细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏
细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则

冻存细胞的理论基础

当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反.结晶就大,大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。

细胞冻存方法

预先配制冻存液:20%血清培养基

10%DMSO (二甲基亚砜)

取对数生长期细胞1ml于冻存管中,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1×106—5×106细胞/ml),密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

慢冻程序

标准程序(放哪里?)

当温度在-25 ℃以上时,1-2 ℃/min

当温度达-25 ℃以下时,5-10℃/min

当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中

简易程序

将冻存管于4℃放置1小时,于-20℃放置1小时,通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口(-70℃),放置1小时,后直接投入液氮中(-196℃)

细胞复苏方法

从液氮中取出冻存管,迅速投入37℃水浴中,使其融化(1分钟左右)注意防护(冻存管爆炸)!

5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上

低速离心10分钟

去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞

低温保护剂的应用

在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。

注意事项:

在使用DMSO前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有毒,故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出,可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样的细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,要复苏1~2管,以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管,不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时,需要从-196 ℃的液氮中取出冻存管,立即投入37℃温水中,温差很大,玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

污染的类型

细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物,而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质,包括生物(真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质和细胞(非同一种的其他细胞)。

微生物污染的途径

空气:微生物传播的最主要途径。

器材:清洗消毒不彻底。

操作:无菌观念不强,操作不规范。

血清:支原体或病毒污染。

组织样本:造成原代培养污染。

微生物污染对细胞的影响

体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力;

培养基中加入的抗生素的抗污染能力有限;

培养细胞一旦发生污染,多数将无法挽救;

污染早期或污染程度较轻时,及时处理,部分细胞有可能恢复。

污染物持续存在对细胞的影响:

轻者细胞生长缓慢,分裂相对减少,细胞变得粗糙,轮廓增强,胞质中出现较多的颗粒状物质;

重者细胞增殖停止,分裂相消失,胞质中出现大量的堆积物,细胞变圆或崩解,从瓶壁脱落。

微生物污染的检测

真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孢子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。

培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

细菌污染

细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。

培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。

支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除干净,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6-8.0)下生存,对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。

病毒污染

采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞和会发生变异、转化,形成异倍体的细胞系。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

非同种细胞污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。

化学成分的污染

非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。污染的鉴别

1、细菌、真菌污染的检测

(1)肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起。

(2)镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

(3)接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可发现是否有污染。

支原体污染的检测

(1)相差显微镜观察

将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片),24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物,细胞面向上放置于载物片上,再盖上较大盖玻片,用相差油镜观察;若不用支持物培养法,直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间,有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别

(2)低渗溶涨处理地衣红染色观察

固定染色法,通过对细胞低渗处理,使细胞体积扩张,细胞膜表面的褶皱和结构减少,使附在细胞表面的支原体容易被识别。

取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液,用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次,每次10

分钟,取出盖片凉干。用培养液时,先吸取1mL,500~800r/min离心5分钟后去除上清,留0.2mL,将0.5%枸椽酸溶液加入其中,置10分钟,加入Carnoy液固定,离心弃上清固定液,余0.2mL沉淀物,制成2~3张涂片。然后用2%醋酸地衣红(地衣红2g,冰醋酸60mL,加蒸馏水至100mL)染5分钟。纯酒精过三次,每次1分钟,封入Euparal 或树胶中。若染色过深,可先用75%酒精脱色,再封片。镜下观察见支原体呈暗紫色小点,位于细胞外或细胞之间。

(3)荧光染色法观察

用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,然后用荧光显微镜观察。染色方法为:用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上,在细胞汇合前(即未长满前)取出玻片,于碟皿中,用不含酚红的Hanks液漂洗,1:3醋酸钾固定10分钟,再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟,置于蒸馏水漂洗1~2分钟,向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液,然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液,先离心去除上清液,再加入Hanks液漂洗,离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟,再用生理盐水漂洗后去上清液,再用Hoechst33258染色10分钟,加入蒸馏水漂洗,离心去上清蒸馏水,加3~5滴pH5.5磷酸缓冲液,稍吹打使沉淀细胞重悬浮,用吸管吸出,滴于载物片上,盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈亮绿色小点,散在于细胞周围或附于细胞表面。

(4)电镜检测若条件许可,可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48~72小时,细胞接近汇合前,用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。

(5)培养检测将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基(Sigma或北京生物制品所生产的均可),培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀,然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中,再用琼脂培养基做分离培养,37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

