真核细胞rna的分离和鉴定

真核细胞rna的分离和鉴定
真核细胞rna的分离和鉴定

1、真核细胞RNA提取的基本步骤

1.准备

1) 仪器:匀浆器、低温离心机、离心管。

2) 试剂:Trizol或者RNAiso均可,氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变

性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3) 所有玻璃器皿160~180℃高温干烤6h以上。

4) 非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后,经高温(121℃,30min)处理灭活RNA酶,

所用试剂均用DEPC水配制,然后高压处理。

5) 实验用水要经DEPC处理,但含Tris的试剂不能用DEPC处理。

6) 实验操作过程中要戴一次性手套,以避免RNA酶污染。

2.主要步骤

(1)取培养细胞(细胞数≥106),弃上清,加1mLTrizol重悬,冰上静置5min。

(2)加0.2mL氯仿,充分震荡混匀,静置3min,4℃,12000g×15min离心。弃沉淀。(3)取上清,加入0.5mL异丙醇,颠倒混匀。-20℃静置2h,4℃,12000g×10min离心。(4)弃上清,取沉淀,加入1mL 75%乙醇溶液,漂洗沉淀,4℃,7500g×5min离心。(5)弃上清,沉淀真空干燥10min。

(6)加40μL DEPC溶液,充分溶解RNA。

3.结果鉴定

(1)紫外分光光度计检测:

取RNA溶解液,按一定比例稀释后,紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值,计算OD260/OD280比值,如果比值在1.7~2.0:1之间,说明RNA纯度可。

标准样品当OD260=1时,RNA浓度约为40μg/ml,根据下述公式计算RNA浓度:R NA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×40。

(2)电泳检测:

1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量,电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜;

制1%甲醛变性凝胶板:4.5μL RNA,2uL 5×甲醛胶电泳缓冲液,3.5μL 37%甲醛,1 0μL甲酰胺,离心混匀,65℃变性15min后,迅速置冰浴中;再加入2μL RNA上样缓冲液,离心混匀后上样,6V/cm电压,电泳1~2h;

暗室内紫外光下观察,拍照;如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带,无大量小分子RNA,说明RNA无明显降解,样品-70℃保存备用。

4.注意事项

真核细胞RNA的提取过程有四个关键点,即

①样品(细胞或组织)的有效破碎;

②有效地使核蛋白复合体变性;

③对内源RNA酶的有效抑制;

④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离

其中最关键的是抑制RNA酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定

实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核, RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后,柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性,维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗(0.25M)蔗糖溶液中(内含微量钙离子,防止核聚集和脆性),可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品,如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力,可得到纯化的细胞核沉淀。

3.脱氧核糖核酸的鉴定: 【操作步骤】 1、0.5g肝组织+5ml的1.5%柠檬酸溶液,研磨 2、肝匀浆,倾入离心管,离心:3000r/min;15′ 3、离心结束后,上清液移入另外一个试管中备用(此为细胞质液) 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液,玻棒搅匀后, 为核悬液。 5、另外取离心管一只,加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心:2000r/min;10′.上层液,弃去;沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀,离心:2000r/min,10 ′白色沉淀为纯

化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核,即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 (1)水解:取离心管二支,编号,按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定:取试管三支,编号,按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质(ml) 2.0 - 核液(ml)- 2.0 1M过氯酸(ml) 2.0 2.0

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属(Shigellae)细菌又称痢疾杆菌,引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿,死亡110万,发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高,如阿根廷990.6/10万、印度972.3/10万;发达国家相对较低,如美国6~12/10万、德国2.7/10万、法国0.3/10万;我国上世纪50~80年代发病率在46.37~1018.93/10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位,但在卫生状况不良的地区,发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感,各年龄组均可受到感染,5岁以下儿童发病率最高。 据估计,在临床就诊的腹泻病人中的5%~15%是志贺菌引起的,而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见,发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%,但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现,除印度次大陆地区较为常见外,其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性,发病高峰为夏秋季,通常在7~9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容: 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据; 缺乏快速、简便的病原学诊断方法,细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍; 志贺菌耐药性谱的不断扩大,细菌性痢疾抗菌治疗难度加大; 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化; 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体(O)抗原,某些新分离菌株有表面(K)抗原。 (一) 菌体(O)抗原 1.型特异性抗原:多糖,光滑型菌株主要抗原;分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原:光滑型菌株次要抗原,主要存在于B群,籍此将菌型分

