gejinwen-200712-12
〔收稿日期〕2002-10-10〔基金项目〕湖南省自然科学基金资助项目(98JJ Y 2027)。〔作者简介〕陈 颂(1977-),男,湖南衡阳人,湖南中医学院2002届中西医结合硕士研究生,现在广州中医药大学热带病研究所工作。
脑泰方提取物抗肿瘤坏死因子诱导人脐
静脉内皮细胞损伤的研究
陈 颂,葛金文,邓冰湘
(湖南中医学院血管生物学实验室,湖南长沙410007)
〔摘要〕目的观察肿瘤坏死因子α(T NF 2
α)对培养的人脐静脉内皮细胞的损伤作用及中药脑泰方提取物(NTE )的保护作用。方法将融合生长人脐静脉内皮细胞(H UEC )随机分为空白对照组、T NF 2α组、NTE 对照组和NTE 高、中、低剂量组,观察100ng/ml 的T NF 2
α作用24h 后内皮细胞显微形态的改变及培养液中血管性假血友病因子(vWF )含量。结果T NF 2
α作用后细胞形态发生显著变化,相差显微镜及普通光镜下主要表现为较多细胞收缩成圆形固缩状,细胞间隙变宽,甚至发生脱落并出现异常颗粒;部分细胞纵轴拉长,横轴缩小,表现为成纤维细胞型外观,培养液中vWF 含量显著升高(P <0.01);NTE 高剂量组、中剂量组细胞拉长,细胞间隙略增宽,但细胞及核边界尚清楚,形态较规则,与T NF 组比较,圆形固缩状细胞数目减少,vWF 含量明显降低(P <0.05,P <0.01);单独添加中剂量NTE 24h 后细胞形态和生长状况及vWF 含量与空白对照组
无明显差异(P >0.05)。结论一定剂量的NTE 对T NF 2
α诱导的H UEC 损伤有较好的保护作用。〔关键词〕脑泰方提取物;肿瘤坏死因子;血管内皮细胞;血管性假血友病因子
〔中图分类号〕R 285.5 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1000-5633(2002)04-0007-03
Antagonistic E ffect of N aotaifang Extract on the I njury of H um an
Umbilical Cord E ndothelical Cells I nduced by R ecombined
H um an Tumor N ecrosis F actor Alpha
Chen Song ,G e Jinw en ,Deng Bingxiang
(Laboratory of Vascular Biology ,Hunan C ollege of TC M ,Changsha 410007Hunan )
〔Abstract 〕Objective T o observe the injury effect on human umbilical cord endothelial cells (H UECs )
induced by recombined human trm or necrosis factor alpha (rhT NF 2
α)and the antag onistic effect of Nao 2taifang Extract (NTE )on it.Methods The cultured H UECs were randomly divided into five groups ,i.e.con 2
trolling group ,rhT NF 2
αgroup (100ng/ml rhT NF 2α),3NTE groups with different dosages (100ng/ml of rhT 2NF 2
αand 6mg/ml ,2mg/ml or 0.67mg/ml of NTE ).M orphologic changes of H UECs and v on willebrand factor (vWF )contents in the conditioned 2media were detected after 24hours with rhT NF 2
αacting.R esults M ost H UECs were shown to underg o such pathological changes like pyknosis ,wide intercellular space and abnormal granule in cytoplasm.On the other hand ,a few were shown to be fibroblast 2shape H UECs ,and vWF
contents in the conditioned 2media being significantly increased in rhT NF 2
αgroup (P <0.01).High 2and mid 2dle 2dose NTE could make the longth lengthened markedly and the intercellular space widened a little to stim 2
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2002年12月第22卷第4期Dec.2002V ol.22N o.4
湖南中医学院学报
Journal of Hunan C ollege of TCM
转载
https://www.360docs.net/doc/0c8300630.html,
ulated H UECs(P<0.05,P<0.01)with clear boundary of cellular membrane and nulei in regular m orphol2 ogy,reduced number of round cells with pykn osis and significantly reduced content of vWF,com pared with that of T NF group.H owever,n o marked effect was seen on stimulated H UECs with medium d osage of NTE alone in cellular m orph ology,growing status and vWF content,com pared with that of blank controlling group.Conclu2 sions NTE at certain d osage sh ould be effective to antag onize the injury effect on H UECs induced by rhT NF2α.