污染的清除和预防

污染的清除

培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。

1、使用抗生素

抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL),污染后清除用药需采用大于常用量5-10倍的冲击处理,于加药后作用24-48小时,再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外,还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用

400-800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理,每隔2-3日换液1次,传1-2代进行治疗。

2、加温处理

将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验,摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后,再以41℃加温处理效果更佳。

3、使用支原体特异性血清

用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦,不如用抗生素方便、经济。

4、其他方法

除了上述去除污染的方法外,还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等,但均较麻烦,且效果不确定。所以一旦支原体污染,除非有特别重要价值,一般均弃之重新培养。

污染的预防

预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手:

1、从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

2、从操作者做起

(1)操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。

(2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。(3)操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

3、防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。

在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。

基础篇-细胞冷冻保存(一)

1. 注意事项:

1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 –90 %致密度。

1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。

1.4. 冷冻保存之细胞浓度:

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml

1.4.

2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。

1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。

1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。

1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 %DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止

冷冻失败。

1.6. 冷冻方法:

1.6.1. 传统方法: 4℃10 分钟---> -20℃30 分钟---> -80℃16 - 18 小时(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 长期储存。

1.6.

2. 程序降温:利用等速降温机以–1 - -3℃/分钟之速度由室温降至–120℃,放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。

基础篇-细胞冷冻保存(二)

2. 材料:

2.1. 生长良好之培养细胞

2.2. 新鲜培养基

2.3. DMSO (Sigma D-2650)

2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)

2.5. 0.4 %w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.6. 血球计数盘与盖玻片

2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)

3. 步骤:

3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。

3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO 加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10%,混合均匀,置于室温下待用。

3.3. 依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。

3.4. 离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1 ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。

3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃10 分钟→-20℃30 分钟→-80℃16-18 小时(或隔夜) →液氮槽vapor phase 长期储存。

3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中,再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL

基础篇-冷冻细胞活化

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。

2. 细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3. 材料

37℃恒温水,新鲜培养基,无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶,液氮或干冰容器。

4. 步骤:

4.1 操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。

4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温,回温后喷以70 % 酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。

4.4 取出冷冻管,立即放入37 °C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使

其在1 分钟内全部融化,以70 % ethanol 擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。

4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10~1:15),混合均匀,放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。

4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内,离心1,000 rpm, 5 分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2 培养箱培养。

4.7 若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。基础篇-收到细胞的处理方式(一)

1. 收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形,若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70°C,隔夜后,移到液氮)。

2. 冷冻细胞解冻程序:

2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类,若因实验需要,必须有所不同时,务必以缓慢比例渐次改变培养基组成,确定细胞适应后,方进行所需之实验。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和

HS (horse serum, 马血清),对细胞而言差异极大,请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。

2.3. 将培养基置于37°C 水槽中回温,回温后喷以70% 酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。取出冷冻管,立即放入37°C 水槽中快速解冻,水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿,否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后,以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部,移入无菌操作台内。

2.4. 依据细胞种类和浓度,于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液,缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基,混合均匀,放入37°C,5 % CO2 培养箱培养。

2.5. 对绝大多数细胞而言,1% 以下之冷冻保护剂DMSO,不会对细胞之贴附或活化有不良影响,不需立刻由解冻细胞中去除,待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞,需立即去除DMSO 者,则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中,离心300 xg (约1000 rpm),5分钟,小心移去上清液,加入适量新鲜培养基,将细胞均匀混合后,转移至培养瓶中,再放入37°C,5% CO2 培养箱培养。

基础篇-收到细胞的处理方式(二)

收到T25 flask 细胞时,处理方式为︰

1. 于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。

2. 将原封之T25 flask 静置于37°C,5% CO2 培养箱中,使细胞回温至37°C,并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后,于无菌操作箱内取出flask内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5-10ml 培养基于flask 内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘,则将细胞做传代培养。

细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则 冻存细胞的理论基础 当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反.结晶就大,大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。 细胞冻存方法 预先配制冻存液:20%血清培养基 10%DMSO (二甲基亚砜) 取对数生长期细胞1ml于冻存管中,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1×106—5×106细胞/ml),密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 慢冻程序 标准程序(放哪里?) 当温度在-25 ℃以上时,1-2 ℃/min