细胞生物学设计性实验:细胞核的分离鉴定

细胞生物学设计性实验:细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目: 细胞核的分离与鉴定 实验原理:1、细胞内各种结构的比重和大小不同,在同一离心场内其沉降速度也不同。所以,用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成,理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆,在特定的条下进行离心分离,然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下,将组织放入匀浆器,加入等渗匀浆介质进行研磨,破碎细胞,使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤:1、处死:断头处死小白鼠,手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材:迅速开腹取肝,在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤,称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆:加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中,尽量剪碎肝组织,将剪碎的刚组织倒入玻璃匀

浆器,是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿(如冰盘)。左手握持匀浆器,右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆,直至看不到明显的组织块。 4、过滤: 用8层纱布(先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布)过滤匀浆液于离心管中。 5、离心:在天平上平衡每对离心管,2500r/min离心 15min,取上清液于另一离心管中。 6、涂片:取上清液制一张涂片(涂片1)。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液,另制一张涂片(涂片2),自然干燥。 7、染色:分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ,染色5到7分钟(即滴染)。 8、洗涤:冲去染液,晾干。 9、镜检:结合实验结果的描述,镜下观察分析。 注意事项:1.操作规范,防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡,转速从低到高。 预期结果:低倍镜下找到标本,再换高倍镜,可见肝细胞核已游离出来,被染成蓝紫色,圆形,中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品:材料:小白鼠肝脏。

细胞核的分离

实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出,用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大,在高密度介质中,在高速离心条件下沉降下来,从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆,然后高速离心40 000g 1小时,细胞核沉淀到底部,线粒体和完整细胞,包括红血球漂浮在液面,通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进,例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压;选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性,防止聚集,维持恒定的ph,就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单,能得到较高纯度的细胞核,也已被广泛采用,但实验需要高速离心机,这在一般实验室不能进行,此方法要用高浓度的蔗糖,如果要分离大量的细胞核,也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核,在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值,这样可以减少细胞核的破碎率,并能分离得到较高分子质量的核酸,可能是由于核糖核酸(一种酸溶性蛋白)被柠檬酸除去,以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时,可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下,可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸,一般常在ph值为4,甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶,则需要较温和的条件,此时可以在ph值为6~6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。

植物体内的亚细胞组分分离

植物体内的亚细胞组分分离 步骤:准确称取植株鲜样0.5000 g,加入20 mL提取液(0.25 mmol/L蔗糖+50 m mol/L Tris HCl缓冲液(pH 7.5)),研磨匀浆,用尼龙纱布过滤,滤渣为细胞壁部分;滤液在600 r/min下离心10min,沉淀为细胞核部分;上清液在2000 r/min下离心15 min,沉淀为叶绿体部分;上清液在10000 r/min下离心20 min,沉淀为线粒体部分;上清液为含核糖体的可溶部分,每组两次离心,全部操作在4下进行。 植物亚细胞组分的分离 步骤:准确称取鲜样0.5000 g,加入20 mL提取液[0.25mol·L-1蔗糖+50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+1mmol·L-1二硫赤鲜糖醇,研磨匀浆,匀浆液在冷冻离心机300×g下离心30 s,沉淀为细胞壁组分;上清液在2000×g下离心15 min,沉淀为细胞核和叶绿体组分;上清液在10000×g下离心20 min,沉淀为线粒体组分;上清液为含核糖体的可溶组分。全部操作在4℃下进行。 Fractionation of Leaves and Roots.Leaves and roots were homogenized using a mortar and pestle in a medium containing 0.25 M sucrose,50 mM Tris-HCl(pH 7.5),and 1 mm

