宏基因组学及其在口腔微生物研究领域中的应用_陆剑
[收稿日期]2012-02-20；[修回日期]2012-08-27[基金项目]国家自然科学基金资助项目（81170954）[作者简介]陆剑（1983—），男，湖北人，主治医师，硕士[通讯作者]杜民权，Tel ：027-********
宏基因组学认为，生命研究的对象应是生物环境中全部微小生物的基因组，即特定环境下所
有生物遗传物质的总和[1]。它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和，微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌；因此，宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物群落研究方法，也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学[2]。
利用宏基因组学技术研究口腔微生物，无需
单一分离培养某一种类的微生物，即可直接在基因水平上研究口腔微生物，包括可培养和不可培
养微生物。宏基因组学应用于口腔微生物的研究，主要包括两个方面：一方面进行微生物生态学研究，从整体微生物群落水平来研究口腔微生物，揭示口腔微生物群落多样性及其变化；另一方面是进行口腔微生物及其基因的研究，从中筛选到新的功能基因及其产物。通过这两方面的研究，较全面地了解口腔微生物的群落结构和功能基因组，为深入探索口腔微生物的代谢活动，最大限度地发掘口腔微生物资源提供可能。1
宏基因组学的研究方法
宏基因组学是从特定环境中直接分离所有微生物的DNA ，选择合适的载体用于克隆DNA 片段，将DNA 片段克隆到宿主细胞中进行表达，
宏基因组学及其在口腔微生物研究领域中的应用
陆剑综述李宇红杜民权审校
（口腔基础医学省部共建国家重点实验室培育基地和口腔生物医学
教育部重点实验室，武汉大学口腔医学院
武汉430079）
[摘要]宏基因组学研究特定生物环境中全部微小生物的基因组，直接从土壤和海水以及人体胃肠道和口腔等环境中获取样品DNA ，利用适宜的载体将其克隆到替代宿主细胞中构建宏基因文库，以筛选新的活性物质和新的基因；因此，利用宏基因组学技术不仅能够有效地检测口腔微生物群落结构，同时还极大地扩展了口腔微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质和基因的机会。本文就宏基因组学的研究方法和宏基因组学口腔微生物研究领域中的应用等研究进展作一综述。
[关键词]宏基因组学；微生物群落；遗传物质；口腔[中图分类号]Q 781
[文献标志码]A
[doi]10.7518/gjkq.2013.01.015
The research methods of metagenomic and the application of metagenomic study in the oral microbiota Lu Jian ,Li Yuhong ,Du Minquan .[The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology （Hubei-MOST
）&Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education,School and Hospital of Stomatology,Wuhan University,Wuhan 430079,China ]
[Abstract]Metagenomics is the genomes of the total microbiota found in nature.Metagenome libraries were con-structed by directly extracting DNA from environmental samples,Such as soil,oceans,human gastrointestinal tract and mouth,etc.,and transforming to surrogate host.The libraries were screened for novel bioactive compounds or genes.Therefore,Metagenomics can effectively detect oral microbial community structure,and also can enormously amplified the space of microbial resource utilization and enhanced the opportunity of obtain novel bioactive com-pounds.This review included the research progress of the methods of metagenomic and the application of metage-nomic study in the oral microbiota.
[Key words]metagenomics ；microorganism structure ；genetic material ；oral
根据某些生物活性功能或基因序列筛选有价值的克隆并进行其功能分析。
1.1宏基因组文库的构建