当温度达-25 ℃以下时,5-10℃/min 当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中 简易程序 将冻存管于4℃放置1小时,于-20℃放置1小时,通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口(-70℃),放置1小时,后直接投入液氮中(-196℃) 细胞复苏方法 从液氮中取出冻存管,迅速投入37℃水浴中,使其融化(1分钟左右)注意防护(冻存管爆炸)! 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 低速离心10分钟 去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。 注意事项:

细胞的冻存和复苏

背景知识: 细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 细胞冻存 操作步骤: 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的冻存培养液,冰上预冷; 2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管; 3. 离心500rpm,5min; 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,由慢至快,滴入配制好的冻存培养液,用吸管轻柔吹打使细胞均匀(在冰上进行);一般一个小方瓶冻一支或者一个10cm培养皿冻2支。 5. 将细胞分装入冻存管中,每管1ml(若冻存多于1支,则每支要均匀分装); 6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者; 7. 冻存:放入装有异丙醇的程序降温盒中,-70℃冰箱中放3天左右,取出冻存管,移入液氮容器内。 注意事项: 1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液; 2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;

细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)

细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP) 背景知识: 细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。 原理: 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透*,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容(操作步骤): 一、材料 (一)仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃) 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 (二)玻璃器皿 1. 吸管(弯头、直头) 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶(250ml、100ml) 4. 废液缸 (三)塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管(10ml) 5. 15ml离心管 6. 冻存管(1~2ml) (四)其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 (五)试剂 1. D-Hanks液

2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗(青霉素、链霉素) 5. 胰蛋白酶(0.08%) 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油 四、操作步骤 (一)细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液; 2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、; 3. 离心1000rpm,5min; 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml; 5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml; 6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者; 7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/ min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。(二)细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀; 3. 离心,1000rpm,5min; 4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养; 5. 次日更换一次培养液,继续培养。 五、注意事项 1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液; 2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤; 3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论

? Polge等人(1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍 然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展就是Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及Smith(1961)等学者的继续与发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。Lovelock(1959)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结 冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,

细胞冻存和复苏实验

实验步骤一、材料准备 1. 仪器:净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2. 玻璃器皿:吸管(弯头、直头)、培养瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、废液缸。 3. 塑料器皿:吸头、枪头、胶塞、移液管(10ml)、15ml离心管、冻存管(1~2ml)。 4. 其他物品:微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5. 试剂:D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗(青霉素、链霉素)、胰蛋白酶(0.08%)、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油。 二、细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液。 2. 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。 3. 离心1 000 rpm,5 min。 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。 5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml。 6. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者。 7. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。 三、细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀。 3. 离心,1 000 rpm,5 min。

细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存

细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理:江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。 1.1实验前准备 (1)将水浴锅预热至37℃ (2)用75%酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 (3)在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 (1)根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 (2)迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。 (3)约1-2 min后冻存管内液体完全溶解,取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 (4)用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入生物安全柜内。吸弃上清液,向离心管内加入1 mL培养液,吹打制成细胞悬液。 (5)将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内,将培养瓶/培养皿放入37℃,5% CO2的培养箱内过夜后换液继续培养,换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 (1)水浴锅未预热或者未预热到37℃。 (2)水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。 (3)离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。 (4)一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 (1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶

子放入37℃水浴锅内预热。 (2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 (3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 (1)取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 (2)从培养箱内取出细胞:注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 (3)将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口,同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 (4)加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。 (5)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 (6)弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 (7)将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中,以1000 rpm/min离心5 min。 (8)弃去上清液,加入适当体积的培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 (9)将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 (10)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 (11)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养,传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 (1)严格的无菌操作 (2)适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,

细胞冻存和融化

细胞冻存和融化 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮 中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样 在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防 止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种 的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送 某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或 二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水 分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能 较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。 背景知识: 细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工 作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生 物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不 断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰 箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时 间是无限的。 原理: 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的 保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物 质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞 应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化, 避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容(操作步骤): 一、材料 (一)仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃) 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 (二)玻璃器皿

细胞的冻存与复苏

细胞的冻存与复苏 为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冷冻后,最终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 复苏一般采用快速融化方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解,然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 一、细胞的冻存 (一)仪器、用品与试剂 细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、-80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液(10ml体系:含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO)、细胞培养基(如添加有10%FBS的RPMI1640)等。 (二)方法 1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶,小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液,37℃消化细胞。 2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后,加入3-5ml细胞培养基终止消化。

