时间自己灵活掌握。 3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。要转的每个基因的每个载体都是先2ml少量摇菌，然后按1：100的比例200ml大量摇菌。 4 在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果（因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率，本身阳性率已经很低了，再降低就更不爽了），把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵
拟南芥培养Protocol
拟南芥培养Protocol 拟南芥生长的适宜温度白天为22℃-24℃,夜温最好比日温低2℃,适宜的湿度为60-70%,生长期适宜的光强为150μmol·s-1·m-2(6支36W日光灯下35cm处测得)。幼苗期不耐高光强,可适当遮荫.光质也较重要,应选用植物生长专用的日光灯(如荷兰产TLD型Philip豪华直管荧光灯).拟南芥在日照长于12小时下才会开花,一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳 1.准备发苗培养基:1/2 MS,Sucrose:10g/L,pH5.7,agar:0.7-0.8%.灭菌后,在超净台上分装入培养皿. 2.种子消毒:种子放在1.5ml试管中, 加入1ml10%NaClo,混匀,消毒5min,用无菌水洗5次以上(用移液枪吸). 3.播种:用移液枪将种子吸到培养皿上,可多加些水,将种子铺均匀(不要太密,太密根缠在一起不好移苗),用移液枪吸干水,在超净台上让培养皿干了,密封盖子,4℃暗处理两天后,移到光照培养箱(22℃,光周期12h),若种子较密,则在光照培养箱中生长1周后即可移苗,否则根长太长后易缠在一起,但太小的苗移栽后,需适当遮荫.最好是在每皿<30株这样的密度下,让其生长两周后再移苗. 4.移苗:将蛭石与珍珠岩按(3:1)的比例混好,装入花盆,将花盆放入有水的塑料周转框中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来,待花盆中的基质湿透后即可移苗.小心轻轻用镊子从培养皿中连根拉出小苗,把根平放在蛭石表面,用镊子把根轻轻压下.移苗结束后,用保鲜膜覆盖3-4天后揭膜.从苗期直至开花,可在塑料周转框中始终保持1-3cm的水层,在开始收籽期,不再需要过多的水分,可保持塑料周转框干燥,此时每隔2-3天浇一次水即可.整个生长期可浇3-4次拟南芥营养液. 5.收籽:在种荚变黄,变干时可以收籽.将种子抖落在纸上,用金属滤网过一下以除去杂质,将种子装入写了标记的小纸袋中,放于干燥的环境中让种子进一步干燥后,封存于1.5ml试管中.
模式植物拟南芥遗传应用综述
模式植物拟南芥遗传应用综述 摘要：拟南芥作为一种比较经典的“模式植物”，在研究相关的其他生物的生命活动规律中，因其结构简单，相似性高，而表现出其他生物无法比拟的优越性，成为了科学家们最理想的研究对象。本文分别从问题的提出、历史的发展、现状的分析和前景的预测四个方面对拟南芥在科学界的地位及作用进行了综合性的总结和叙述。 关键词：拟南芥；模式植物；遗传；应用 一、前言 纵观过去和现在，科学界对拟南芥的重视程度以及拟南芥在生物遗传学的地位有着巨大的差异。尤其是近几年来，科学界对拟南芥的热衷程度日渐加深，完全不同于90年代以前的冷淡。而且现在的科学家们对于拟南芥的研究方向是各种各样的，越来越广泛。本文就是对拟南芥在不同研究课题下所起的作用、在遗传应用上所表现的优越性进行一个总结性的综述，探讨产生此种现象的原因，从而得出此种作物在生物学上的大致研究方向，并作出相应的前景预测，让我们对它的研究潜力进行进一步的挖掘，让它的贡献更大化。此外，也希望通过本文，让大家对拟南芥在过去和现在的发展有一个更加清楚的了解，把握住大致的脉络，并对今后的研究提供相应的指导和帮助。 二、历史的发展： 虽然孟德尔以豌豆为实验材料开创了现代遗传学, 后来麦克林托克又研究了玉米, 发现了惊人的“跳跃基因”, 但总的来说, 这些植物都不是研究分子遗传学的良好材料。高等植物通常需要较大的种植面积, 特殊的条件, 而且繁殖周期长。更糟的是, 植物的基因组通常都很大（例如, 玉米的基因组比果蝇的大两个数量级）, 使人们难以分离到特定的基因[1]。因此, 虽然K’Roberts早就认为植物是研究发育的良好系统,但迄今为止, 在研究植物的细胞分化和形态发生等方面一直进展迟缓。长期以来, 分子生物学家们一直希望能在植物中找到象动物中的黑腹果蝇(Drosophila me-lanogaster)那样繁殖快, 易于在实验室中培养,并能用分子生物学和遗传学技术进行广泛研究的实验材料,以便从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。