1.1.1环境微生物DNA的提取环境样品DNA 的提取是基因组文库构建中最重要的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来，而且还要保证一定的DNA片段长度和完整性。根据提取样品总DNA前是否需要分离细胞，可将其提取方法分为原位裂解法和异位裂解法[3]。原位裂解法可直接破碎样品中的微生物细胞而使其DNA得以释放。原位裂解法无需对样品微生物进行复苏，黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表微生物的多样性。由于原位裂解法所提取的DNA片段仅为1～50kb，故其通常用于构建小片段插入文库（以质粒或λ噬菌体为载体）的DNA提取[4]。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来，然后以较温和的方法抽提其DNA。此法提取可以获得长度为20～500kb的大片段DNA，而且纯度高，但却容易丢失微生物物种信息。该方法适用于构建大片段插入文库（以黏粒或细菌人工载体为载体）的DNA提取[5]。
1.1.2载体选择目的基因能否有效地转入宿主细胞并在其中高表达，在很大程度上取决于载体。通常用于DNA克隆的载体包括质粒、黏粒和细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段，适用于单基因的克隆与表达[4]。黏粒又称柯斯质粒或柯斯载体，用于克隆大片段的DNA分子，其克隆外源DNA片段的极限高达350kb，远远超过质粒载体的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对，转化率高，而且其以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化。另外，构建能容纳40kb外源DNA插入片段的fosmid文库也有报道[6]。
1.1.3宿主选择目前，常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。一些缺陷型突变体细菌也可以作为宿主进行宏基因组文库的功能筛选。宿主的选择主要应考虑其转化率和宏基因表达以及重组载体在宿主细胞中的稳定性和目标性状的筛选等。对于任何宏基因组来源的基因来说，大肠埃希菌依然是最理想的克隆和表达宿主[4]。也可以用其他宿主菌，例如被用来鉴定与新抗生素生物合成相关基因的浅青紫链霉菌和一些革兰阴性细菌[5]。也可以用穿梭黏粒或BAC 载体将构建于大肠埃希菌的文库转入其他宿主，如链霉菌属或假单胞菌属中[7-8]。根据不同微生物产生活性物质的差异和研究目标的不同，选择不同的宿主。随着技术的成熟和新宿主的选择，基因筛选率和功能基因检测率得以提高，进而宏基因组文库的目标基因的表达也得以提高。
1.2宏基因组文库的筛选
根据研究目的，宏基因组文库的筛选通常有功能筛选和序列筛选两种方法。功能筛选最常用方法是根据重组克隆产生一些酶蛋白功能活性，采用各种检测手段，挑选活性克隆子，得到完整的功能基因和带有目的基因的基因簇，发现全新的基因或活性物质。功能筛选首先要求功能基因或带有目的的基因簇在宿主中表达，但因其受到检测手段的限制，往往是在数千个甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆[9-10]。序列筛选是依赖于目的基因的保守DNA序列，以序列相似性为基础，执行某类功能的酶可能具有相似的基因序列，根据已有的序列信息设计引物，进行PCR扩增或杂交筛选阳性克隆子。序列筛选一般只能获得结构基因的片段，而不能获得完整的功能基因；但是，它可以将扩增产物进行标志并将其作为探针筛选宏基因文库，以获得完整的功能基因。用这种方法有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子[11-12]。
宏基因组文库的筛选除了功能筛选和序列筛选法外，还可以采用底物诱导基因表达法（sub-strate-induced gene expression，SIGEX）。SIGEX 是以代谢相关基因或酶基因往往有底物存在的条件下才表达，反之则不表达的原理来筛选目的代谢基因的[13-14]。SIGEX的优点在于它为高通量筛选提供了保障，而且不需要对底物进行修饰[14]。
2宏基因组学在口腔微生物研究领域中的应用
2.1口腔微生物群落结构分析
口腔是一个由大量微生物组成的复杂的生态系统，人类口腔中寄居着大约700多种细菌[15]。人类口腔适宜的温度、湿度，丰富的营养来源，结构的复杂性和理化性质的不同，为口腔内各种微生物的生长、繁殖和定居提供了非常适宜的环境，因而也就造就了口腔微生物群的多样性[16]。口腔微生物大部分可以相互关联并形成生物膜，抵抗机械清除力或抗生素治疗，但是在环境变化
或其他口腔情况（如个人口腔卫生质量）变化触发时，它们也可成为致病微生物[17]。
菌斑指示剂和传统培养方法以及常规的PCR 特异性扩增的分子生物学方法在某种程度上都不能完整地反映整个微生物群落的组成和动态变化，不适合用其研究复杂的口腔微生物群落。此外，在难培养或不可培养的微生物当中，可能也有致病菌匿藏其中，因而也不能有效地用其研究与病程相关的微生物[18]。
随着分子生物学和分子遗传学技术的发展，在基因组学的基础上诞生了宏基因组学这一门崭新的交叉学科。宏基因组学是继发明显微镜以来研究微生物最重要的进展，将为微生物世界带来革命性的突破。Turnbaugh等[18]利用16S rRNA基因测序发现：胖人和瘦人的内脏中有着不同的微生物菌群；当胖人减肥的时候，他们内脏中的细菌群基因也同样发生变化，更加接近瘦人内脏中的细菌群。
