Module 5 相对定量： ΔΔCT法和相对标准曲线法

标准曲线

1、标准曲线的本质分析检测中的标准曲线是指一系列已知含量（浓度/量）的物质与仪器响应/信号之间的关系，数学处理就是曲线方程，图形表示就是标准曲线（图1）。标准曲线的目的是可以根据标准曲线查出待测物质的含量。当我们得到一系列已知含量的物质的响应后，就会去建立函数关系，数学上称曲线拟合，由于直线最为简单，所以常常用直线方程加以拟合，当然会用到多项式拟合等其他方式。标准曲线的核心问题要解决： 1、能找到确切浓度的标准物质或标准品。 2、标准系列和待测物质一定要有相同和一致的基体，因为样品基体可能会干扰仪器的响应，从这个意义上讲，样品的前处理实际就是提供标准和样品同样的基体环境，尽量祛除干扰基体。所以最好的标准系列应该是样品基体匹配的标准系列。而方法建立过程中首先要考虑的当然是基体干扰的问题，推荐用标准加入曲线和Youden曲线分别考察样品基体所带来的乘积性干扰和加和性干扰。标准加入曲线就是在样品中加入一系列标准，然后考察该标准加入曲线和标准曲线斜率的统计学差异，若有差异需考虑用标准加入法定量；而Youden曲线就是对样品做一系列稀释，然后用稀释倍数如1/10,1/5,1/2,1对仪器响应做曲线，考察该Youden曲线的截距与0的差别，若有差别则提示有加和性干扰，此时测定值要减去该截距才是真实值。只有解决了标准曲线与样品基体的匹配问题，我们的定量才可靠。内标法和替代物的使用则是为了解决仪器和前处理的影响问题。

2、标准曲线的做法按《基于标准样品的线性校准》推荐： 1、标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围； 2、标准样品的组分尽量与被测样品组分一致； 3、标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围； 4、标准样品的个数至少应有3个浓度； 5、每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始；如果国家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准，如果你要偷懒，比如我要减少标准点，至少要有理论标准支撑，比如至少要3个浓度。工作中我们经常采用线性校准，因为线性方程最为简洁。 3、标准曲线的检验标准曲线的检验是实际操作中最大的难点，也是工作中误区和争议最多的话题，比如GB/T 就将标准曲线的检验分为：精密度检验，截距检验和斜率检验，但并未出示具体的检验方法。

标准曲线与工作曲线在不同分析方法中的使用

标准曲线与工作曲线在不同分析方法中的使用金筱青 (苏州市环境监测中心站,江苏苏州 215004)中图分类号:X830 5 文献标识码:C 文章编号:10062009(2005)04004501 校准曲线是描述待测物质浓度或量与相应测量仪器响应值或其他指示量之间的定量关系曲线。校准曲线包括工作曲线(绘制标准曲线的溶液需与样品分析步骤完全相同)和标准曲线(标液的分析步骤有所省略,如不经过前处理等)。至于何时用标准曲线,何时用工作曲线,须经实验确定。若标液的某些前处理步骤省略后,所绘制的曲线与工作曲线经数理统计检验无显著性差异时,则可在测试中使用标准曲线,否则应用工作曲线。测定总磷时, 水和废水监测分析方法 (第四版)要求,标液系列须与水样同时经过硫酸钾氧化并消解,而对于挥发酚、总氰化物的测定,标液系列则不要求蒸馏,可直接加显色剂显色,比色,绘制曲线。现分别绘制总磷、挥发酚和总氰化物测定方法的标准曲线和工作曲线,其多次测量(n=6)的斜率均值见表1。表1 总磷、挥发酚和总氰化物标准曲线和工作曲线的比较项目方法标准曲线斜率工作曲线斜率总磷钼锑抗分光光度法0 1000 100挥发酚4氨基安替比林分光光度法0 4040 386总氰化物异烟酸比唑啉酮分光光度法0 1480 137 由表1可见,总磷标液经消解和不消解绘制成的曲线,即工作曲线与标准曲线相比,其斜率间无显著性差异。由此看来,总磷标液系列的高温高压消解操作步骤可以省去,即采用钼锑抗分光光度法测定总磷时,可以使用标准曲线代替工作曲线。对于挥发酚和总氰化物的测定,由于绘制标准曲线简单方便,且标准曲线稳定、灵敏度高,相关性好,实际工作中多采用标准曲线,但实际样品在蒸馏过程中不可避免地有一定损失。由表1可见,测定挥发酚和总氰化物的工作曲线与标准曲线相比,斜率有所下降,使用标准曲线计算,结果偏低。使用工作曲线,则可以保证标液系列与样品处于完全相同的实验条件下,避免引入系统误差。总之,在经数理统计检验后,若标准曲线与工作曲线之间无显著性差异,可以使用标准曲线,若两者之间存在差异,则应使用工作曲线。收稿日期:20031111;修订日期:20050517 作者简介:金筱青(1974 ),女,江苏苏州人,工程师,硕士,从事环境监测和环境影响评价工作。本栏目责任编辑李延嗣张启萍 (上接第9页) 件,2002年查处965件,2003年查处1161件;2000年 2003年查处案件数增长近5倍,但2004年查处案件数与2003年基本持平。违法施工行为得到有效遏制。从环保12369投诉情况看,2000年全年共受理施工噪声污染投诉4900件(次),以后每年以20%~30%的速度递增,至2003年全年达到8940件(次)。但2004年全年受理施工噪声投诉7648件(次),比2003年减少1292件(次),下降了14.5%。南京市施工噪声投诉在近年持续大幅上升的情况下,2004年首次呈现下降态势。 4 结语南京市通过实行夜间施工噪声总量控制,改变了建设施工单位盲目赶工期、不科学安排施工作业,随意到环保部门申请夜间施工作业的现象,探索出一条可行的缓解噪声扰民问题的新路子,把大量可能产生的环境噪声污染纠纷与矛盾解决在未发之时。这一举措,既维护了市民的环境权益,又保证了施工单位的合法施工权。本栏目责任编辑李文峻 45 第17卷第4期环境监测管理与技术2005年8月