dithioerythritol.All steps were performed at 4 C.The resulting brei was strained through eight layers of cheesecloth,and liquid was expressed from the residue.The residue was washed twice with the grinding medium.The pooled washes,together with the first filtrate,were centrifuged at 300g for 30 s.The resulting pellet combined with the residue of the cheesecloth filtration contained mainly cell walls and cell wall debris and was designated as cell wall fraction(I).The supernatant of the first centrifugation step was then centrifuged at 20,000g for 45 min to sediment cell organelles.The pellet was taken as organelle fraction(II).The resultant supernatant solution referred to as soluble fraction(III)was employed in subsequent characterization studies as described.Fractions I and II were analyzed for their Cd content.The supernatant,fraction III,was further fractionated by gel filtration ,using Sephadex G-100,G-25,and G-10(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Sweden).An aliquot of fraction III was applied to a column(100 x 2.6 cm)of G-100 using 50 mm Tris-HCl(pH 7.5) and 0.1 mM dithioerythritol as eluting buffer.Fractions containing Cd were pooled and chromatographed on calibrated G-25(roots) or G-10(leaves)columns(70 x 2.3

细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)

实验项目:细胞核的分离与鉴定 实验原理: 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同,因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定,因为细胞核中主要含DNA,而DNA是碱性蛋白,可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材:显微镜,普通离心机,离心管,滴管,玻璃漏斗,纱布,烧杯,解剖剪,镊子,玻璃匀浆器,载玻片/盖玻片,染色盘架,小白鼠肝脏。 实验试剂:甲苯胺蓝染液,蒸馏水,0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液,生理盐水 实验步骤: (1)、用颈椎脱臼法处死小白鼠,迅速解开其腹腔取出肝脏,去出结缔组织,剪成小块,尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污,用滤纸吸去表面的液体。 (2)、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中,用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液,先加少量溶液于烧杯中,尽量剪碎肝组织后全部加入。 (3)、将剪碎的肝组织导入匀浆管中,使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血

中,左手持,右手将匀浆捣杆垂直插入管中,上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中,然后制备一张涂片①,自然干燥。 (4)、将装有滤液的离心管配平后,放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 (5)、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物,以2500r/min离心15min 弃去上清液,将残留液体用气管吹成悬液,滴一滴于干净的载盖玻片上,制成涂片②,自然干燥。 (6)在①·②上滴加甲苯胺蓝染液,染色5-7min,洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项: (1)尽可能充分剪碎肝组织,缩短匀浆时间,整个分离过程不宜过长,以保持组分生理活性。 (2)将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入,同时及时离心,以防止浆液中的颗粒自然下沉过快,影响后面的离心分层效果。 (3)涂片制作过程中把握好涂片的力度,不可太厚。 (4)染色后的洗涤要注意时间,不可过长,避免将染色洗去,观察不到细胞核。 (5)开腹取出肝后,用生理盐水反复冲洗,避免血细胞对食盐的影响。 预期结果: 在低、高倍镜下,可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白,即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来,被染成蓝紫色、圆形、中央有

实验设计-细胞核的提取与鉴定

医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名:李飘班级:K—10班学号:1020151004 评分 【实验项目】:动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】:核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核,因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体,核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出,然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA,是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后,用碱性固绿溶液染色,可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】: 1.细胞培养:将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上,使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养,使细胞固定在脱核塑料圆板上,脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径,使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2.秋水仙碱处理:细胞培养一段时间以后,加入0.1ug/ml的秋水仙碱,处理细胞48~60h 滤纸,使细胞形成多个大小不同的核体。 3.细胞松弛素处理:在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内,固定圆板位置后,再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4.离心:在1000~15000r/min核体从细胞排出。 5.收集核体:由于核体的贴附力弱,可以从离心管底部的沉淀中收集。 6.固定:将收集的核体涂于玻片上制成涂片,滴加15%乙醇于涂片上,固定5min,室温晾干。 7.三氯醋酸处理:将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min,细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8.染色:将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10~15min,细流水冲去多余染液,晾干,镜检。 【注意事项】: 1.在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃,因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2.涂片在用三氯醋酸处理时,时间不宜过长或过短,过长会使核膜裂解,过短使抽提的核酸不够。 3.在染色时,时间一定要足够,否则染色不完全,得不到理想的实验结果。 4.因去掉胞质的核体贴附能力弱,因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】:经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色,说明这是碱性 蛋白,即细胞核。

