果汁DNA提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究

果汁DNA提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究
果汁DNA提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究

果汁DNA 提取方法比较及柑橘属植物分子生物学

检测技术的研究

刘伟红1

许文涛1,2商颖1,2程国灵1罗云波1,2黄昆仑1,2*

(1中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

2

农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)

北京100083)

摘要以橙汁为研究对象,选取市售100%橙汁及橙汁饮料各3种,采用CTAB 法、SDS-CTAB 法以及改良

CTAB 法提取其DNA ,对所提取的DNA 的浓度、纯度及扩增效率进行比较;同时选取橙UDP-葡糖基转移酶蛋

白基因设计柑橘属植物特异性扩增引物,通过定性PCR 检测其特异性和灵敏度,并应用于果汁中柑橘属植物的检测。实验结果证明,由改良CTAB 法获得的DNA 模板质量较高,适用于果汁中DNA 的提取。UGT 基因引物可对柑橘属植物产生特异性扩增,最低检测限为10pg/μL 。将该引用物用于市售橙汁的检测,其检测结果为阳性,从而证明UGT 基因特异性引物可用于果汁中的柑橘属植物成分的检测及鉴伪研究。关键词果汁;橙;DNA 提取;葡糖基转移酶基因;定性检测

文章编号

1009-7848(2012)04-0195-07

近年来,果汁及果汁饮料因具有较好的天然风味和较高的营养价值而深受广大消费者的喜爱。然而,全球果汁产量受加工能力、产品品质和原料产量及价格等诸多因素的制约,特别是原料果还受自然条件、病虫害等因素的影响,使国际市场上50%~80%的橙汁在不同程度上存在掺假问题[1]。另外,消费者一味追求低价而忽略产品成本等不健康的消费心理,也使不法生产商有空可钻。这不仅严重损害了消费者的利益和健康,而且扰乱了市场,影响生产和销售企业,乃至整个行业的声誉。因此,寻找快速、准确地鉴别果汁真伪和原果汁含量的方法具有重要意义。

目前,果汁鉴伪包括以下3种方法[2]:一是感官判别法,通过对果汁的色(颜色、色度、光泽、透明状)、香(挥发性物质)、味(风味、口感)、形(质感等)来鉴别;二是理化法,通过常规理化法和新型理化检测技术对可溶性固形物、总糖、总酸等常规

物质及果汁中的特定成分,如无机元素、还原糖、有机酸、氨基酸及其它成分进行检测;三是分子生物学技术,以DNA 水平为基础,采用常规PCR 、实时荧光PCR [3]、变性高效液相色谱分析(denatur -

inghigh performance liquid chromatography ,DH -PLC )等技术来鉴别。其中较为常用的是理化方法,例如Sass Kiss 等[4]利用西柚中的特征性肽类物质

制备多克隆抗体来鉴别掺假西柚果汁;山梨醇作为标志化合物,可用于果汁中苹果、梨等成分的检测[5];查尔酮根皮素葡萄糖苷和根皮素木糖葡萄糖苷也可作为苹果中特有成分,用来鉴别苹果汁是否掺假[6]。然而,常规的理化方法受品种、产地、收获季节、原料环境、加工条件、贮运包装方式等诸多因素的影响而限制了其应用空间。

现代生物技术以其简便、准确、快速的特点,从基因水平分析食品原料和产品的特性及来源。该方法灵敏度高,特异性强,在食品生物成分的鉴别方面展现广阔的应用前景。Ana Ortola-Vidal [7]等利用植物叶绿体rbcL 基因设计引物,进行PCR 扩增,并结合SNPs 成功检测树莓酸奶中的大黄酸奶掺假成分。陈文炳[8]等利用内源Lectin 基因和牛线粒体基因片段进行PCR 扩增,检测豆奶粉与奶粉中的大豆成分与牛奶成分。

收稿日期:2012-04-28

基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目(2006AA

10Z440);国家自然基金项目(No.30800770)和转

基因生物重大专项(2008ZX08012-001)资助

作者简介:刘伟红,女,1986年出生,硕士生通讯作者:黄昆仑

Vol.12No.4Apr .2012

Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology

中国食品学报

第12卷

第4期

2012年4月

中国食品学报2012年第4期

本文以橙汁为研究对象,对比CTAB法、SDS-CTAB法以及改良CTAB法提取果汁DNA的浓度、纯度及PCR扩增效率,选取适用的提取方法;同时选取橙UDP-葡糖基转移酶蛋白基因设计柑橘属植物特异性扩增引物,通过定性PCR检测其特异性和灵敏度,并应用于果汁中柑橘属植物的检测。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品材料果实样品14种,包括7种柑橘属植物(冰糖橙、脐橙、金桔、砂糖桔、芦柑、柚子、柠檬)以及苹果、桃、梨、草莓、葡萄、番茄、猕猴桃等;橙汁及橙汁饮料6种,包括100%橙汁3种(A、B、C),橙汁饮料3种(D、E、F),样品均购于北京超市。

1.1.2主要试剂DNA提取试剂:CTAB提取缓冲液[100mmol/L Tris-HCl(pH8.0),6mol/L Na-Cl,20mmol/L EDTA,20g/L CTAB],SDS提取缓冲液[2%SDS,200mmol/L NaCl,100mmol/L Tris (pH8.0),l%PVP,用时加入β-巯基乙醇使其体积分数至0.2%],蛋白酶K(20mg/mL),3mol/L醋酸钠(pH5.2),饱和酚/氯仿溶液1∶1(V/V),1×TE 缓冲液。其它试剂或溶剂均为分析纯级或生化纯级。