3、1000rpm 离心5分钟,收集细胞沉淀。 4、加入适量细胞冻存液,调整细胞密度在1-10×106个/ml。 5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中,拧紧冻存管盖子,标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。 6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。 7、将冻存管放入冻存盒中,立即转移入-80℃超低温冰箱过夜。 8、将冻存管转移入液氮罐中,在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。 (三)注意事项 1、冻存细胞的生长状态要好,建议在冻存前24小时内对培养基进行换液,冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整,血清的浓度可以更高一些,甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏,用以鉴定冻存效果。 4、DMSO有毒,应戴手套操作;将冻存管放入液氮罐中时,应防止被溅出的液氮冻伤。 二、细胞的复苏 (一)仪器、用品与试剂 37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70%酒精浸过的棉球等。 (二)方法

细胞冻存与复苏-注意事项

方法: 冻存液最好现配:按1:3:6(或1:2:7)配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理,对于贴壁细胞: 1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次 2胰酶消化 3加培养基中止消化,有的细胞是加血清中止 4离心收集细胞,不同细胞离心率不一样(以上仅为贴壁细胞,悬浮细胞收集就用第四部)5吸出离心管上清液,加1ML 的冻存液重悬细胞,移到冻存管,放4度半小时,-20 度两小时,-70度过夜,再放液氮长期保存 悬浮细胞:直接离心收集,PBS洗涤 注意事项: 1.错误的时机: 细胞状态不好(长的太过了,培养液已经很黄;细胞可疑污染;细胞已经开始凋亡或崩解; 连续培养超过二个月,细胞性状已有改变改变)。

最佳时机:细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。 1.细胞太少: 冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。(复苏很难成功)。 解决: 离心后调整细胞浓度。(不要重新洗细胞)。 1.盖子不紧: 冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。 解决: 选择原配的管子和盖子(不同牌子/型号的颜色会有差别)。 1.单薄的冻存盒: 放在-80度的冻存盒,壁太薄,细胞在被迅速降温。 解决: 选择厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量干棉花。(冻存的原则:缓降!) 1.-80度太久: 放在-80度冰箱的时间超过半年。(冰箱的温度难以恒定:开门/关门,电压不稳等)解决:

尽快转入液氮。 1.液氮不足: 液面不能漫过所有细胞。 解决: 定期测量液氮储备,保证细胞全部浸在液面下。 1.取错细胞: 找不到/拿错冻存管。 解决: 每支冻存管都标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。 二、细胞复苏: 方法: 1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。 2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以 上培养液,混匀; 3.离心,1000rpm,5min; 4.弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶, 37℃培养箱静置培养; 5.次日更换一次培养液,继续培养。

细胞复苏与冻存

细胞冻存与复苏 原则:慢冻快融 在超低温的液氮中进行冻存(-196度)。在冻存过程中,随着温度的改变,细胞内部结构讲发生一系列的变化。细胞快速冻存时,将会受到很大的损伤,甚至导致细胞的死亡。温度急速下降时细胞脱水少,还会使细胞内结冰。细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性,以及细胞器的损伤,并最终导致细胞的死亡。因此,冰冻细胞时,应使温度缓慢下降,从而使细胞内水分渐渐脱出,使细胞内不结冰。由于冰冻细胞体中的冰晶体很小,融化时必须快,以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。因此,细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。一般冷冻时,在-30度之前药缓慢降温,速度控制在每分钟下降1度,—30度以下可快速冷冻,使温度降至—196度。 冰冻时还要加入5?10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。因为二者分子量小,容易穿透细胞降低细胞内的冰点,并提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冻存,可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶,从而避免细胞损伤。 在细胞复苏过程中,必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶,造成细胞死亡。 一、细胞复苏 如果冻存前细胞状态好,而且冻存时间长,复苏用的培养液没问题的话,复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没 有及时稀释接种

KEY: 1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。 2.细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 Protocal (以贴壁细胞系tsA201 为例) 1. ?准备材料:37C?40 C水浴,37 C预热培养液,离心管、血球计数盘与盖玻片 2. 细胞实验室进行常规消毒,紫外照射30 min 以上,超净台开启通风10 min。培养液孵温至于37 °C 3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭,移入无菌操作台内。将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中,备用。 4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出(操作人员 应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害),检查盖子是否旋紧(由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉)。立即放入40 C水浴中,轻摇冷冻管使其在快速全部融化(如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用),以70 % 酒精擦拭冻存管外部,移入无菌操作台内。 5. 将细胞悬液移入已加培养基的离心管中,稍微吹打混匀,低速离心(1000rpm ,4min )去除上清,加入适量培养液重悬,计数,调整细胞浓

