L_半胱氨酸修饰金电极电化学发光法测定罗红霉素

L 2半胱氨酸修饰金电极电化学发光法测定罗红霉素

李利军

31　蓝苏梅2　程昊1　蔡卓2　程龙军21(广西工学院生物与化学工程系,柳州545006) 2(广西大学化学化工学院,南宁530004)

摘　要　在裸金电极上制备了L 2半胱氨酸自组装膜修饰电极(L 2Cys 2Au /S AM /C ME )。考察了联吡啶钌和罗红霉素在此修饰电极上的电化学及其发光行为。结果表明,此修饰电极表现出了很好的电化学活性和电化学发光(ECL )响应。基于罗红霉素的存在可增大了联吡啶钌的发光强度,建立了测定罗红霉素片的电化学发光

分析方法。在最佳实验条件下,罗红霉素浓度在1.0×10-7～1.0×10-4mol/L 范围内与其相对发光强度呈线

性关系,其线性回归方程为I =2×107C +384.02,r =0.9977;检出限(S /N =3)为1.0×10-7mol/L 。连续测

定1.8×10-5mol/L 罗红霉素10次,发光强度的RS D 为1.93%,表明此修饰电极具有较好的重现性,并将本

方法用于罗红霉素片剂的检测。

关键词　L 2半胱氨酸,化学修饰电极,罗红霉素,联吡啶钌,电致化学发光

　2009201218收稿;2009205216接受

本文系国家自然科学基金(No .20665001)和广西科学基金(No .0640029)资助项目

3E 2mail:lilijun0562@sina .com 1　引　言

罗红霉素为第3代红霉素衍生物(结构见图1),是红霉素A 的9位羰基以甲氧基乙氧基甲肟基取

代的半合成红霉素,属大环内酯类的抗生素[1]。其抗菌活性及抗菌谱与红霉素相似,但对酸稳定,血药

浓度高,因而具有用量小、口服吸收良好、作用时间长、稳定性好等优点。罗红霉素直肠给药可作为治疗慢性细菌性和慢性非细菌性前列腺炎的主要药物[2]

。目前,对罗红霉素的测定方法主要有高效液相色

谱法[3]和流动注射化学发光法[4]。中国药典(2000年版)测定其含量采用微生物检定法,但该方法操作

繁琐,检验周期长,影响因素多、实验误差大[5]。文献[6]报道了参考中国药典罗红霉素胶囊的溶出度

检测法。文献[7]采用紫外分光光度法测定罗红霉素的含量。但用同一溶剂时,罗红霉素与其分解产物显同一颜色,此法测定罗红霉素的含量可能产生很大的误差,故需要选择适宜的溶剂。因此,建立罗　图1　罗红霉素的结构

Fig .1　Structure of r oxithr omycin

红霉素分析新方法具有重要的意义。

电致化学发光(ECL )是通过电极上直接或间接发

生的电化学反应而产生的一种化学发光。它是在化学

发光和电化学基础上发展起来的一种分析技术,不但保

留了化学发光分析和电化学分析所固有的优点,同时还

具有其化学发光反应易于控制、方法更灵敏、更具有选

择性、获得更多的化学信息等优点[8,9]。ECL 作为一种

灵敏度高、选择性好的分析方法,近年来引起人们的广

泛关注。目前已报道的ECL 物质有联吡啶钌类络合

物[10,11]、酰肼类药物[12,13]及多环芳烃类物质[14]。其中作为发光试剂的联吡啶钌[Ru (bpy )3]2+具有水溶性好、试剂稳定、氧化还原可逆、发光效率高、可电化学再

生、可进行可逆单电子转移反应及激发态寿命长等优点,在ECL 光药物分析应用研究中占有重要地位。

目前,关于用电化学发光法测定罗红霉素的报道较少。本实验研究了巯基化合物在金电极表面的自组装及分析应用。通过巯基化合物能够在金电极等金属表面形成S M 键,且伸向溶液的有机链会形成有序排列的单分子层结构,因此在结构与功能上自组装膜具有类似生物膜的特性,且稳定性好,在界面化学和生命化学领域具有广泛的应用前景。利用L 2半胱氨酸(L 2Cys )与金电极的强相互作用,通第37卷2009年9月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry

第9期1367～1370

过S Au 键使L 2Cys 自组装到金电极的表面,形成L 2Cys 2Au /S AM /C ME,此电极对罗红霉素的氧化具有明显的催化作用。据此,成功地建立了一种罗红霉素的ECL 检测新方法。在选定的最佳条件下,联