PCR扩增采用的rTaq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs,购于大连宝生物公司;RNase A酶,DNA Marker DL2000,普通DNA产物纯化试剂盒,购于Tiangen公司;PCR扩增引物,由上海生工有限公司合成。

1.1.3主要仪器与设备微量移液器,德国Ep-pendorf公司;ASP-3700型紫外分光光度计;普通PCR扩增仪,德国Eppendorf公司;电泳仪(DYY-6C),北京六一仪器厂;凝胶成像仪,北京六一东方电泳仪器公司;离心机(5804R型),德国Eppen-dorf公司。

1.2DNA提取

1.2.1果汁DNA提取

1)CTAB法:取1mL果汁于2mL离心管中,12000g离心10min,弃上清;加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液,振荡混匀,65℃温浴1 h,间期混匀几次;12000g离心10min,将上清液移至新的离心管中,加入等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),振荡均匀,12000g离心10min;吸取上清移至新的离心管中,重复前一步操作;吸取上清移至新的离心管中,加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),振荡均匀,12000g离心10min;吸取上清移至新的离心管中,加入2/3体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2),-20℃静置30min;取出样品,12000g离心10min,弃上清液,加入700μL70%乙醇洗涤沉淀,12000g离心10min;弃上清,将离心管倒置于超净工作台上10~15min,吹干沉淀;用80μL无菌超纯水溶解沉淀,加入2μL RNase A酶溶液,37℃温育环境中消化30min,-20℃保存备用。

2)SDS-CTAB法:取1mL果汁于2mL离心管中,12000g离心10min,弃上清;迅速加入600μL预热到65℃的CTAB提取缓冲液,振荡混匀,65℃温浴1h,间期不断混匀几次;取出样品后,加入400μL SDS提取液和3μL蛋白酶K,振荡混匀,65℃温浴20min;取出样品,12000g离心10 min;吸取1mL上清液移入新管中,加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),振荡混匀,12000g离心10 min;后面的操作同CTAB法,最后用80μL无菌超纯水溶解沉淀,加入2μL RNase A酶溶液,37℃温育环境中消化30min,-20℃保存备用。

3)改良CTAB法:取1mL果汁置于2mL离心管中,加入等体积的异丙醇,振荡混匀,-20℃沉淀30min;取出样品,12000g离心10min,弃上清,沉淀溶于500μL无菌超纯水中,加入等体积的异丙醇,振荡混匀,12000g离心10min;后面的操作同CTAB法,最后用80μL无菌超纯水溶解沉淀,加入2μL RNase A酶溶液,37℃温育环境中消化30min,-20℃保存备用。

1.2.2果实DNA提取采用CTAB法提取14种果实样品的DNA(方法同1.2.1节)。

1.3DNA提取质量的测定

取果汁DNA溶液2μL,用ASP-3700型紫外分光光度计测定以上3种方法提取的DNA在光波260nm和280nm处的紫外吸收值,通过OD260/ OD280和浓度值判断DNA的纯度和浓度,每份样品重复测定3次。

用植物通用引物18S基因[9]对提取的样品

196

第12卷第4期

用紫外分光光度计测定光波260nm 和280

nm 处的紫外吸收值分别代表盐浓度、核酸、蛋白质等有机物的吸光度值。对于高质量的DNA ,

OD 260/OD 280应在1.8左右。当OD 260/OD 280小于1.8时,DNA 中存在蛋白质和酚类物质的污染;反之,说

明DNA 样品中的RNA 尚未除尽。从表1数据可

DNA 进行扩增,以验证提取的果汁DNA 分子是

否适合于PCR 分析,扩增片段长度为187bp 。

引物序列为18S -F :GCCCGTTGCTCTGAT -

GAT ;18S-R :GGATGTGGTAGCCGTTTCT 。

用18S-ITS 引物[8]对提取的样品DNA 进行扩

增,以验证提取的果汁DNA 分子的完整性,扩增片段大小为2081bp 。

引物序列为18S -ITS -F :TGGTTGATCCT -

GCCAGTAG ;18S -ITS -R :GCCGAGATATCCGTT GCC 。

扩增体系:DNA 模板2μL (约50ng );10xPCR 反应缓冲液3μL ;dNTPs (10mmol/l ) 2.4μL ;上、下游引物(20μmol/L ) 1.5μL ;Taq DNA 聚合酶(5U/μL )0.2μL ,用无菌水补至总体积为30μL 。扩增反应程序为94℃预变性5min ;94℃变性30