常规细胞冻存和复苏方法

常规冻存方法 下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例,介绍常规冻存细胞的详细过程。 ?主要材料 (1)仪器设备:普通冰箱和-700C~-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机等; (2)冻存管:容量为1ml或1.5ml; (3)冷冻保护液:一般是以5份小牛血清、4份细胞培养基与1份DMSO 混合而成。现配现用,或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前,于室温下水浴溶解; (4)待冻存细胞:各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。 ?操作过程 1.待冻存细胞悬液的制备 (1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计 算细胞总数; (2)将细胞悬液以800~1000r/min离心5min,去上清夜; (3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×106~ 1×107个/ml; (4)按每管1~1.5ml的量分装于冻存管内,拧紧管盖; (5)在冻存管上做好标记,包括细胞代号及冻存日期。 2.分级冷冻

(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(4~80C),约30min; (2)接着将冻存管臵于普通冰箱冷冻室(-100C~-200C),约30~60min; (3)将冻存管转入低温冰箱(-800C),放臵过夜; (4)最后将冻存管投入液氮保存。 3.记录 做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位臵以及操作人员。 ?冻存结果 如此冻存的细胞,其存活率可达90%以上。 ?讨论 在使用DMSO前,不要对其进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有毒,故在配制时最好带手套。 在将细胞冻存管投入液氮时,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出,可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。 应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样的细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,要复苏1~2管,以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

动物细胞培养中细胞的冻存与细胞复苏

动物细胞培养中细胞的冻存与细胞复苏 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于一196~C液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO), 可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。 材料:冻存管,离心管,细胞培养用材料,500 mL烧杯,胶布,搪瓷杯,75%酒精棉。 药品:培养基(RPMI1640或DMEM),小牛血清,0.25%胰蛋白酶溶液,二甲基亚砜(DMSO)或甘油,0.5%台盼蓝染液,液氮。 仪器:4℃冰箱,-70℃冰箱,液氮容器,微量加样器,水浴锅,离心机。

(一)细胞冻存 1.取待冻存的细胞用胰酶消化(见相关实验细胞传代培养部分),用培养基将细胞冲洗下来。800 r/min离心5 min,弃上清收集细胞。如果是悬浮生长的细胞,则可直接离心收集细胞。 2.加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基,或者10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大,3×106个/mL左右,并可适量增加牛血清浓度至20%。 3.细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹,做好标记(写上细胞种类、时间及冻存条件等)。 4.冻存管在4℃下存放30 min,转放-20℃ 1.5~2 h,再转人-70℃ 4-12 h后即可转移到液氮内(-196℃),注意进行登记。 (二)细胞复苏 1.取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。 2.从液氮中取出冻存管立即投人40℃水中迅速解冻。 3.取出冻存管,用75%酒精清洁管口,打开。 4.离心去上清收集细胞,用无血清培养基洗1次,加人3 mL新鲜培养基,于小培养瓶中培养。

细胞冻存和复苏

细胞冻存和复苏 一、实验原理 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用二甲基亚砜(DMSO)作保护剂,这种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 二、细胞传代(分瓶) 1、生物安全柜(超净工作台)的使用次序:使用前开启紫外灯照射30min,然后工作台预工作15min以除去臭氧,再开始试验。 2、准备工作:⑴用75% 的酒精喷下戴手套的双手,同时用酒精棉球擦拭生物安全柜台。⑵倒置显微镜下,观察细胞的状态,是否已经长满培养瓶,需要进行分瓶(传代)。 3、将培养皿中培养液(含有10%的胎牛血清,含血清的培养液配置方法:5ml的血清+45ml的基础培养液DMEM等)用塑料吸管吸去,贴壁加入PBS洗涤一次,以去除残留的血清(血清会抑制胰酶对细胞的消化)。 4、根据培养瓶的大小(常见为10ml和6ml的培养皿),加入适量的胰酶(10ml的加1ml),置于37℃培养箱,消化1分钟,观