〔K ey w ords〕Naotaifang extract;Tum or necrosis factor;Vascular endothelial cell;v on willebrand fac2 tor
脑泰方是治疗缺血性中风的有效方剂,临床用于治疗气虚血瘀型脑梗死取得了较好效果[1,2]。本研究旨在从保护血管内皮细胞免受炎症介质损伤的角度初步探讨其提取物作用机理。
1 材料与方法
1.1 主要药品与试剂
脑泰方提取物(NTE)脑泰方由川芎、地龙等药物组成,经水煎、醇提后制成浸膏粉(由湖南中医学院药学分院制剂教研室提取,每1g浸膏粉含生药4 g)。将其溶液经0.22μm微孔滤膜加压过滤除菌后,分装冻存备用。
RPMI1640培养基干粉;G ibcol产品;胎牛血清:天津T BD公司;胰蛋白酶:美国Amiesco产品,上海生物工程技术服务有限公司分装;重组人肿瘤坏死因子(rhT NF2α):PEPROTECH EC公司产品,晶美公司提供;兔抗人Ⅷ因子相关抗原血清:Sigma公司; DAB显色试剂盒:华美公司;S ABC(兔IgG)免疫细胞化学试剂盒:Boster公司;人酶标vW因子检测试剂盒:苏州大学医学院血栓室。新鲜胎儿脐带:由长沙市妇幼保健院产科提供。
1.2 人脐静脉内皮细胞培养
参照Jaffe等建立的方法[3],生长汇合的内皮细胞在显微镜下呈椭圆形、多角形、梭形,成“铺路石”样紧密镶嵌排列。并经ⅧF∶Ag免疫组化鉴定呈阳性反应(附图-1),表明所培养的细胞为内皮细胞。
1.3 实验方法
将24孔培养板中生长良好并已融合的人脐静脉内皮细胞随机分为6组:NTE高、中、低剂量组(终浓度100ng/ml的rhT NF2α及生药终浓度6mg/ml、2 mg/ml和0.67mg/ml的NTE混合)、NTE对照组(仅加生药终浓度2mg/ml的NTE)、T NF组(仅加终浓度100ng/ml的rhT NF2α)及空白对照组(仅加等量P BS),每组10孔。换液后,置37℃、5%C O2环境中孵育24h后进行观察和指标检测。
1.4 观察指标与检测方法
1.4.1 一般形态学观察 在普通倒置显微镜及倒置相差显微镜下观察内皮细胞的形态变化并摄相。
1.4.2 H UEC培养液vW因子含量测定 采用夹心酶联免疫吸附法测定,测试药盒由苏州大学医学院血栓室提供。
1.5 统计学方法
计量资料以“平均值±标准差”(x±s)表示,数据结果采用SPSS10.0统计软件包进行处理。多组样本均数间比较用F检验,两两之间比较用q检验。计数资料用χ2检验。
2 结果
2.1 H UEC一般形态学观察
经rhT NF2α作用后细胞形态发生显著变化。相差显微镜及普通光镜下主要表现为较多细胞收缩成圆形固缩状,细胞间隙变宽,甚至发生脱落并出现异常颗粒;部分细胞纵轴拉长、横轴缩小,表现为成纤维细胞型外观(附图-2、附图-3)。NTE高、中剂量组仅见细胞拉长、细胞间隙略增宽,但细胞及核边界尚清楚、形态较规则;圆形固缩状细胞数目明显较T NF组减少(附图-4、附图-5)。低剂量组细胞与T NF组比较,细胞形态变化无明显差异。单独添加中剂量NTE24h后细胞形态和生长状况与空白对照组无明显差异(附图-6)。
2.2 对培养液中vWF含量的影响
由表1可见,T NF组培养液中vWF含量明显升高(P<0.01),而NTE高、中剂量可抑制这种改变(P<0.01和P<0.05);低剂量的NTE组vWF含量有降低趋势,但无统计学意义(P>0.05)。单独用NTE对vWF水平改变不明显(P>0.05)。NTE各剂量与vWF含量存在较好的相关性(r=-0.853,P <0.05),表明NTE对H UEC分泌释放vWF的作用
8湖南中医学院学报2002年第22卷
1.内皮细胞免疫组化鉴定,细胞呈阳性反应,胞浆深棕褐色,核仅着淡褐色,界限清楚(250×);
2.T NF组,添加100 ng/ml rhT NF2α后,H UEC收缩变圆,脱落,细胞数目减少(100×);
3.T NF组,深加100ng/ml rhT NF2α后,H UEC形态收缩变圆,细胞内出现粗糙颗粒样变化(250×相差);
4.NTE高剂量组,H UEC受rhT NF2α刺激后,仅以外形拉长为主,可见部分细胞收缩变圆,其余正常(100×);
5.NTE中剂量组,rhT NF2α刺激后,H UEC脱落较少,细胞形态基本正常(100×);
6.NTE对照组,单独添加脑泰方提取物后,H UEC生长正常(100×)。
附图 HUEC形态显微镜观察图
具有剂量2效应关系。
表1 NTE对TNF2α诱导HUEC损伤培养液中
vWF含量的影响
组 别n vWF(%)
空白对照组10 6.34±2.66
NTE对照组107.60±1.10
T NF组1011.96±2.7833
NTE低剂量组1010.86±3.11
NTE中剂量组109.09±1.93#
NTE高剂量组108.61±3.00##
注:与空白对照组比较33P<0.01;与T NF组比较#P< 0.05,##P<0.01。