s ,58℃退火30s ,72℃延伸30s ,共35个循环;72℃延伸5min 。反应结束后,用2%琼脂糖凝胶

电泳分析结果。

1.4特异性引物设计及验证

收集、比对序列(采用NCBI nucleotide blast

工具),以橙UDP-葡糖基转移酶蛋白UGT (Gen -

Bank No.gQ221689.1)为模板,利用Primer Ex -press 3.0软件设计1对特异性扩增引物,扩增片段长度为168bp 。

引物序列为UGT -F :CTGCAGTTGCTTCC -CAAATAA A ;UGT -R :TCCATGTCTTCATTTCCTT CACA 。

以冰糖橙、脐橙、金桔、砂糖桔、芦柑、柚子、柠檬7种柑橘属植物作为验证样品,验证引物UGT-

F/R 能否成功扩增柑橘属植物,无菌超纯水作为空白对照,进行PCR 扩增检测。

以脐橙作为验证样品,苹果、桃、梨、草莓、葡萄、番茄、猕猴桃等作为参照样品,无菌超纯水作为空白对照,进行PCR 扩增检测,以确定该引物的特异性。

以脐橙作为验证样品,将提取的DNA 溶液稀释为6个梯度(100ng/μL 、10ng/μL 、1ng/μL 、100

pg/μL 、10pg/μL 和1pg/μL )来验证特异性引物UGT 的检测灵敏度。在普通PCR 反应中,加入该

模板2μL ,用2%琼脂糖凝胶电泳分析结果,确定引物对脐橙DNA 的最低检出限。

1.5市售橙汁检测

按上述方法提取市售橙汁及橙汁饮料的

DNA ,用UGT 引物对提取的DNA 进行普通PCR 扩增(扩增体系同1.3节)。反应结束后,用2%琼

脂糖凝胶电泳分析结果。

2

结果与分析

2.1

果汁DNA 提取效率的比较

用CTAB 法、SDS 法、SDS-CTAB 法以及改良

CTAB 法提取3种100%纯果汁(A 、B 、C )以及3种果汁型饮料(D 、E 、F )的基因组,用ASP-3700型紫外分光光度计测定以上4种方法提取的DNA

的纯度和浓度,结果列于表1。

A 2.98±0.3 3.58±0.3 2.69±0.3 3.98±0.3 1.93±0.310.25±0.9

B 2.19±0.38.21±0.2 2.11±0.710.46±0.1 1.98±0.723.22±0.3

C 1.55±0.1 5.06±0.6 1.67±0.59.08±0.7 1.78±0.520.23±0.3

D 1.23±0.8 1.35±0.4 1.63±0.6 2.65±0.5 1.89±0.2 6.46±0.6

E 1.02±0.2 2.89±0.9 1.36±0.6 4.02±0.6 1.72±0.18.68±0.8OD 260/OD 280

DNA 质量浓度/

ng ·μL -1

OD 260/OD 280DNA 质量浓度/

ng ·μL -1

OD 260/OD 280DNA 质量浓度/

ng ·μL -1

CTAB 法SDS-CTAB 法

改良CTAB 法表1

不同方法提取的DNA 浓度和纯度的比较(a ±SD ,n =3)

Table 1

Comparison of purity and concentration of DNA extracted by different methods (a ±SD ,n =3)

果汁DNA 提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究

197

中国食品学报

2012年第4期

2081bp

注:M .DNA 相对分子质量标记(2000); 1.100%纯果汁A ; 2.100%纯果汁B ; 3.100%纯果汁C ; 4.果汁型饮料D ; 5.果汁型饮料E ;

6.果汁型饮料F ;B .空白对照(无菌超纯水)。

图1果汁基因组cob 基因PCR 电泳检测图谱Fig.1Electrophoresis profile of PCR products amplified

by cob gene primer in different juice samples

187bp

注:M .DNA 相对分子质量标记(2000); 1.100%纯果汁A ;

2.100%纯果汁B ;

3.100%纯果汁C ;

4.果汁型饮料D ;

5.果汁型饮料E ;

6.果汁型饮料F ;B .空白对照(无菌超纯水)。

图2果汁基因组18S-ITS 基因PCR 电泳检测图谱

Fig.2Electrophoresis profile of PCR products amplified

by 18S-ITS gene primer in different juice samples

对改良CTAB 法提取的3种100%纯果汁A 、B 、C 的基因组DNA 和3种果汁型饮料的基因组DNA 进行18S-ITS 基因的PCR 检测,琼脂糖凝胶

电泳结果如图2所示。使用改良CTAB 法提取的

DNA 样品可扩增出18S-ITS 基因的对应条带,说明提取的果汁基因组DNA 完整性较好,可用于后

续的PCR 检测研究。

2.2果实DNA 提取结果

CTAB 法提取果实基因组DNA ,用1%琼脂糖

凝胶电泳检测,其电泳图谱如图3所示。结果表明提取的果实基因组DNA 样品中无蛋白、RNA 等杂质残留,提取质量较好。

采用植物通用引物18S 基因对14种果实样品中的基因组DNA 进行扩增,琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示,结果表明从果实样品中提取的基因组DNA 质量良好,可用于后续的PCR 检测研究。

注:M .DNA 相对分子质量标记(2000);1.脐橙;2.冰糖橙;

3.金桔;4.砂糖桔;5.芦柑;6.柚子;7.柠檬;8.苹果;9.桃;10.梨;11.草莓;12.葡萄;13.番茄;14.猕猴桃。

图3果实基因组DNA 电泳检测图谱

Fig.3Electrophoresis patterns of different fruitgenome

187bp

注:M .DNA 相对分子质量标记(2000);1.脐橙;2.冰糖橙;3.金桔;