Excell软件绘制ELISA标准曲线

怎么用Excell软件绘制ELISA标准曲线许多试剂检测都涉及到标准曲线的问题,究竟如何绘制或制作标准曲线呢? 用Excell和SPSS的软件能做出来吗?,怎么操作?能一起求出计算公式吗? 有没有专门的软件来处理呢?介绍几种? 希望有这方面经验的介绍自己的经历,与大家分享,“与众同乐才是真的快了” 的确,标准曲线做的好与坏会直接影响到实验的结果,甚至是关系到实验的成败。首先,做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意: 1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。 2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段,即曲线几乎成直线的范围内。 3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。 4、检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。 5、标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。 6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999.

怎样绘制标准曲线? 标准曲线浓度得到后,可通过计算器、Excell或SPSS统计软件进行绘制,并得到相关的回归方程(即计算公式和相关系数(回归系数,个人认为,Excell 软件比较好用一些;SPSS也行,不过是英文的,初学者不是很容易掌握;计算器嘛太麻烦了,所以现在一般不用。双抗夹心法ELISA拟和曲线: 拟和曲线: 打开EXCEL软件;在工作表中输入第一行:浓度值,如0 10 50 100 400 输入第二行:该浓度下的调整后的od值,如0 0.586 1.397 1.997 3.42 选择这些输入的数据,用插入里的图表按钮,进入图表向导,在“标准类型”中选择“xy散点图”;在“子图表类型”中选择“折线散点图”,按“下一步”;选择“系列产生在行”,按“下一步”;数据标志,可以填写:如数据y 轴,OD值;数据x轴,浓度;按下一步,点击完成。可得曲线图。单击曲线,按右键,选择“添加趋势线”,在类型中,选择多项式;在选项中,选择显示公式,选择显示R平方值。得到公式和R平方值。也可以用上面说的方法,在公司已经提供的图表上,双击图表,把它输入到图表的数据中,就可以拟和新的曲线。计算浓度: 举例:第一次实验: 标准曲线为:

标准曲线的制作方法

标准样品的准备由于你做的是基因表达分析，样品的准备就比较简单了，因为你要知道都是相对的数值（你的对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。你实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是我们根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如我们把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和你稀释的倍数是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。如何做标准曲线在定量实验中标准品是要和你的未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得Ct值。那么我们先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，我们既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样我们可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值我们知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。事实上，操作起来没有那么复杂，你只需要告诉软件你的哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮你把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来。举例来说如何进行设置先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。选择要使用的荧光染料。