病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定 (一)病毒的分离病毒分离的一般程序是:检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚;无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10~20%悬液离… (一)病毒的分离 病毒分离的一般程序是: 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚;无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10~20%悬液离心后,取上清接种;咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理,杀死杂菌。 1.细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养(Cell culture)。所用培养液是含血清(通常为胎牛血清)、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液,pH7.2~7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长,是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚(或动物)组织分散成单细胞,加一定培养液,37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞,如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞,可用于产生病毒疫苗,如兔肾细胞生产风疹疫苗,鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗,猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养,故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化,在多数细胞退化时,少数细胞能继续传下来,且保持染色体数为二倍体,称为二倍体细胞。二倍体细

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐,初学者不易掌握,寻找一种简便方法。方法:玻璃片上将细菌与碱液混合,用接种环或接种针往上挑,观察有无丝状物出现,我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果:用本法鉴别细菌革兰氏染色性质,G^-菌有丝状物出现,即拉丝实验阳性,G^+菌无丝状物,拉丝实验阴性经过对照使用,本法具有快速,准确,简便,结果易判断,成本低廉等优点,值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同,革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色,为革兰氏阳性细菌,有的细菌染上复染的的红色,为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌,染色后为红色,细菌形态为短小的杆状,单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌,染色后为紫色,细菌形态为杆状,比大肠杆菌大,可排成链状的,有的菌体里有椭圆芽孢(无色)或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群,但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种,其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌,是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官,可引起急性炎症或继发感染;有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时,可判断它们已被粪便污染。因此,大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 (一)形态与培养特性 【材料与方法】 1.大肠杆菌革兰染色标本片。 2.大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1.大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌,两端钝圆或稍弯曲,呈分散排列。 2.菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形,中等大小,灰白,整齐,光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色,有金属光泽 (二)生化反应 【材料与方法】 1.取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管,37℃培养24h,观察结果。 2.取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基,37℃培养24h,观察结果。 3.靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验),见实验四。 【结果】

实验二 细胞核与线粒体的分离与观察

实验二细胞核与线粒体的分离与观察 一、实验目的 1.了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2.掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。 二、实验原理 细胞核(nucleus)是细胞中重要的细胞器,细胞的控制中心,在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用,是遗传物质的主要存在部位。线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器,是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化,并通过偶联磷酸化生成ATP,供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的,因而分离细胞核和线粒体是必须的。 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中,球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内,组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间,就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部,从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核,其次是线粒体,其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质,它属于等渗溶液,比较接近细胞质的分散相,在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性,在pH7.2的条件下,亚细胞组分不容易重新聚集,有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃,避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B(Janus green B)活染法,对线粒体专一的活细胞染料,毒性很小,线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色,而胞质中染料被还原成无色。 从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外,在植物细胞遗传工程中,常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子,Ca2+除去后细胞间粘着解体,促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面,并作为

利用离心技术分离细胞核和叶绿体

密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体 高倍镜下的叶绿体 实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体 一、实验目的: 1. 了解常用的离心法; 2. 理解差速离?心法和速率区带离心法分离样品组分的原理; 3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。 二、实验原理: ? 离心技术:是利用物体高速旋转时产生强大的离心力,使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮,从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。?离心技术类型: 1.差速离心法 2.密度梯度离心法 ?等密度梯度离心: ①对象:常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。(此法一般应用于分离大小相 近,而密度差异较大的颗粒物质时) ②原理:当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,在密度梯度介质中, 颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置,在这里颗粒没有重量,不管离心多长时间,它们再也不移 动了,形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。 ?速度梯度离心: ①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近,大小不同的物质) ②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 ②要求:1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度; 2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度; 3、离心时间十分重要 三、实验结果分析: 实验结果:

实验结果: 如图所示,叶绿体在混合液的梯度层中,形成一条带,聚集在密度梯度交界处;沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。 如图所示,叶绿体镜检为绿色橄榄形,在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。 实验分析: 此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。要想制得清晰,平整的界面,需要将离心管放置于稳定的水平界面上;最重要的是,向下层溶液中加入上层溶液时,需要极小心、熟练地控制滴加的力度,并使枪头贴着离心管管壁,让液滴缓慢的流入,防止梯度层被破坏;除此之外,将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动,而且离心时一定要两两平衡,之前要称量两个离心管使其相等。 四、思考问答: 本实验使用了哪两种离心方法,它们在分离样品时有何不同? 答:使用了等密度梯度离心和速率区带离心。速率区带离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始离心速度较低,使较大的颗粒沉降到管底,小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀,再改用较高的离心速度离心悬浮液,使较小的颗粒沉降,多次重复此步骤,从而达到分离不同大小颗粒的目的;等密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此种分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。

原代细胞培养:原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题

Case:新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋 白与基因 实验设计 一、细胞:分离大鼠原代心房肌细胞 二、细胞培养分组: a)对照组:正常大鼠原代心房肌细胞72h培养 b)高糖72h培养 c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养 d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h f)正常培养48h+(氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子)共同培养24h 三、蛋白检测:WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。 四、荧光定量检测:荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。 实验报告 一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养: 1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小; 2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置; 3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化; 4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃,5%CO2 培养箱中培养; 5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养; 二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定: 1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min; 2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min; 3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min; 4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗(Abbioscience公司),然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜; 5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗(嘉美生物公司), 37℃条件下放置1h; 6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

细胞核与线粒体的分级分离

细胞核与线粒体的分级分离 一、原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不 同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆,在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离,其过程包括 组织细胞匀浆、分级分离和分析三步,这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的 主要手段。 匀浆(Homogenization)低温条件下,将组织放在匀浆器中,加入等渗匀浆介质(即 0.25mol/L 蔗糖一 0.003mol/L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀,再用较高的转速,将 浮在上清液中的颗粒沉淀下来,从而使各种细胞结构,如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大 小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中,所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯 的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析 分级分离得到的组分,可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后,迅速剖开腹部取出肝脏,剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9%NaCl的烧杯中,反复洗涤,尽量除去血污,用滤纸吸去表面的液体。 2. 将湿重约1g的肝组织放在小平皿中,用量筒量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙 溶液,先加少量该溶液于平皿中,尽量剪碎肝组织后,再全部加入。 3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中,使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中,左手持之,右手将匀浆捣杆垂 直插入管中, 上下转动研磨3~5次, 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中, 然后制备一张涂片①, 做好标记, 自然干燥。 4.将装有滤液的离心管配平后,放入普通离心机,以2500rpm,离心15分钟;(1)缓缓取上清液,移入 高速离心管中, 保存于有冰块的烧杯中, 待分离线粒体用; (2)同时涂一张上清液片②做好标记, 自然干燥; (3)余下的沉淀物进行下一步骤。 5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物,以2500rpm离心15分钟弃上清,将残 留液体用吸管吹打成悬液,滴一滴于干净的载玻片上,涂片③,自然干燥。 6.将①、②、③涂片用l%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果 分别于高倍镜下观察三张涂片,描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1.将装有上清液的高速离心管,从装有冰块的烧杯中取出,配平后,以 17000rpm 离心 20 分钟,弃上 清,留取沉淀物。 2.加入0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙液lml,用吸管吹打成悬液,以17000rpm离心20分 钟,将上清吸入另一试管中,留取沉淀物,加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液混匀成 悬液(可用牙签)。 3.取上清液和沉淀物悬液,分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片),各滴一滴0.02%詹纳斯 绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果 油镜下观察,颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