4.砂糖桔;5.芦柑;6.柚子;7.柠檬;8.苹果;9.桃;10.梨;11.草莓;12.葡萄;13.番茄;14.猕猴桃;B .空白对照(无菌超纯水)。

图4果实基因组cob 基因PCR 电泳检测图谱

Fig.4Electrophoresis profile of PCR products amplified

by cobgene primer in different fruit samples

以看出,改良CTAB 法提取的DNA 样品的OD 260/

OD 280相对另两种方法更接近1.8,且DNA 含量更

高,说明使用改良CTAB 法更适合提取果汁DNA 。

3种果汁型饮料D 、E 、F 的DNA 样品纯度高于3种100%纯果汁A 、B 、C ,这可能是由于100%纯果

汁中的蛋白质、多酚物质以及其它杂质含量较多,导致其纯度下降。

用植物通用引物18S 基因对改良CTAB 法提取的3种100%纯果汁A 、B 、C 的基因组DNA 和

3种果汁型饮料的基因组DNA 进行PCR 检测,琼脂糖凝胶电泳结果见图1。使用改良CTAB 法提取的DNA 样品,可扩增出18S 基因的对应条带,

说明提取的果汁基因组DNA 可用于后续的PCR 检测研究。

198

第12卷第4期

2.3特异性引物验证

为验证设计的引物UGT-F/R的特异性,以冰糖橙、脐橙、金桔、砂糖桔、芦柑、柚子、柠檬7种柑橘属植物作为验证样品,以及苹果、桃、梨、草莓、葡萄、番茄、猕猴桃7种果实作为参照样品,无菌超纯水作为空白对照,进行PCR扩增检测,琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。引物UGT可特异性地对7种柑橘属植物的基因组进行扩增,而对其它7种果实基因组无对应扩增条带产生,说明引物UGT特异性良好,可用于后续研究。

为验证特异性引物UGT的检测灵敏度,以脐

橙作为验证样品,将提取的DNA溶液稀释为6个梯度(100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10 pg/μL和1pg/μL)进行PCR扩增检测,琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。在PCR反应体系中橙的质量浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL时,可以检测到对应目的条带,且引物UGT的168bp目条带得到有效扩增,亮度依次减弱,在其含量为1pg/μL时,检测不到引物UGT的目的条带。因此,引物UGT的最低检测限为10pg/μL,灵敏度较高,可用于后续研究。

168bp168bp

注:M.DNA相对分子质量标记(2000);1.脐橙;2.冰糖橙;3.金桔;4.砂糖桔;5.芦柑;6.柚子;7.柠檬;8.苹果;9.桃;10.梨;11.草莓;12.葡萄;13.番茄;14.猕猴桃;B.空白对照(无菌超纯水)。

注:M.DNA相对分子质量标记(2000);1.100ng/μL;2.10ng/μL;3.1ng/μL;4.100pg/μL;5.10pg/μL;6.1pg/μL;B.空白对照(无菌超纯水)。

图6UGT基因特异性引物对橙基因组PCR检测

灵敏度电泳图

Fig.6Electrophoresis profile of UGTgene specific primer in PCR sensitivity detection of orangegenome

图5果汁基因组UGT基因PCR电泳检测图谱

Fig.5Electrophoresis profile of PCR products amplified by UGTgene primer in different fruit samples

2.4市售橙汁检测

应用改良CTAB法提取市售橙汁及橙汁饮料的DNA,并利用UGT引物对提取的DNA进行PCR扩增检测,琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。6种果汁DNA均可对UGT基因产生扩增,说明这些果汁中均含有橙成分,该方法可应用于果汁中橙成分的检测。

3讨论

果汁及其饮料为深加工产品,由于果汁中多糖、多酚、单宁、色素及其它次生代谢物质的影响[10-13],所以利用常规DNA提取方法很难提取到高质量的DNA。目前,报道的许多DNA的提取方法,常见的有SDS法、CTAB法、改良试剂盒法[14]注:M.DNA相对分子质量标记(2000); 1.100%纯果汁A; 2. 100%纯果汁B;3.100%纯果汁C;4.果汁型饮料D;5.果汁型饮料E; 6.果汁型饮料F;B.空白对照(无菌超纯水)。

图7果汁基因组UGT基因PCR电泳检测图谱Fig.7Electrophoresis profile of PCR products amplified by UGTgene primer in different juice samples

168bp

果汁DNA提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究199

中国食品学报2012年第4期

等。沈夏艳[14]等采用改良试剂盒方法提取的苹果汁DNA浓度较高,但是其果肉型苹果汁提取纯度不高。Chang-Chai Ng[9]等采用CTAB方法可以提取鲜榨橙汁DNA,但是不适合提取果汁饮料等的DNA。

本实验中采用CTAB法、SDS-CTAB法以及改良CTAB法提取果汁DNA,其中改良CTAB法是针对果汁存在的上述问题进行改进。因果汁中DNA含量相对较少,故果汁裂解前,采用异丙醇沉淀的方法富集果汁中的DNA,从而提高了DNA 的得率以及果汁鉴别的特异性和准确性。针对果汁富含多糖、多酚等此生代谢物质的特点,对CTAB裂解液进行改良,在裂解液中加入2%(体积分数)PVP与2%(体积分数)β-巯基乙醇,可抑制多酚氧化物与DNA的不可逆性结合,防止水果等样品的褐变,从而提高样品DNA的质量以及PCR扩增效率。

通过NCBI数据库序列的查找和筛选,选取橙UGT基因设计柑橘属植物特异性引物。对猕猴桃、苹果、梨、桃、葡萄等多种水果成分进行特异性筛选,建立了柑橘属植物成分的普通PCR检测方法。对果汁样品的检测表明,该方法能够检测果汁中的柑橘属植物成分,具有特异性强,灵敏度高等优点,可应用于果汁或食品中柑橘属植物成分的鉴别,为果汁鉴伪研究提供技术参考。

参考文献

[1]张奇志,邓欢英.我国食品安全现状及对策措施[J].中国食物与营养,2006,5:10-13.