1985年4月13-19日在美国科罗拉多州召开的植物遗传学UCLA上, 科学家们宣布, 他们终于确定了植物王国中的“果蝇”—拟南芥，而这也奠定了拟南芥在将来时期的地位。 2.1拟南芥的研究进度以及介绍 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 是一种极普通的草本植物，常用俗名鼠耳芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的“模式”植物。近年来，植物科学中许多有价值的发现几乎都是以拟南芥为实验材料取得的，因此它被誉为植物界的“果蝇”。拟南芥具有以下主要特点:(1)形态个体小，高度只有30 cm左右;(2)生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右;(3)种子多，每株每代可产生数千粒种子;(4)形态特征简单;(5)基因组小，只有5对染色体。早在1907年，Strasburger就利用拟南芥研究了染色体的连续性。他的学生Laibach于同年发现拟南芥间期核中的异染色质体的数目与其中期染色体数相同，这种现象在植物界中是比较少见的。拟南芥的染色体数目为2n=10，其
拟南芥胁迫处理条件
常见拟南芥胁迫条件处理方法： 盐胁迫处理方法：将野生型和转基因植株移入营养土中，放在培养箱中培养，每隔2天用1/8Hongland营养液浇灌，生长4周后，用含50mmol.LNaCl的1/8Hongland营养液浇灌，每隔一天以50mmol.L的浓度递增，最后到达终浓度0,50,100,150,200mmol.L，保持终浓度7天后，测定相关指标。每个指标至少6个重复。 干旱胁迫处理：将野生型与转基因植株分别种植在营养土中，用1/8Hongland营养液浇灌至田间最大持水量培养4周。然后停止浇水，使土自然变干，直到7天后所有植株出现萎蔫，在第8天再回复浇水至田间最大持水量。胁迫期间，每隔1天测定相关指标，每隔指标至少6个重复。通常测定指标包括：地上部分干重，钠钾钙含量，叶片相对含水量，叶片质膜透性（相对导电率），MDA（采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量），净光合速率。 PEG胁迫处理：PEG抑制主根生长：在40%PEG处理下Col-0和Ws主根的生长完全被抑制，并且Col-0有25%的主根根尖发生死亡；当PEG浓度达到50%时，Col-0全部主根根尖都已死亡，Ws的的幼苗主根根尖有86%发生死亡。Ws对PEG抑制主根生长及引起死亡发生的作用的抗性要强于Col。对50%PEG处理的Col-0的幼苗主根根尖死亡情况的分析可知，死亡的高峰期在第二天，有70%的主根根尖发生了死亡。经过TUNEL和DNA ladder检测发现这种死亡是PCD，在1.5天PCD的发生的反应最强烈。 在PEG胁迫后恢复时，也可诱导主根根尖产生PCD，且表现得比接受干旱胁迫敏感。在40%PEG处理时其死亡率仅为25%，而恢复后其死亡率增加到87%；将50%PEG处理1天还未死亡幼苗进行恢复，8小时后主根根尖全部发生死亡。侧生根产生的位置与开始受胁迫浓度有关，浓度越高其离根尖最近的侧根发生位置越远离根尖。经过40%PEG处理的幼苗在恢复时，离根尖最近的侧根发生的位置有82%集中于0-1/2（侧根到根尖的距离/主根长），其余的幼苗离根尖最近侧根发生位置介于1/2-3/4之间。而将50%PEG处理的幼苗在恢复时，离根尖最近的侧根发生的位置集中于3/4-1，剩下的发生位置介于1/2-3/4之间。长时间的干旱对拟南芥的恢复不利：50%PEG处理Col-0幼苗的时间长于15天后，在恢复时植株将会死亡，但是在50%PEG处理60天时幼苗仍然没有死亡。 拟南芥PEG胁迫处理：以拟南芥ATHK1基因T-DNA插入所产生的缺失突变体和野生型WS(Wassilewskija)生态型为材料，分析了它们在生理和基因表达方面的差异。结果表明突变体的离体叶片失水率明显大于野生型；在30％PEG-6000胁迫后，野生型和ATHK1突变体的细胞膜离子外渗率比胁迫前分别增加了50％和80％。PEG胁迫48h时突变体的萎蔫程度明显大于野生型WS。以上结果说明ATHK1突变体的抗渗透胁迫能力低于野生型，即ATHK1基因参与了拟南芥适应逆境的调节反应（ATHK1基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程） PEG胁迫处理：种子萌发期筛时用滤纸，按培养皿直径裁剪，滤纸直径比其略小，每皿放2张；苗期筛选用纱布，用大培养皿( 培养皿底直径1 2 C m) ，将纱布按照培养皿底裁剪，比其直径略小裁剪好的滤纸和纱布平铺到培养皿中，连同镊子、小量筒一起用高温蒸气灭菌( 1 2 1 ℃，3 O 分钟) ，。P E G为P E G一8 0 0 0( 日本进口分装，北京鼎国公司出品) ，