吡啶钌与罗红霉素体系的ECL 强度与罗红霉素浓度在1.0×10-7～1.0×10-4mol/L 范围内呈良好的

线性关系。本方法简单、线性范围宽、检出限低,同时具有较高的选择性,样品处理简单。本方法应用于罗红霉素片剂的分析,结果满意。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

MP I 2E 型电致化学发光分析系统(西安瑞迈电子科技有限公司);DL 260D 型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司),CH660B 电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);电化学实验采用三电极系统:L 2Cys 2Au /S AM /C ME 电极为工作电极,Pt 丝为对电极,Ag/AgCl 为参比电极(饱和KCl 溶液)。

1.00×10-4mol/L 罗红霉素标准储备液(用时现配):准确称取0.0084g 罗红霉素(中国药品生物制品检定所),用20mL 无水乙醇溶解后,用水定容至100mL 棕色容量瓶中,再用超声脱气后冷藏于冰

箱中备用;1.00×10-3mol/L 联吡啶钌(A ldrich 公司)储备液:准确称取六水合三(2,22联吡啶)氯化钌

0.0374g,用水溶解并定容于50mL 棕色容量瓶中,用超声脱气后放入冰箱中(4℃)保存。实验用水均为二次石英亚沸蒸馏水。

2.2　L 2Cys 2Au /SA M /C M E 的制备

将金电极首先用金相砂纸打磨,再依次用0.5和0.05μm α2A12O 3粉在平板玻璃上抛光至镜面,分别于无水乙醇和水中超声洗涤5m in 。然后将金电极浸人0.05mol/L H 2S O 4溶液10m in,在1.4～0.4V 范围内进行CV 扫描,直至得到稳定和重现的伏安图。随后,固定电位在0.25V 恒电位极化3m in,以彻底消除表面可能存在的金氧化物。再将金电极依次用水和无水乙醇冲洗干净,以高纯氮吹干立即浸入0.02mmol/L L 2Cys 溶液中,在室温下自组装24h,取出电极,用无水乙醇反复冲洗以除去物理吸附的硫醇,最后用水冲洗,即可制得L 2Cys 2Au /S AM /C ME 。

2.3　实验方法

实验在MP I 2E 型电致ECL 工作站上进行。三电极系统;支持电解质为0.1mol/L 硼酸盐缓冲液

(pH 7.50),将0.4mmol/L Ru (bpy )2+3和0

.2mL 0.1mol/L 硼酸盐缓冲液加入电解池,在0.2～1.30V 范围内进行CV 扫描,然后记录发光信号作为空白。在上述溶液中加入一定浓度的罗红霉素溶液0.1mL,采用相同的方法测定发光信号值。以相对化学发光强度(信号/空白)对罗红霉素定量分析,　图2　联吡啶钌(a )和罗红霉素2联吡啶钌共存(b )体系

的循环伏安图

Fig .2　Cyclic volta mmetric curve of Ru (bpy )2+3

and r oxithr omycin 2Ru (bpy )2+3

syste m a . 2.5mmol/L Ru (bpy )2+3;b

.a +0.1mmol/L 罗红霉素(Roxithr omycin )0.1mol/L Na 2B 4O 7。

绘制相对峰高强度与罗红霉素浓度的校准曲线,同时对样品进行分析测定。发光强度2时间实验曲线由MP I 2E 型ECL 工作站测定。用工作站检测池下方

的光电倍增管来收集待测样品的ECL 强度,光电倍

增管负高压为850V 。溶液测定前用超声波除气5

m in,实验在室温下进行,所有电位值均相对于参比

电极Ag/AgCl 。

3　结果与讨论

3.1　Ru(bpy)2+

3和罗红霉素的电化学行为分别对80μL Ru (bpy )2+

3,80μL 硼酸盐缓冲溶液(pH 7.5),80μL Ru (bpy )2+3+100μL 罗红霉素标准液+80μL 硼酸盐缓冲溶液(pH 7.5)进行CV 扫描和正向线性电位扫描。实验结果如图2。图2的a 和b 分别为联吡啶钌体系和罗红霉素与联吡啶钌共存体系的CV 曲线,从图2可见,联吡啶钌只有低的电极电流(曲线a ),而罗红霉素加入后电极电8631 分析化学第37卷