[2]陈颖,黄文胜,葛毅强,等.食品鉴伪技术体系的研究与应用[J].食品工业科技,2008,29(7):216-218.

[3]韩建勋,黄文胜,葛毅强,等.果汁中梨成分分子生物学鉴伪-实时荧光PCR方法研究[J].中国食品学报,2010,

10(1):207-213.

[4]Sass-Kiss A.,Sass M.Distribution of various peptides in citrus fruits(grapefruit,lemon and orange)[J].J Agric

Food Chem,2002,50(7):2117-2120.

[5]刘学铭,肖更生,陈卫东,等.果汁鉴伪技术研究进展[J].食品与发酵工业,2006,32(6):87-91.

[6]Versari A.,Biesenbruch S.,Barbanti D.et a1.Adulteration of fruit juices:dihydrochalcones as quality markers for

apple juice identification[J].Lebensm.-Wiss.U.-Technol.,1997,(30):585-589.

[7]Ortola-Vidala A.,Schnerra H.,Rojmyrb M,et al.Quantitative identification of plant genera in food products using

PCR and Pyrosequencing?technology[J].Food Control,2007,18(8):921-927.

[8]陈文炳,朱晓南,邵碧英,等.应用PCR技术鉴定豆奶粉、奶粉及果汁饮料中的有效成分[J].中国食品学报,

2006,6(1):362-366.

[9]Chang-Chai Ng,Chen-Chin Chang,I-Chieh Wu,et al.Rapid molecular identification of freshly squeezed and re-

con-stituted orange juice[J].Int.J.Food Sci.Technol.,2006,41:646-651.

[10]Ausubel F M.,Brent R.,Kingston R E.,et al.Current protocols in molecular biology[M].New York:Greene Publish-

ing Associates and Joth Wiley&Sons,1992.

[11]Adam R E.Shear degradation of DNA Nucleic Acids[J].Res,1997,4:1513-1537.

[12]党尉,尉亚辉,张华平,等.葡萄总DNA提取方法的比较研究[J].西北大学学报(自然科学版),2003,10(5):

572-574.

[13]Klein J.,Altenbuchner J.,Mattes R.Nucleic acid and protein elimination during the sugar beet manufacturing pro-

cess of conventional and transgenic sugars beets[J].Biotechnol,1998,60:145-153.

[14]沈夏艳,陈颖,葛毅强,等.苹果汁中DNA提取方法的比较及RAPD扩增研究[J].中国食品学报,2008,8(2):

18-23.

200

第12卷第4期

中科院培育出能抗衰老番茄富含抗氧化剂

历经10年攻关,近日,中科院昆明植物所黄俊潮研究组与北京大学、香港大学合作,培育出世界首例能高产虾青素的工程番茄新品种,其富含自然界中最强的抗氧化剂虾青素,具有极大的产业化和商业化应用前景。

虾青素是人类从河蟹虾外壳、牡蛎和鲑鱼等来源中发现的一种特殊的红色类胡萝卜素,其抗氧化功能是维生素E 的500倍。虾青素具有保护皮肤和眼睛,抵抗辐射、心血管老化、老年痴呆和癌症等功效。

虾青素的生物合成只发生于少数生物且产量很低。雨生红球藻是自然界中虾青素含量最高的生物,是目前唯一用于商业化生产天然虾青素的单细胞真核绿藻。由于生长慢,加上对生长环境敏感的遗传特性,雨生红球藻粉的生产规模小,生产成本高,且产品质量难以保证。

植物是理想的虾青素加工厂,番茄中的β-胡萝卜素与虾青素同属于类胡萝卜素,化学结构相似。该研究小组对微藻青虾素的合成途径及催化关键步骤的限速酶基因做了全面的分析,解决了限制高等植物合成虾青素的关键问题,并成功研制出能高产虾青素的工程番茄新品种,其果实能累积与雨生红球藻相近含量,高达1.6%的虾青素。

“更重要的是,番茄作为经济植物可实现规模化生产,且耕作简单,成本低。预计用番茄生产虾青素的利润率至少是雨生红球藻的5倍。”黄俊潮说。目前,高产虾青素番茄新品种正在申请专利。

(消息来源:中国科学报)

Comparison on the Extraction Method of DNA and Study on the Biotechnological Detection

of Orange Component in Juice

Liu Weihong 1Xu Wentao 1,2Shang Ying 1,2Linh Trinh Quoc 1Luo Yunbo 1,2Huang Kunlun 1,2*

(1College of Food Science and Nutritional Engineering ,China Agricultural University ,Beijing 100083;

2

Supervision and Testing Center for GMOs food safety ,Ministry of Agriculture ,Beijing 100083)

Abstract

Three methods ,including CTAB Method ,SDS-CTAB method and modified CTAB method ,were used to

extract DNA from both pure orange juice and juice beverage ,then the quality and quantity of DNA were analyzed by spectrophotometer and PCR amplification ;the orange-specific primers were designed according to the sequence of UDP-glucoxyltransferase protein gene.The results showed that modified CTAB method was more suitable for the juice DNA ex -traction than the other two methods ;the orange component could be detected by the orange-specific primers with a limit of detection of 10pg/μL.The following detection of fruit juice samples showed that this method was suitable to identified the orange component in fruit juice and other relative food and can provide a technique base for research of fruit juice adulteration detection.