标准曲线法与标准加入法的区别

1 标准曲线法 1.1标准曲线法的计算公式在一定条件下，标准曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。现在好多仪器软件都能自动生成标准曲线，所以一小部分版友不清楚标准曲线的具体计算方法。本人查找了一些资料，找到标准曲线的斜率和截距的计算方法，和大家分享。工作曲线可以用一元线性方程表示： y=a+bx （1）式中，x为标准溶液的浓度，y为相应的吸光度。使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a,b称为回归系数。 b 为直线的斜率，可由下式求得：

1.2 灵敏度灵敏度是指该方法对单位浓度或单位量的待测物质的变化所引起的响应量变化的过程。一般用标准曲线的斜率b为方法的灵敏度，b越大，灵敏度越高。不要小看灵敏度，用处可大了。灵敏度由于仪器的不同，实验条件等的不同，在不断的变化。但在一定的实验条件下，灵敏度相对还是比较稳定的。所以，建议对灵敏度也做个质量控制图，具体做法见我另一个帖子。每次标准曲线做好以后，观察灵敏度是否在一定的范围内维持稳定。如果发现灵敏度突然降低，就需要考虑，是否是仪器出问题了。火焰首先考虑雾化器是否堵塞，石墨炉首先考虑石墨管是否是烧坏。解决方法是用通丝清理雾化器，更换石墨管后继续测定标准曲线，带灵敏度稳定后进行样品测定。还有，在打开一瓶新的标准溶液的时候，在仪器进行维修以后，一定要注意灵敏度的变化。 1.3线性范围线性范围这个大家都比较清楚，主要从相关系数r看，一般要求r大于等于三个九。我在这里和大家分享的是，我想了好久才想开的一个问题。之前看好多书上

后来专门做了好多次实验，还是一直是直线在，只是有时候浓度高时，线性不好，高浓度点不在标准曲线上，而是在标准曲线的下面，而且离拟合的标准曲线比较远。遇到这种情况，标准曲线的线性相关系数就很差，有时候才一个九，如图2所示。最后我终于想明白了，如果自己用手动拟合的话，用平滑的曲线去连接所有点的话，你就会发现，如果在线性范围内，连接起来就是直线，如果超出了线性范围，连接起来就是一条弯曲的曲线。从弯曲的拐点开始，就已经超出了线性范围，如图3所示。所以，判断是否超出线性范围，个人觉得不是看是否弯曲，软件用最小二乘法拟合的一次曲线，永远是直线。要看你的高浓度点是否在拟合的标准曲线上或离得比较近，相关系数是否在三个九以内。如果不在，从拐点开始的那个点，就超出了线性范围，应该删除，从新拟合。 1.4检出限检出限是指对某一特定的分析方法在给定的置信水平内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。

实验教学典型案例实验名称：邻二氮菲分光光度法测铁主讲教师：王

实验教学典型案例实验名称：邻二氮菲分光光度法测铁主讲教师：王芬一、实验目的 1、掌握用邻二氮菲分光光度法测铁的原理和方法。 2、掌握分光光度计的使用方法。二、实验原理在 pH=3～9 的溶液中， Fe 2+ 与邻二氮菲反应生成一种稳定的橙红色络合物。显色前需要用盐酸羟胺将Fe 3+ 全部还原为 Fe 2+ ，然后加入邻二氮菲，并调节溶液酸度至适宜的显色酸度范围。有关反应如下： Fe N N 3 2+ N N 3 Fe 2+ + 该络合物的最大吸收波长为 508 nm ，可在此波长下测量吸光度,由朗伯-比耳定律计算铁含量。用分光光度法测定物质的含量，一般采用标准曲线法，即配制一系列浓度的标准溶液，测定相应吸光度，绘制 A-C 标准曲线。然后测定待测溶液的吸光度，根据测得吸光度值从标准曲线上查出相应的浓度，即可计算试样中被测物质的质量浓度。三、试剂和仪器 1、仪器 V-1100型分光光度计、容量瓶、吸量管 2、试剂（1）0.1mgl -1 铁标准储备液准确称取0.7020g NH 4Fe(SO 4)26H 2O 置于烧杯中，加少量水和20mL 1:1 H 2SO 4 溶液，溶解后，定量转移到1L 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。（2）10 -3 molL -1 铁标准溶液。（3）100 mgL -1 盐酸羟胺水溶液。 2Fe 3+ +2NH 2 OH HCl=2Fe 2+ +N 2 +2H 2 O +2H + +2Cl -

