现代生化技术练习——第二章 - 参考答案

《第二章常用生物化学检验技术》习题

1、蛋白质的化学物理检测方法主要有哪些？试述各方法的特点。

（1）紫外吸收法

原理：根据组成蛋白质的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在280nm波长左右具有紫外吸收的性质进行测定。

特点：该法迅速、简便、不消耗样品、低浓度盐类不干扰测定，可测定0.1～1.0mg/mL的蛋白质溶液。对于测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质误差较大，适用于测定与标准蛋白质酪氨酸、色氨酸这类氨基酸含量相仿的样品。特别适用于层析柱流出液的检测；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用。

（2）凯氏定氮法

原理：一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，基本为一常数。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

特点：适用于0.2-1.0mg氮，误差为±2％，用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少；费时太长，反应时间8-10h。属于经典的仲裁的方法。

（3）双缩脲法

原理：双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结合生成紫色络合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中的肽键类似双缩脲结构，故亦能呈双缩脲反应。在一定的浓度范围内，颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。

特点：灵敏度较低，蛋白质量须在1～20mg/ mL方有较佳结果。在需要快速，但准确性要求不高的测定中，常用此法。

（4）福林酚试剂法

原理：Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。

特点：灵敏度高，耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化; 标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差。

（5）考马斯亮蓝法

原理：考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

特点：蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

2、糖类的化学检测主要原理是什么？方法主要有哪些？

原理：糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。

方法主要有：兰－爱农（Lane-Eynon）法、斐林试剂快速法（GB法）、碘量法、铜试剂法

3、核酸的化学检测方法主要有哪些？

定磷法、二苯胺法和地衣酚法

4、凯氏定氮法的基本原理是什么？其主要操作步骤包括哪些？

原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

主要操作步骤：消化、蒸馏、滴定

5、凯氏定氮法中样品消化时加入浓硫酸、硫酸钾和硫酸铜的作用各是什么？

（1）硫酸主要起消化作用，将有机物消化成无机物。

（2）加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度,一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高。

（3）硫酸铜主要起催化剂和指示消化重点的作用

①催化剂

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

②可以指示消化终点的到达

6、放射自显影技术的基本原理是什么？

其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。

7、生物检测内容主要有哪些？安全性检测包括哪些内容？

生物检测内容主要包括生物效价测定和安全性试验。安全性检测主要包括毒性试验、局部刺激性试验、溶血实验、热原试验、过敏试验和变异原试验。