Key words

juice ;orange ;DNA extraction ;glucoxyltransferase ;qualitative detection

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"

果汁DNA 提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究

201

植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(大于0.7 M NaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快,其次为线状DNA(L DNA),最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml,ssDNA 33 μg/ml和ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μl量程各一支)、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 70%乙醇 RNaseA 0.5×TBE缓冲液(工作浓度) 凝胶加样缓冲液(6×) 6. 核酸染料 7. DNA marker 8. 酚/氯仿(1:1, V/V)

植物基因组DNA提取

植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器:高速离心机;烘箱;冰箱;水浴锅;高压灭菌锅;Nanodrop。 实验试剂:玻璃珠,十二烷基磺酸钠(SDS);三羟甲基氨基甲烷(Tris);乙二胺四乙酸(EDTA);氯化钠;苯酚;氯仿;无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中,液氮速冻,组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液,涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中,每隔10 min轻轻摇动,30 min后取出。

5.加入200 μl KAc溶液,摇匀,放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min,上清移至新离心管中,12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中,加入700 μl异丙醇,-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min,弃上清,加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体,晾干。 10. DNA纯度与浓度测定(使用nanodrop)。 (1)DNA纯度:DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8:说明较纯; OD260/OD280 > 1.8:说明可能有RNA污染; OD260/OD280 < 1.8:说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用? 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些? 3.植物DNA提取后的用途有哪些? 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。

植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)培训资料

植物基因组D N A提取试剂盒(北京天根)

植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg,加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后,将离心管放在65℃水浴20 min,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿,充分混匀,12,000 rpm(~13,400×g)离心5 min。 注:若提取富含多酚或淀粉的植物组织,可在第3步前,用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中,加入700 μL缓冲液GP2,充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12,000 rpm(~13,400×g)离心30 s,弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右,可分次加入离心。) 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm(~13,400×g)离心30 s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm(~13,400×g)离心30 s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中,12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂

洗液。 注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min,将溶液收集到离心管中。 注意:洗脱缓冲液体积不应少于50 μL,体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室温放置2 min,12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。

植物DNA提取方法

1.2实验方法 1.2.1 茶花基因组DNA的提取 采用CTAB法[8]提取DNA,所有试剂(有机溶剂除外)和器皿都经高压灭菌,主要步骤如下: (1)取两片幼嫩新鲜叶片,置于预冷的研钵中,倒入适量液氮,迅速研磨成粉末状,随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇,继续研磨成略有流动性的糊状或粥状,转入1.5ml的离心管中,于65℃水浴锅中保温约60min. (2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI(氯仿:异戊醇=24:1)溶液混匀,轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液,常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 (3)重复步骤(2)一次。 (4)取步骤(3)上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,-20冰箱30min以上,沉淀DNA 4℃,12000rpm离心10min. (5)弃去上层有机溶剂,加500ul75%乙醇洗涤沉淀,4℃下8000rpm离心5min,弃去上清,洗涤沉淀3次。 (6)倒置或者37度培养箱烘干. (7)加50ulTE缓冲液溶解DNA,于-20℃冷藏备用。 1.2.2 DNA含量和质量的测定 (1)紫外分光光度法:取4ml提取的DNA,将之稀释200倍,测定提取的DNA在260nm 和280nm处的吸光度值,得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高,需纯化。 (2)琼脂糖凝胶电泳:配制1.0%琼脂糖凝胶,在0.5×TBE缓冲液中,电压5V/cm电泳约60min,溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。 1.2.3 PCR扩增 (1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行,反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer 2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约

植物DNA提取

实验1 植物DNA的提取 实验目的 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析。 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。 实验原理 1、原理 核酸是生物有机体中的重要成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类,在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中,后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1~2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA 核蛋白的溶解度很 小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液,就能将蛋白等杂质较彻底地除去,得到较纯的

DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA,可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖,在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中,核酸极不稳定,许多因素可破坏其完整结构:①化学因素,核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定,pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性。又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免。③酶的作用,细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来,它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂,同时可使核酸酶被破坏而失活。 2、DNA的提取原理 (1)CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法:先将新鲜的叶片在液氮中研磨,破碎其细胞,然后加入CTAB分离缓冲液,将DNA溶解出来,再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质,最后得到DNA。 (2)SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁,然后加入SDS使细胞膜破裂,并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使沉淀更加完全。 3、DNA的浓度测定和纯度分析 (1)定磷法:是对样品中核酸(DNA和RNA)含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸(硫酸或高氯酸)消化成无机磷,然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液,钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物,该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝,在660nm处有最大光吸收。 (2)紫外光吸收法:核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。

实验报告-植物基因组的提取和检测

题目:植物基因组DNA的提取与检测 一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理; 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨,破碎细胞; 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使核蛋白解聚,从而使DNA游离出来; 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质; 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE缓冲液中,即得植物基因组DNA 溶; 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:带电荷的物质,在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率(U)的对数与凝胶浓度(T)之间存在反平行线性关系。因此,要有效地分离不同大小的DNA片段,选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 (1)细胞提取液:100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS,1%β-巯基乙醇(去除酚类) (2)氯仿:异戊醇(24:1) (3)其它试剂:液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液 四、方法和步骤 1、取500μL细胞提取液于650C水浴(金属浴)中加热备用; 2、研钵用液氮预冷,新鲜植物叶片(自来水清洗,蒸馏水冲洗干),去除叶脉,剪成细条状,置于研钵中研磨成粉末状(越细越好); 3、取0.1g粉末(大约两勺半)转移至500μL预热的细胞提取液中,迅速摇匀,650C 水浴(金属浴)中保温30min,10min左右温和颠倒混匀一次; 第 1 页