（4）15 mgL -1 邻二氮菲水溶液。（5）10 mgL -1 乙酸钠溶液。（6）铁未知液。四、实验步骤 1、显色标准溶液的配制在序号为1——6的 6只50mL 容量瓶中，用吸量管分别人加入 0，0.20，0.40，0.60，0.80 铁准准溶液，分别加入 1mL100gL -1 盐酸羟胺溶液，摇匀后放置2min ，再各加入2mL 1.5g?L -1 邻二氮菲溶液、 5 mL1.0 mol?L -1 乙酸钠溶液，以水稀释至刻度，摇匀。 2、标准曲线的测绘以步骤1中试剂空白溶液（1号）为参比，用1cm 吸收池，在选定波长下测定 2—6 号各显色标准溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 3、铁含量的测定试样溶液按步骤 1 显色后，在相同条件下测量吸光度，由标准曲线计算试样中微量铁的质量浓度。五、数据处理以吸光度为纵坐标, 铁含量为横坐标, 绘制工作曲线。由工作曲线确定待测溶液的含量。六、思考题 1、根据实验数据，计算在最大吸收波长下，邻二氮菲-Fe（Ⅱ）的摩尔吸收系数ε。 2、本次实验中用V-1100型分光光度计基本部件有哪些基本部件。 C x A C A A x x

运用Ecel做标准曲线

E x c e l绘制标准曲线全图片教程随着计算机的日益普及，越来越多的检验工作者希望能从一些烦琐的工作中解脱出来，如：绘制标准曲线、绘制质控图、计算检测值等等。当然借助检验科办公系统理论上是最方便的，但很多单位是没有检验科办公系统的。其实借助Microsoft的Excel电子表格工具对检验工作也会带来很大的便利。 Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。现就先介绍一下如何使用Excel绘制标准曲线。首先，将数据整理好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图所示。点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”。如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图。如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图：

出现上图后，如图在表上选取正确的数据区域。然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图，上应调整选项，以满足自己想要的效果。点击“下一步”，现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。如下图。由于本例是线性关系，在类型中选“线性”如下图点击“确定”，标准曲线就回归并画好了。标准曲线是画好了，可是我们怎么知道回归后的方程是什么样呢这了简单，点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图：在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。再点确定。好了，现在公式和相关系数都出来了。如图：呵R的平方达，线性相当好。可是有时候有的项目是成指数增加的，散点图如下图，将左下方的对数刻度选中，确定。完整的一个半对数标准曲线就做好了。利用Excel制作标准曲线简单吧如果认真调整参数可以得到不同的效果，大家多研究一下吧。有人说标准曲线是拿来用的，要是能输入信号值就可以得出浓度那就好了，其实使用Excel也能很自如的处理。具体请听下回分解。

标准曲线的绘制吸光度标准曲线绘制

标准曲线的绘制-吸光度标准曲线绘制生物化学实验报告ALT与其吸光度的标准曲线绘制采集样本：广西医科大学口腔医学2016级13班四个组中7组生物化学实验数据采集时间：2016年11月15日2016~2016上学期第十一周周一下午采集人：何洁梅一、几组ALT与其吸光度的标准曲线数据记录 ALT活力单位A520吴修团1组A520黎丁菱1组A520杨璇璇1组A520谢晓兰2组A520莫雪玲2组A520李文良3组A520文全海4组 00000000

二、各采集样本汇总图样本1测定得待测血清ALT活力单位为50U/L 样本2测定得待测血清ALT活力单位为 97U/L 样本3测定得待测血清ALT活力单位为 135U/L 样本4测定得待测血清ALT活力单位为 70U/L 样本5测定得待测血清ALT活力单位为 148U/L 样本6测定得待测血清ALT活力单位为

45U/L 样本7测定得待测血清ALT活力单位为 98U/L 四、采集数据处理结果分析 1．数据总结样本编号测定的ALT活力单位是否大于40U/L正常/非正常 150是非正常 297是非正常 3135是非正常 470是非正常 5148是非正常 645是非正常 798是非正常平均值92均为“是”均为“非正常” 2.针对数据处理结果的分析采集的7组数据经标准曲线测量后，得到的ALT活力单位值均大于40，即均为非正常值，综上，认为待测血清中ALT 含量超于正常值。 3.针对源数据的分析

采集的7组数据中样本4、5、6的数据经画图后可基本分布呈过原点的线性关系，符合理论规律，但其他的数据误差较大。另外，比较符合理想标准曲线的4、5、6样本的三个ALT活力单位值也存在较大的出入。 4.经分析，总结可能的误差来源如下配置丙酮酸标准溶液、底物溶液、磷酸缓冲液的混合溶液时，丙酮酸标准溶液的剂量都很小，容易造成误差。加入2,4—二硝基苯肼的时间可能有误差，保温的时间，以及加入NaOH 以停止反应的时间都有可能有偏差，容易造成较大。如何用EXCEL绘制标准曲线 Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。现就先介绍一下如何使用Excel绘