3 讨论
研究表明,T NF2α是一多向性的细胞因子,可诱导血管内皮细胞发生凋亡[4];并可提高粘附分子的表达;升高毛细血管通透性,促使VEC释放凝血第Ⅷ因子,从而启动凝血过程,造成局部组织血液供给中断和出血坏死,促进脑缺血及水肿的发生。因此,有研究认为T NF2α与VEC参与的“缺血2炎症2血栓”过程在脑缺血损伤的病理过程中有着重要的地位[5]。本研究结果显示,单独加入rhT NF2α后6h即可见细胞的正常外观发生改变,周边的部分细胞可见纵轴拉长,横轴缩小,与文献报道[6]相符;而24h 后观察发现,多数细胞收缩变圆,或呈皱缩外观,甚至发生脱落,胞内显得粗糙有异常颗粒,此改变应为T NF2α用量较大所致;因为本实验所使用的T NF2α剂量较大,活性为终浓度>2000U/ml,实验结果与金镇等的报告基本一致[7]。而NTE高剂量组、中剂量组光镜下也出现细胞形态改变,但未见明显细胞损伤和脱落,提示一定浓度的NTE对T NF引起的内皮细胞损伤具有保护作用。
vWF是血管内皮细胞分泌的活性物质之一,通常主要贮存在血管内皮细胞的Wiebel2Palade小体内,呈连续、恒定的基础分泌。内皮细胞受刺激或损伤时发生排粒作用,vWF释放增加,测定vWF含量可作为VEC受损的标志物[8]。vWF作为FⅧ载体,可使血浆中FⅧ保持稳定,促进血小板粘附。在本实验中,经T NF2α作用后的内皮细胞释放vWF增加,而NTE在高剂量和中剂量下,可显著降低培养液中vWF的含量水平,说明NTE对血管内皮细胞具有较好的保护作用。
为了消除药物直接加入细胞培养体(下转第23页)
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第4期陈 颂,等 脑泰方提取物抗肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究
得其抗凝活性无明显变化。说明其活性对酸碱有一定的耐受性。
表3 AT2Ⅲ对桑叶提取液和肝素抗凝活性的影响
(n=5,x±s) 组 别去纤溶酶原血浆去AT-Ⅲ血浆
T ris(缓冲液)17.7±0.416.6±0.6
桑叶(50mg生药/ml)34.7±0.631.5±1.63
肝素(0.2u/ml)43.5±2.718.2±1.5注:采用Dunnet检验,与对照组相比3P<0.01。
3 讨论
大量实验与临床资料表明,许多严重危害人类健康的疾病,如脑血栓、心肌梗死、弥漫性血管内凝血、肺栓塞、深部静脉血栓等的发生、发展与血栓形成密切相关。对于血栓形成的防治,必须从保护血管内皮、降低血小板功能、抑制血液凝固、促进纤溶活性、降低血液粘滞性、改善血流动力与流态条件等多个环节采取措施。在血栓形成的防治中,抗凝药物的应用是首要环节。因此,寻找具有抗凝作用的中药方剂或单味中药或有效成分,不仅对临床防治血栓形成具有实践意义,而且有益于活血化瘀治则的深入研究与进一步发展。
桑叶提取液与肝素相比较,其抗凝血酶活性并不强,但对反应外源性凝血途径的PT和反映内源性凝血途径的K PTT,二者的抗凝环节是有较大区别的。由于凝血因子Xa是影响PT和K PTT的共同因素[3],故桑叶提取液除拮抗凝血酶外,还可能具有抗因子Xa的作用。肝素也同样具有抗凝血酶和Xa的作用。但我国市售肝素系一系列分子量不同的多糖的混和物,不同分子量肝素灭活因子Xa和凝血能力是不同的。目前十分重视的低分子量肝素灭活因子Xa与灭活凝血酶活性之比远高于普通肝素,这种高抗因子Xa活性被认为是低分子量肝素抗血栓形成功能较强而造成出血倾向危险较小的机理之一。从抗凝作用的侧重环节来看,桑叶提取液的抗凝活性更接近于低分子量肝素。故也可能具有普通肝素不具有的优点,桑叶提取液的另一个与肝素不同之点是与AT2Ⅲ的关系,肝素的凝血酶活性几乎全部依赖于AT2Ⅲ的存在,这就限制了肝素的应用。在AT2Ⅲ功能异常或含量低下的情况下,肝素的抗凝作用就会减弱。但从本实验结果看,无论AT2Ⅲ是否存在于血浆,桑叶提取液均可抑制凝血酶水解转变为纤维蛋白的作用,表明其抗凝血酶活性具有不依赖于AT2Ⅲ的性质。本实验制备的桑叶提取液工艺比较简单,但成分较复杂,目前要确定其抗凝活性来源于何种成分,尚待进一步深入研究。
参考文献:
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的研究[J].中药药理与临床,1994,10(特刊):32.
(上接第9页)系所导致的非特异性反应,本实验设立了药物对照组。结果显示,药物对照组与空白对照组比较,细胞形态学改变和培养液中vWF含量变化均无明显差异,且NTE抗T NF2α所引起的vWF含量变化具有剂量2效应关系,表明中药NTE对rhT NF2α引起的H UEC损伤具有明显的对抗作用,保护血管内皮细胞免受炎症介质的损伤可能是脑泰方治疗缺血性中风的重要机制。
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第4期彭延古,等 桑叶提取液对凝血机制的影响