植物组织DNA的提取和鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 1.通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的方法。 2.了解CTAB的成分及作用。 3.学习PCR的原理并掌握其方法。 4.学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。 实验原理 植物组织中绝大部分是核DNA,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起,以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,简称CTAB):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中。DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质,它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用,是分子生物学和基因工程研究的对象,但无论是研究植物DNA的结构和功能,还是开展外源DNA的转化、转导的研究,首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。 T-DNA,转移DNA(transferred DNA ),是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,获得转基因植株。除用于转基因以外,T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活,从而产生基因敲除突变体;T-DNA大多为单拷贝插入,使其利于进行遗传分析。 PCR基本原理: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于在体外快速扩增DNA,具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对

植物基因组 DNA 提取

植物基因组D NA 提取 2ml 离心管提取 取新鲜叶片采用C TAB 法,按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法,略加改进,具体操作过程如下: 1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片; 2. 液氮充分研磨成粉末,加入900 μL CTAB 缓冲液; 3. 65 ℃水浴1小时,期间摇匀3次; 4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下; 5. 加入900 μL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇,上下混匀2-5 分钟,保证样品与氯仿 充分混合; 6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟; 7. 取上清液约800 μL,加入预先加好的700 μL 异丙醇的1.5 ml 离心管中,轻 轻上下颠倒混匀; 8. -20℃冰箱静止30 分钟以上; 9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟,弃上清夜; 10. 75%酒精洗涤沉淀,弃上清液,12,000 rpm 离心15-20 分钟; 11. 风干D NA,让酒精挥发干净(4 小时以上或过夜); 12. 加入100 μL 的纯水(含终浓度为1%RNase)溶解D NA; 13. 放入37 ℃环境中,约60 分钟消化R NA; 14. 取2 μL DNA 进行检测。 50ml 离心管提取 取新鲜叶片采用C TAB 法,按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法,略加改进,具体操作过程如下: 1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末; 2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末,至刚好覆盖住管圆底部,加入20mlCTAB 缓 冲液充分混匀; 3. 65 ℃水浴1小时,期间摇匀3次; 4. 取出,冷却至15 ℃以下; 5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇,上下混匀2-5min,保证样品与氯仿

植物基因组DNA提取二方法

一、植物基因组DNA提取 【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。 【仪器、材料、试剂】 (一) 仪器 1.高速离心机 2.烘箱 3.冰箱 4.水浴锅 5. 高压灭菌锅 (二)材料 1.十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 2. 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4. 氯化钠

5.2-巯基乙醇 6. 无水乙醇 7. 氯仿 8. 异戊醇 (三)试剂 1. CTAB抽提缓冲溶液: 250ml 配制方法:称取CTAB 4g,放入200 ml的烧杯,加入5 ml的无水乙醇,再加入100ml的三蒸水,加热溶解,再依次假如56 ml的5mol\l NaCl、20 ml 的1 mol\l Tris-HCl 20ml( PH8.0)、8ml 的0.5 mol/l EDTA定容至250 ml摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温, 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇(400ul),4℃保存。 2. 氯仿:异戊醇=24:1(配制方法如实验二) 3.TE缓冲液: PH8.0(配制方法如实验二) 【实验步骤】 (一) DNA的提取 1. 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热; 2. 取少量叶片置于试管中,用小杵磨至粉状; 3. 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动摇匀; 4. 置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10 min轻轻摇动,40 min后取出; 5. 冷却2 min后,加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管,振荡2~3 min,使两者混合均匀; 6. 10000 rpm离心10 min,与此同时,将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中; 7. 10000 rpm离心1 min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30s,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物; 8. 10000 rpm离心1 min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出 9. 加入800 μl 75%的乙醇,将DNA洗涤 30 min; 10. 10000 rpm离心30s后,立即倒掉液体,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干); 11. 加入50 μl 0.5 × TE缓冲液,使DNA溶解; 12. 置于-20℃保存、备用。

实验2、植物基因组DNA的提取

实验二、植物基因组DNA的小量提取 【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因DNA水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。 【实验材料】 拟南芥叶片 【试剂和器材】 DNA提取液(1L):称取24.228g Tris-HCl(0.2M, pH=9.0),LiCl 16.956g(0.4M),EDTA9.306g(2.5mmol/L),全部溶解完全后加入10g SDS先加入少量双蒸水搅拌至透明定容。 器材:研钵,恒温水浴,离心机,离心管等。 【实验步骤】 1、剪取新鲜幼嫩的植物叶片1~2片于1.5 mL离心管中. 2、先加入少量的DNA提取液100 μL,用研磨棒充分研磨尽量避免提取液溅出。 3、再加入600 μL的DNA提取液,使DNA提取液的总体积为700μL,上下颠倒混合均匀。 4、放入高速离心机4℃条件下12 000 rpm离心15 min。 5、取上层水相,移入标有相应序号的新的离心管中,加入600 μL的异丙醇(与加入DNA 提取液的总体积相同),上下颠倒混匀。放置于-20℃冰箱中40 min或以上,使DNA沉淀。 6、放入高速离心机,4℃条件下12 000 rpm离心10 min,沉淀DNA,弃上清。 7、加入1 mL 70%的乙醇洗涤,放入高速离心机,4℃条件下12 000 rpm离心5 min。 8、重复步骤(7),洗去DNA中的杂质。 9、将离心管倒置在吸水纸上,待干燥后,加入20 μL 60℃双蒸水,DNA完全溶解后,放4℃ 冰箱待用,长期保存需放入-20℃。 【实验结果】 可以看到管底有沉淀,待检测