察到贴壁细胞消化下来了(或倒置显微镜观察贴壁细胞逐渐趋于圆形时),加入含血清的培养液终止胰酶消化。 5、用吸管吸取冲洗皿底,将细胞悬液移至15ml离心管中离心1 000 rpm,5 min,21℃。 6、酒精喷下离心管,进入安全柜,弃上清,重新加入含血清的培养液,然后根据需要分瓶,置37℃培养箱继续培养。 三、细胞复苏 1、从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化(本实验室直接放培养箱融化); 2、加入PBS10ml,洗去DMSO,离心1 000 rpm,5 min; 3、弃去上清液,加入含10%血清的培养液,接种培养瓶,培养箱培养; 4、次日换液(培养液由红色清亮透明变浅变黄需换液),继续培养。 四、细胞冻存 1、取待冻存的细胞(按上述把贴壁细胞消化下来),1000rpm离心5min,弃上清; 2、加入1-1.5ml冻存液(含10%的二甲基亚砜DMSO和90%血清的DMEM培养液),吹打混匀; 3、移入冻存管(标记好细胞名称、冻存时间、冻存者),放入冻

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 点击次数:3337 发布时间:2011-4-12 细胞的冻存 一、概述 目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤: (1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。 (2)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中,安瓿装1~1.5mL在火焰喷灯上封口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。 (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4℃冰箱中2~3小时,再移至冰箱冷冻室内3~4小时(此步可省略),再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一只安瓿细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。

细胞冻存与复苏应用方向、发展历史和冷冻技术

细胞冻存与复苏应用方向、发展历史和冷冻技术 概述 细胞培养技术自1907年开创以来,历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天,细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。 低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0~196℃进行保存,就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度,并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20~40℃冰箱保存、-60~80℃深低温冰箱和液氮(-196℃)超低温保存等。 应用方向 1. 医学方面 近年来干细胞的研究越来越被人们关注,由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,可分化为多种功能细胞。 根据发育阶段和取材来源,干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。 骨髓干细胞在骨髓中含量极少,约占骨髓有核细胞的十万分之一,所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。 而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。 2. 生物学方面

细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天,更是尤为关键,虽然不是治本的方法,但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。 发展历史 1. 1776年,Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 2. 十九世纪中后叶,许多早期的工作者(Prevost,1840;de Quatrefages,1853;Mant egazza,1866;Scheuk,1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响,得出了和Spal lanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。 3. 1900年前后,科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 4. 二十世纪50年代,Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用,他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。 5. 1972年,Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析,提出关于冷冻损伤的两因素假说目,即冰晶损伤和溶液损伤假说。 这个假说认为随着温度的下降,细胞内外的水分结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellul ar ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成,冷却速度越快,冰晶损伤越大。 同时随着温度的下降,细胞外部的水分会先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高,细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏,细胞发生渗漏,导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢,使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成,冷却速度越慢,此损伤越严重。 主要技术

细胞复苏、传代、冻存过程

一、细胞培养(复苏、换液、传代、冻存)(已正) 进行细胞培养前,将所用物品放入超净台中,打开紫外开关,照射20-30分钟。紫外结束后,打开鼓风,使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 1.细胞培养液的配制: 配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)(如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加) 2.细胞复苏: 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解,大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中,用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中,这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml,混匀,1000rpm, 3分钟。然后弃掉上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。(将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴,不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心3分钟。弃掉上清,然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内,再加入4ml配好的培养基,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。) 3.细胞换液: 复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液,去除未贴壁的死细胞(贴壁生长的细胞)。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次,每次3-5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基,喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀,用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml 无菌的离心管中,1000rpm,3分钟去上清,加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基,然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内,使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀,从超净台中将T25取出,拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀,如铺匀了喷上75%的乙醇,放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4.细胞传代: 当细胞生长到80%-90%时,其的生长状态和细胞形态都比较好时,即只要判断细胞处于生长对数期,这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下:将原培养基弃去,然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次,每次3-5ml,最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS,小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml %胰酶消化,放入孵箱,1-2分钟后取出,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时,喷上75%的乙醇,拿到超净台里,加入2ml培养基终止消化,用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打,尽量使

细胞冻存与复苏步骤、原理及注意事项(知识资料)

培养细胞的冷冻保存与复苏 Polge等人(1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,他们仍然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及Smith (1961)等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock(1959)等人发现了一种新的化学保护剂,这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降,细胞内外都结冰,产生

细胞复苏的步骤

细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作,可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。 一、细胞冷冻保存 1、材料: 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法: (1)传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤: (1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 (2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。 (3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 (4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: (1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 (2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。 (3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。 (4)冷冻保存之细胞浓度: ①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml ②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。 ③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1~3×106cells/ml ④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml。 (5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。 (6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞

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