流信号显著增强(曲线b ),由此可知罗红霉素对联吡啶钌的电化学发光有显著的增强作用。

3.2　罗红霉素2Ru(bpy)2+3体系电化学发光行为

考察了Ru (bpy )2+3在L 2Cys 2Au /S AM /C ME 电极的ECL 行为。联吡啶钌在L 2Cys 2Au /S AM /C ME 电

极的发光强度比裸金电极明显增大。在相同条件下,在Ru (bpy )2+3体系中加入罗红霉素后,体系的发光强度增大约6倍。说明罗红霉素对Ru (bpy )2+3的发光强度具有增敏作用。

3.3　缓冲溶液对ECL 强度的影响

介质是影响电化学发光的主要因素。关于硼酸盐缓冲溶液对电化学发光的影响已有报道[15]。本

实验分别考察了硼酸盐和磷酸盐缓冲溶液对电化学发光信号强度及稳定性的影响,如图3所示。结果表明,以硼酸盐缓冲体系为介质时,罗红霉素增敏的联吡啶钌电化学发光信号与联吡啶钌的空白电化学　

图3　缓冲溶液体系对ECL 强度的影响Fig .3　Effect of pH value of s oluti on on EC L signal a .磷酸盐缓冲溶液(P BS );b .硼酸盐缓冲溶液(Borate

buffer );v :100mV /s;扫描范围(Scan potential ):0.2～1130V;0.1mol/L Na 2B 4O 7。发光信号的信噪比最大,且重现性较好,最佳浓度为

0.1mol/L 。考察了pH 值在6.5～9.0之间的硼酸盐缓

冲体系,得知在pH =6.5时发光较弱;随着pH 增大,发光

强度逐渐增大,pH =7.5时达到最大值。由于罗红霉素

带有胺基,其氮原子上有一对孤电子,易与质子结合,因

此在酸性溶液中会与H +反应形成正离子。pH 继续变大

时发光强度有所降低,可能是由于溶液中过多的OH -参

与在电极上的竞争反应造成高价态联吡啶钌?的减少。

因此,缓冲体系的pH 值太低或太高都不利于电极上Ru (bpy )3+3的产生。实验中选择Na 2B 4O 7(pH =7.5)。

3.4　Ru(bpy)2+3浓度的选择考察了在0.1～1.0mmol/L 范围内Ru (bpy )2+3浓

度对发光强度的影响。结果表明,随着Ru (bpy )2+

3浓度

的增加,ECL 强度增大,过大的浓度使噪音也同时增加,因此在保证最佳信噪比的前提下,选择

Ru (bpy )2+3浓度为0.4mmol/L 。

3.5　共存物质的影响

在实验条件下,以测量误差<5%为标准,考察了共存物质对测定罗红霉素的影响。结果表明:共

存物的允许量(以倍数计):Na +,K +,C I -,B r -,NO -3,葡萄糖,淀粉(1000);Ca 2+,Mg 2+,Zn 2+,S O 2-4

　

图4　不同浓度罗红霉素的电致化学发光曲线Fig .4　EC L curves of different concentrati on of r oxithr o 2mycin 罗红霉素(Roxithr omycin,mol/L )(1-5):1.0×10

-5

, 2.0×10-5, 4.0×10-5,8.0×10-5, 1.0×10-4。(100),不干扰罗红霉素的测定。

3.6　方法的评价

在最佳条件下,通过ECL 工作站记录不同浓度

罗红霉素标准溶液在L 2Cys 2Au /S AM /C ME 上的发光

强度响应如图4所示,以相对峰高对浓度进行线性

回归,罗红霉素浓度在1.0×10-7～1.0×10-4mol/L

范围内与其ECL 呈线性关系,线性回归方程为I =2×

107C +384.02(r =0.9977),方法的检出限(S /N =3)

为1.0×10-7mol/L 。对1.8×10-5mol/L 罗红霉素平行测定5次,其RS D 为1193%。结果表明,体系的

重现性好。3.7　样品分析称取10片罗红霉素,放入研钵中研磨粉碎混

匀,再称取相当于1片罗红霉素量的样品溶于无水乙醇,过滤后用水定容于100mL 棕色容量瓶中,稀释

后在最佳实验条件下进行测定。对1.8×10-5mol/L 罗红霉素溶液平行测定5次,其RS D 为1193%,表

明此体系的重现性很好。

9631第9期李利军等:L 2半胱氨酸修饰金电极电化学发光法测定罗红霉素

0731 分析化学第37卷

在样品中加入标准液进行回收率实验,测得的回收率为95.5%～101.3%。结果表明,本方法可以用于罗红霉素片剂的含量测定。

References

1　W ei J in(魏瑾),Hou Ping(侯平),L i Zhai(李寨),L i J ia2Tai(李家泰).Chinese Journal of A ntibiotics(中国抗生素杂志),1994,19(4):299～302

2　Yu Rong2Sen(俞荣森),Zhou Guang2Jun(周光军).China Pbar m acist(中国药师),2000,3(2):112

3　W ang Xiao2Bo(王晓波),W ang J ing2Guo(王敬国),Gong Rong2Gang(龚荣刚).Journal of Phar m aceutical Practice(药学实践杂志),2002,20(5):293～295