标准曲线的作法

标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 (3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。 ①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=l：1)或长方形(长：宽=3 ： 2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。 ②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 ③标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。 ④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。 ⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。 ⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。 1.5 原子吸收光谱分析的定量方法原子吸收光谱分析是一种动态分析方法，用校准曲线进行定量。常用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和浓度直读法。如为多通道仪器，可用内标法定量。在这些方法中，标准曲线法是最基本的定量方法。 1.5.1 标准曲线法前面已经指出，原子吸收光谱和原子荧光光谱分析是一种相对测定方法，不能由分析信号的大小直接获得被测元素的含量，需通过一个关系式将分析信号与被测元素的含量关联起来。校正曲线就是用来分析信号（即吸光度）转换为被测元素的含量（或浓度）的“转换器”，此转换过程成为校正。之所以要进行校正，是因为同一元素含量在不同的试验条件下所得到的分析信号是不同的。校准曲线的制作方法是，用标准物质配制标准系列溶液，在标准条件下，测定各标准样品的吸光度值Ai，以吸光度值Ai（i＝1，2，3，4，5）对被测元素含量ci（i＝1，2，3，4，5）绘制校准曲线A＝f（c）。在同样条件下，测定样品的吸光度值Ax，根据被测元素的吸光度值Ax从校准曲线求得其含量Ci。校准曲线如图1－4所示。校准曲线的质量直接影响校准效果和样品测定结果的准确度。正确地制作一条高质量校准曲线是非常重要的，为此需要：（1）合理的设计校准曲线；（2）分析信号的准确测定；（3）正确绘制校准曲线。首先，从数理统计的观点出发合理设计校准曲线。根据一组实验点绘制校准曲线所遵循的原则是最小二乘原理，即要让实验点随机地分布在校正曲线的周围，并有尽可能多的实验点落在标准曲线上，使得由这些实验点绘制的标准曲线的标准偏差最小。从校准曲线的置信范围考虑，当实验点数目，<4时，置信系数较大且变化速率较快，置信范围较宽，由校正

运用EXCEL做标准曲线

运用E X C E L做标准曲线 TPMK standardization office【 TPMK5AB- TPMK08- TPMK2C- TPMK18】

E x c e l绘制标准曲线全图片教程随着计算机的日益普及，越来越多的检验工作者希望能从一些烦琐的工作中解脱出来，如：绘制标准曲线、绘制质控图、计算检测值等等。当然借助检验科办公系统理论上是最方便的，但很多单位是没有检验科办公系统的。其实借助Microsoft的Excel电子表格工具对检验工作也会带来很大的便利。 Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD 字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。现就先介绍一下如何使用Excel绘制标准曲线。首先，将数据整理好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图所示。点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”。

如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图。如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图：出现上图后，如图在表上选取正确的数据区域。然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图，上应调整选项，以满足自己想要的效果。点击“下一步”，现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。如下图。由于本例是线性关系，在类型中选“线性”如下图点击“确定”，标准曲线就回归并画好了。标准曲线是画好了，可是我们怎么知道回归后的方程是什么样呢？这了简单，点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图：

