第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术

第一节微生物的分离和纯培养

一、无菌技术

在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。

1、微生物培养的常用器具及其灭菌

（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。

（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。

（3）高温干热灭菌。

2、接种操作

无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。

二、用固体培养基获得纯培养

1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。

2、涂布平板法

3、稀释倒平板法

4、平板划线法

5、稀释摇管法

对氧气更加敏感的厌氧型微生物。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。

三、用液体培养基获得纯培养

对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。

稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。

只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。

四、单细胞（孢子）分离

采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。

较大的微生物较容易，个体较小的较难。

对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。

五、选择培养

根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。

1、选择平板培养

2、富集培养

制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。

六、微生物的保藏技术

1、传代培养保藏

琼脂斜面、半固体琼脂柱、液体培养。选择合适的培养基，并在规定时间内移种。通过降低微生物的代谢水平或防止培养基干燥，可延长保藏时间。

（悬液保藏法）

繁琐、容易污染，菌种自发突变导致菌种衰退。

2、冷冻保藏

体积大的比体积小的对低温更敏感，无细胞壁的对有细胞壁的更敏感。低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。

速冻、快速升温。加入保护剂。

（液氮冷藏-196、冰箱保藏）

3、干燥保藏法

（1）沙土管保存：适用于产孢子的微生物，培养后洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌沙土管中，减压干燥，直至水分抽干，封闭管口，置冰箱保存。

（2）冷冻真空保藏：将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，在真空中通过冰的升华除去水分，在真空或惰性气体的密闭环境中低温保存。

干燥、低温、缺氧。（目前最普遍最重要）

第二节、显微镜和显微技术

一、显微镜的种类和原理

1、普通光学显微镜

机械装置和光学系统。

2、暗视野显微镜

利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜。因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。

主要用于观察生活细菌的运动性。

3、相差显微镜

细胞不同部位密度不同，折射率和厚度不同，直射光和衍射光的光程就会有差别。相差显微镜的环状光阑和相差板，将光的相位差转变为振幅差（明暗差），使得原来透明的物体表现出明暗差异。

观察活细胞和某些细微结构。

4、荧光显微镜

原理：紫外线照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。

5、透射电子显微镜TEM

电磁波代替可见光，工作原理与光学显微镜十分相似。

6、扫描电子显微镜SEM

工作原理类似于电视或电传真照片。主要用于观察样品的表面结构，成像具有立体感。

7、扫描隧道显微镜STM

利用了量子力学的隧道反应。目前分辨率最高，可避免样品的变形。

二、显微观察样品的制备

1、光学显微镜的制样

（1）活体观察

采用压滴法、悬滴法、菌丝埋片法在明视野、暗视野、相差显微镜下观察。

避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性、生长过程中的形态变化。

（2）染色观察

固定样品：杀死细菌病使菌体粘附于玻片上；增加其对染料的亲和力。火焰加热和化学固定。

染色：正染色（革兰氏染色）、负染色、活菌染色。

2、电子显微镜的制样

样品在观察前必须进行固定和干燥，一般采用重金属盐染色或喷镀，提高反差。

（1）透射电镜的样品制备

1)负染技术

用电子密度高，本身不显示结构，与样品几乎不反应的物质来对样品染色。重金属盐不被样品吸附而是沉积到样品四周。

2)投影技术

在真空蒸发设备中，将铂或铬等对电子散射能力较强的金属原子，由样品的斜上方进行喷镀，提高样品的反差。喷镀上的为暗区，没有喷镀上的为亮区，可了解样品的高度和立体形状。

3)超薄切片技术

100nm一下的超薄切片，方能看清其内部的细微结构。取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、观察

（2）扫描电镜的样品制备

利用电子束作光栅状扫描以取样品的形貌信息。

要求样品干燥，表面导电。所以需要去除水分，表面喷镀金属导电层。

保持样品形状的关键是样品干燥。

干燥方法有：自然干燥、真空干燥、冷冻干燥、临界点干燥。

第三节显微镜下的微生物

一、细菌和古生菌

1、细菌的形态和排列

基本形态：球状、杆状、螺旋状

放线菌菌丝：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝的形态特征是放线菌的重要鉴定指标。

细菌形态明显受到环境条件的影响

2、古生菌

与细菌形态相似，多生活在条件恶劣的极端环境中，如高盐、高温、高酸3、原核生物的细胞大小

显微镜测微尺、投影法制成照片，再按放大倍数测算。

球菌大小以其直径表示，杆菌和螺旋菌以其长度和宽度表示。

二、真菌

霉菌、酵母菌、大型真菌都是真核微生物

1、霉菌：丝状真菌的统称，霉菌菌体均由分支或不分支的菌丝构成。

许多菌丝交织在一起，成为菌丝体。

霉菌菌丝有两类：无隔膜菌丝，长管状单细胞，生长表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加；有隔膜菌丝，多细胞。

固体培养基上：营养菌丝，部分菌丝伸入培养基内吸收养料；

气生菌丝，向空中生长；

繁殖菌丝，气生菌丝发育到一定阶段分化而成。

可广泛被用来生产酒精、抗生素、有机酸、酶制剂、维生素、甾体激素。

2、酵母菌

以芽殖和裂殖进行无性生殖。

大多数为单细胞，一般卵圆形、圆形、圆柱形、柠檬形。

二、藻类

除苔藓和维管束植物外。

四、原生动物

缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动功能，并进行吞噬营养的炎细胞真核生物。