4　Fang Yan2Jun(房彦军),Gao Zhi2Xian(高志贤),W ang Hong2Yong(王红勇),Zhang Yan2L i(张彦莉),Ma J in2Cun (马金寸).A cta A cade m iae M edicinae M ilitaris Tertiae(第三军医大学学报),2001,23(7):63

5　Zhang Hui2W en(张慧文),Zhong Yi(钟艺).A cade m ic Journal of Guangdong College of Phar m acy(广东药学院学报), 1996,12(3):172～174

6　W ang Q iu2Hua(王秋华),Xie W ei(谢玮),Lu J in2Fang(陆进方).Chinese Journal of Phar m aceuticals(中国工业医药杂志),1998,29(10):450～451

7　He L i2M ing(何丽明),Zhang Hui2W en(张慧文),Zeng Xiao2Hui(曾晓晖).A cade m ic Journal of Guangdong College of Phar m acy(广东药学院学报),2004,20(5):475～477

8　Chen Guo2Nan(陈国南),L in Zhen2Yu(林振宇).W orld Science2Technolog,R&D(世界科技研究与发展),2004, 26(4):66

9　Chu Hai2Hong(储海虹),Q i Ying2Ying(齐莹莹),Xu Yang(徐杨).Spectroscopy and Spectral A nalysis(光谱学与光谱分析),2005,25(5):675

10　R ichterM M,Bard A J.A nal.Che m.,1998,70:310～318

11　M cCord P,Bald A J.J.Electroanal.Che m.,1991,318:91～99

12　An J ing2Ru(安境如),L in J ian2Guo(林建国).Chinese J.A nal.Che m.(分析化学),1992,20(6):666～669

13　Yao Q ing(姚晴),An J ing2Ru(安境如).Che m.J.Chinese U niversities(高等学校化学学报),1991,12(4):469～470 14　R ichard T C,Bard A J.A nal.Che m.,1995,67:3140

15　L iu X Q,Shi L H,L i H J,N iu W X,Xu G B.Electroche m istry Co mm unications,2007,(9):2666～2670

D eterm i n a ti on of Rox ithrom yc i n Ba sed on L2Cyste i n e

M od i f i ed Gold Electrode by Electroche m ilu m i n escence

L IL i2Jun31,LAN Su2Mei2,CHE NG Hao1,CA I Zhuo2,CHE NG Long2Jun2

1(D epart m ent of B iological and Che m ical Engineering,Guangxi U niversity of Technology,L iuzhou545006) 2(College of Che m istry and Che m ical Engineering,Guangxi U niversity,N anning530004)

Abstract　L2cysteine self2asse mbled monolayer modified electr ode(L2Cys/S AM2Au/C ME)was fabricated on the surface of bare gold wire.The electr oche m ical and ECL characteristics of Ru(bpy)2+3and r oxithr omycin at the modified electr ode were studied,and the modified electr ode exhibits good electr oche m ical activity and ECL res ponse.Based on the enhance ment of the intensity of Ru(bpy)2+3in the p resence of r oxithr omycin,ECL method was established for the deter m inati on of r oxithr omycin on the modified electr ode(L2Cys/S AM2Au/ C ME).Under the op ti onal conditi ons,the ECL detecti on li m it(S/N=3)f or r oxithr omycin was1.0×10-7 mol/L with a linear range fr om1.0×10-7mol/L t o1.0×10-4mol/L(r=0.9969).The RS D f or10ti m es deter m inati on of1.8×10-5mol/L r oxithr omycin was1.9%.The modified electr ode shows good recurrence. The method was app lied t o the deter m inati on of r oxithr omycin tablet with satisfact ory results.

Keywords　L2Cysteine self2asse mbled monolayers,modified electr ode,r oxithr omycin,tris(2,2′2bi pyridyl)2 rutheniu mΧ(Ru(bpy)2+3),electr oche m ilu m inescence

(Received18January2009;accep ted16May2009)