实验四 植物DNA的提取

实验四植物DNA的提取 一、实验目的 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析。 二、实验原理 1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有机体中的重要成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类,在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中,后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1~2 mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14 mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理,然后离心分层,DNA溶于上层水相,蛋白变性后则停留在酚层内。 吸出上面水层,加两倍体积的无水乙醇溶液,得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液,就能将蛋白等杂质较彻底地除去,得到较纯的DNA制品。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA,可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖,在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中,核酸极不稳定,许多因素可破坏其完整结构:①化学因素,核酸的结构在pH值4.0~11.0间较稳定,pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性,又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免。③酶的作用,细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来,它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 SDS和苯酚作为蛋白变性剂,同时可使核酸酶被破坏而失活。

植物基因组DNA提取步骤

植物基因组DNA提取实验操作步骤 1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg,加入液氮充分研磨。(植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。 注: 1、液氮的温度是-196℃,不要冻伤自己的手,带上手套。 2、用一个保温杯,大一点的,把液氮取出来放在保温杯里,盖上盖子。 3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。 4、将样品快速放入研钵中,快速研磨,在液氮挥发完之前再加入液氮,一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态,这样样品中DNA容易降解。 5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了,用药勺把样品迅速舀到1.5ml 离心管里。) 2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后,将离心管放在65℃水浴20min,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。(水浴时间依实验具体情况而定,看样品裂解情况,具体看裂解液变得清澈透明为止) 3加入700μL氯仿,充分混匀,12,000rpm(~13,400×g)离心5min。 注:若提取富含多酚或淀粉的植物组织,可在第3步前,用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。 4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中,加入700μL缓冲液GP2,充分混匀。 5将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12,000rpm(~13,400×g)离心30s,弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右,可分次加入离心。) 6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。 8重复操作步骤7。 9将吸附柱CB3放回收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂

植物DNA提取方法总结

植物DNA的提取分离技术 摘要:主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法:CTAB法、SDS法等,并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时,并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词:植物DNA 提取方法研究进展 市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12],其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异,因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时,也针对不同的植物,在传统的提取方法上进行着一些新的改良。 1.十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法 在目前众多的DNA提取方法中,CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞,又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀,因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽

提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1.2 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl 提供一个高盐环境,使DNP 充分溶解,在于液相中; CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离。 β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。 1.3适用范围及一些改良 由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀,因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中,相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。为了缩短提取流程,提高提取质量,研究人员在传统方法的基础上,针对不同植物的特点,对一些提取步骤进行了改进。李先进[11]在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现,由于酚类物质极其容易被氧化,因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PVP,以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化,从而获得更为理想的DNA。黄永莲[5]

植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析

《分子生物学》实验报告 实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】

通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(大于0.7 M NaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快,其次为线状DNA(L DNA),最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL,ssDNA 33 μg/mL和ssR NA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若DNA的A260/A280比值高于2.0,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品

植物基因组提取(CATB法)

植物基因组提取(CATB法) 一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇(400ul)氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 (1)2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 (2)取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状; (3)加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动; (4)将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中,磨碎液的高度约占管的三分之二; (5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10 min轻轻摇动,40 min后取出; (6)冷却2 min后,加入氯仿-异戊醇(24:1)至满管,剧烈振荡2~3 min,使两者混合均匀; (7)放入离心机中10 000 rpm离心10 min,与此同时,将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中; (8)10 000 rpm离心1 min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30 sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物; (9)10000 rpm离心1 min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上; (10)60 sec后,直立离心管,加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中; (11)放置30 min,使DNA块状物的不纯物溶解; (12)10000 rpm离心1 min后,倒掉液体,再加入800 µl 75%的乙醇,将DNA再洗

实验一 CTAB法提取植物基因组DNA

实验一CTAB法提取植物基因组DNA 实验目的: 学习从植物组织中(幼叶)提取基因组DNA的基本原理和方法。 实验原理: 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类),其对DNA的抽提产生不利的影响,所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀(CTAB能溶于乙醇)即可使核酸分离出来。 CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出,因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热(65度),且离心温度不要低于15度。 实验步骤: 1、取幼嫩的植物叶片(3-5g)剪碎液氮研磨成粉,转入1.5ml离心管内。加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。 2、加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),轻轻上下颠倒5分钟,静置5分钟,之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相,重复步骤2一次。 4、吸取上层水相,加入预冷2/3体积的异丙醇,轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min,待DNA沉淀后于12000rpm离心收集,收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。 5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA(10mg/ml),37℃保温1h以除去DNA中的RNA。 6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿:异戊醇(24:1)轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。 7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇,接着置于-20℃冰箱,10分钟后10000rpm离心10分钟,弃去无水乙醇,加入70%乙醇洗涤2-3次,风干,最后将DNA溶于适量(200-500μl)TE中。

相关主题
相关文档
最新文档