标准曲线的制作

标准曲线的制作(附甲醛标液工作曲线图)：精确吸取上述甲醛标液（S2）：0.00，0.20，0.50，1.00，1.50，2.00 ml，分别置于50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，再分别吸取上述浓度溶液5.0ml于25ml比色管中，然后加入5.0ml乙酰丙酮溶液，摇匀，置40℃水浴中显色30min，以零管液为参比，于412nm处测吸光度，以吸取甲醛标液（S2）的体积为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制工作曲线。[2] 本法的优点： ①仅用1.00，5.00的环标刻度移液管吸取甲醛标液（S2）、50ml容量瓶定容，相当于国标中吸取甲醛标液（S2）的体积、定容的体积同时缩小10倍，但浓度相当；减少了由于不同刻度单标移液管之间的系统误差。 ②用吸取甲醛标液（S2）的体积ml数为横坐标，便于作图计算（计算方法见四、结果计算），提高了准确度和精确度。甲醛标液工作曲线图仪器名称：722N 可见分光光度计比色皿厚度：1.0cm 吸收波长：λ＝412nm HCHO标液浓度：C＝82.5600μg/mL 序号 1 2 3 4 5 6 吸取标液V，ml 0.00 0.20 0.50 1.00 1.50 2.00 吸光度，A 0.000 0.014 0.031 0.056 0.091 0.123 三、样品的测定：各吸取处理好的三个平行样品液5.0ml，加5.0ml乙酰丙酮溶液，摇匀，按标准曲线同样操作进行比色测定，测得吸光度A。[2] 如果样品褪色，则用水作参比液，吸取样品液5.0ml，加5.0ml水，摇匀，进行比色测定，测得吸光度Ad，则样品的吸光度为A－Ad。四、结果计算：由样品的吸光值A从甲醛标准曲线上查得相当于样品的体积V（ml），再换算成样品的浓度C（μg/mL）＝V×C（S2）/50 ，则甲醛的含量F计算公式如下： F＝C(S2) ×V ×100 50 m F–从织物样品中萃取的甲醛含量，mg/kg； C(S2)–甲醛标准溶液S2的浓度，μg/mL，即：mg/kg； V–读自工作曲线上相当于样品萃取的液中甲醛的体积，ml（因为吸取标液的体积与浓度反映在工作曲线上，是一一对应的，样品也同理）； 100–萃取样品用水的体积，ml； 50–制作标准曲线时，吸取甲醛标准溶液S2定容的体积，ml； m–试样的质量，g 。五、其它注意事项： ①定期校正标准工作曲线，因为过一段时间，吸光度会偏低，从而影响结果的准确性。 ②每次检测时，应保持条件的一致性，连贯性。

标准曲线的最小二乘法拟合和相关系数

标准曲线的最小二乘法拟合和相关系数（合肥工业大学控释药物研究室尹情胜） 1 目的用最小二乘法拟合一组变量（，，i＝1-n）之间的线性方程（y＝ax+b），表示两变量间的函数关系；（开创者：德国数学家高斯）一组数据（，，i＝1-n）中，两变量之间的相关性用相关系数（R）来表示。（开创者：英国统计学家卡尔·皮尔逊） 2 最小二乘法原理用最小二乘法拟合线性方程时，其目标是使拟合值（）与实测值（）差值的平方和（Q）最小。式（1）3 拟合方程的计算公式与推导当Q最小时，；得到式（2）、式（3）：式（2）式（3）由式（3）和式（4），得出式（4）和式（5）：式（4）式（5）

式（4）乘以n，式（5）乘以，两式相减并整理得斜率a：斜率（k＝xy／xx，n*积和-和积）式（6）截距b的计算公式为公式（5），也即：截距b＝（y-x）／n，差平均差）式（7）

4 相关系数的意义与计算公式相关系数（相关系数的平方称为判定系数）是用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。相关系数（也称积差相关系数）是按积差方法计算，同样以两变量与各自平均值的离差为基础，通过两个离差相乘来反映两变量之间相关程度；着重研究线性的单相关系数。相关系数r xy取值在-1到1之间。r xy = 0时，称x,y不相关；| r xy | = 1时，称x,y完全相关，此时，x,y之间具有线性函数关系；| r xy | < 1时，X的变动引起Y的部分变动，r xy的绝对值越大，x的变动引起y的变动就越大，|r xy | > 0.8时称为高度相关，当0.5< | r xy|<0.8时称为显著相关，当0.3<| r xy |<0.5时，成为低度相关，当| r xy | < 0.3时，称为无相关。 (式（7） 5 临界相关系数的意义 5.1 临界相关系数中显著性水平（α）与置信度（P）的关系显著性水平取0.05，表示置信度为95%；取0.01，置信度就是99%。在正常的分布条件下，一般要求实际值位于置信区间的概率应该在95%以上，这个置信区间为Y±2S，从而置信区间的上下限分别为：Y1=a+bX+2S，Y2=a+bX-2S。 5.2 临界值表中自由度（f）自由度(degree of freedom, f)在数学中能够自由取值的变量个数，如有3个变量x、y、z，但x+y+z=18，因此其自由度等于2。在统计学中，自由度指的是计算某一统计量时，取值不受限制的变量个数。通常f=n-k。其中n为样本含量，k为被限制的条件数或变量个数，或计算某一统计量时用到其它独立统计量的个数。自由度通常用于抽样分布中。 f=n—p—1 其中：n为样本数(点的个数)，p为因子数（p元回归，一元线性回归，p＝1）。