基于常规的口腔细菌培养方法和细胞学显微镜检查，目前公认变异链球菌和乳酸杆菌等是引起龋病的主要致病菌；但是，随着宏基因组学在微生物的种类和多样性研究中的应用，有关龋病是由单一细菌引起或是由生物膜中的多种细菌引起的定论面临质疑。目前普遍认为，龋病并不是仅由变异链球菌或其他任何一种菌斑中的细菌单独引起的，而是由各种产酸菌相互作用的结果[19]。
Aas等[20]在对51名龋患者的1285个菌斑细菌的16S rRNA序列进行分析后发现，50%的细菌不能识别，一些新的细菌菌种与龋病的发生有关。Keijser等[21]在用焦磷酸测序法分析健康人涎液和牙菌斑中细菌群时发现，口腔微生物具有多样性。即他们从98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1万个微生物表型组成，其种族数远远超过之前报道的通过培养或者传统克隆和测序技术定义的700种口腔微生物表型。
Zaura等[22]在利用焦磷酸测序技术检测了3名健康高加索人口腔内5个部位的微生物组后发现，在健康人的口腔中微生物有3600种独特物序列，超过500种不同的分类单元或“物种级”表型和88～104种高级分类群，每个单独的样品平均藏匿有266种分类单元。从这3名个体微生物组的测序结果分析可知，高级分类群、分类单元和独特序列都有一个较大的重叠，即84%的高级分类群、75%的分类单元和65%的独特序列至少在这3个微生物组中的2个组中存在。这3名个体的总共6315个独特序列中有1660个相同序列，这1660个相同序列，即“核心微生物组”贡献了66%的测序内容，重叠的分类单元贡献了94%的内容，而几乎所有的内容（99.8%）都属于共享的高级分类群。
研究证实，在不同的健康人的口腔微生物中，大部分微生物组是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物组。Kanasi等[23]在对80名患龋和无龋婴幼儿牙菌斑微生物的16S rRNA序列克隆分析中发现，两者之间存在着139种不同微生物。Gross等[24]通过酶促法测序技术对无龋和患龋年轻恒牙牙菌斑微生物的16S rRNA序列进行分析后认为，龋齿中产酸菌除了变异链球菌和乳酸杆菌外，月形单胞菌、奈瑟菌和缓症链球菌同样是潜在的产酸细菌。Willner等[25]等在利用高通量测序技术检测了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因组序列后发现，口腔咽部是一个潜在的被噬菌体T3侵蚀的肠道菌储存库。另外，他们还发现了编码血小板凝集因子PblA和PblB的两个寄生于变异链球菌中的噬菌体sm-1基因，而之前有研究称在心内膜上发现了变异链球菌[26-28]。这说明，口腔中的病毒与心脏疾病存在潜在的联系。
宏基因组学技术可以避开传统的培养方法，在DNA水平来探讨口腔微生物群落结构及其与环境微生物的关系。微生物多样性在基因水平上主要表现为基因组大小和基因数目的多样性，遗传物质化学组成的多样性和某些特异性序列的差异。宏基因组技术为研究口腔微生物复杂群落和多样性提供了重要的技术手段，通过快速可靠地获得口腔微生物中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列，以系统分析口腔微生物的多样性及其分类地位，发掘丰富的口腔微生物资源。
2.2口腔微生物宏基因组文库中的新型基因筛选
及其功能
宏基因组学除了研究微生物群落结构及其功能外，还可用于发现新的基因和开发新的微生物活性物质。Jiang等[29]构建土壤宏基因文库，成功地克隆和鉴定出一种新型的β-葡萄糖苷酶基因，该基因包含一个由151个氨基酸编码组成的多肽。该研究对深入挖掘土壤未培养微生物的β-葡萄糖苷酶基因资源和该基因功能具有的重要意义。陈春岚等[30]从富集培养物宏基因组文库中筛选出一个表达木聚糖酶基因umxyn10B，该基因大小为
999bp，编码产物的氨基酸序列具有较好的同源性。对其功能进行研究发现，该酶具有优良的理化特性，可广泛应用于食品、能源、造纸和纺织等行业。Yu等[31]利用宏基因功能筛选发现的两个新型低温活性酶脂EstM-N1和EstM-N2，属于细菌脂肪分解酶Ⅷ家族成员。这一发现将推动生物催化剂的应用。
当前，宏基因组学技术已经在微生物学研究的诸多领域，尤其是在发现具有潜在应用价值的次生代谢产物方面显示出了无穷的魅力，但是，利用宏基因组技术探索口腔微生物的新的功能基因尚处于起步阶段。Warburton等[32]对口腔细菌群体中的耐药基因进行了分析，结果发现一个新的耐四环素基因tet32能够使四环素失活。虽然对口腔微生物新的功能基因及其功能研究还太少，但依然可以借助宏基因组学技术发掘新基因，以利用这些新基因在口腔医学行业发挥应有的作用。
3展望
当下对口腔生物膜中定植的微生物的了解，仍然局限于试验室中能够培养或传统克隆和测序技术定义的致龋菌表型；但是这些传统方法只能培养口腔中1%的细菌，大量的口腔细菌是很难培养的或不可培养的；因此，利用宏基因组学技术从口腔牙菌斑和涎液中提取微生物宏基因组，构建宏基因组文库，有可能从微生物群落水平系统地剖析出口腔微生物群落的多样性和动态变化，较全面地了解口腔微生物群落的代谢机制及其产物，为口腔微生物的基础和应用研究作出重大的贡献。
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（本文编辑刘世平）
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