淋巴细胞的分离及鉴定

离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降,借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法,在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM,在一定条件下与淋巴细胞混合,标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合,通过DAB显色,在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死,解剖左侧腹腔靠上部位,将腹膜剪开,找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上,加入8ml的生理盐水,用磨棒磨碎脾脏后过滤,即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液,弃部分上清,调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液(比重1.088)的试管一支,用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm,(上升和下降率为2)20℃30min。 6.离心后取出试管,观察细胞分层,底层为红色的红细胞,依次向上为细胞分离液和生理 盐水,在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管,并加2ml PBS洗涤一次,1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中,取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上,自然干燥后, 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片,自然干片 2.在室温条件下,用甲醇固定细胞,自然干燥后用蜡笔标出细胞范围,蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟,PBS洗3次。 4.滴加适当稀释(1:100)的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片,滴加适量 的封闭液于右侧涂片(做阴性对照),于37℃30分钟,PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液,37 ℃显色30分钟,蒸馏水洗3次,干片后,显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入,使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面,小心放取试管,保持界面完整,避免打乱界面,影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体,以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用,请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图:

细胞核质蛋白分离

介绍 核蛋白抽提试剂可以从哺乳动物培养的细胞或组织中逐步分离和制备细胞质和细胞核提取物。不变性的活性蛋白在不到两小时内纯化。在细胞颗粒中加入前两种试剂会导致细胞膜破裂和细胞质内容的释放。用离心法从细胞质提取液中提取完整细胞核后,用第三试剂从细胞核中提取蛋白质。用这种产品提取的核和细胞质组分提取物一般污染率不到10%,这对于大多数涉及核提取物的实验来说是足够的纯度 核抽提物比起全细胞裂解物通常更适合于进行基因调控研究。全细胞裂解液中的细胞成分对核蛋白的相互作用和稳定性有不利影响,核蛋白更集中于核提取物,而非全细胞裂解物。核提取物/试剂与多种下游应用兼容(包括Western blotting,BCA蛋白定量分析(产品编号23225),凝胶移位(产品编号20148),报告基因和酶活性的测定) 重要产品信息 ●此试剂盒适用于新鲜(未冷冻)的细胞或组织样品。使用蛋白酶抑制剂维持提取物的完 整性和功能。使用前,将蛋白酶抑制剂加入CRE I和NER浓缩物中以减少试剂稀释(浓缩蛋白酶抑制剂eg.100x)。不需要添加蛋白酶抑制剂到CER II。 ●如果在随后应用中需要大量的核提取物或出现问题,透析前用核提取物清除多余的盐。 试剂盒中的洗涤剂是不可透析的,但它主要是在细胞质中。使用Thermo Scientific?Slide-A-Lyzer?小型透析装置进行透析。另外,无回收蛋白或条块分割的不利影响下,NER 用于提取液的体积可以减小2倍可以得到更集中的核提取物。 ●在4°C条件下执行所有离心步骤,保持细胞样本和提取物在冰上。 额外所需材料 ●蛋白酶抑制剂 ●磷酸盐缓冲盐水(PBS) 细胞培养制备 ●贴壁细胞,用胰蛋白酶-EDTA消化,然后在500g离心5分钟。对于悬浮细胞,通过离 心在500G 5分钟收获。 ●用PBS重悬细胞颗粒冲洗细胞 ●1-10×106细胞转移至1.5ml离心管,并在500G 离心2-3分钟 ●使用吸管小心地去除和丢弃上清液,使细胞颗粒尽可能干燥。 ●在细胞中加入冷的CRE I(表1)。使用表1所示的试剂体积进行细胞质和核蛋白提取 不同细胞体积对应的试剂体积 红细胞压积(μL) CER I (μL) CER II (μL) NER (μL) 10 100 5.5 50 20 200 11 100 50 500 27.5 250 100 1000 55 500 *Hela细胞2×106细胞相当于20μL红细胞体积.

基因组DNA的提取与分离鉴定课后研讨题(手写)

基因组DNA的提取与分离鉴定 课后研讨题 1、动植物DNA提取的方法主要有哪些?并说明各方法的原理。 答: (1).浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. (2).阴离子去污剂法: 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以 常用阴离子去污剂提取DNA. (3).苯酚抽提法: 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 . ( 4).水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS. 2、苯酚、氯仿和异戊醇在基因组DNA的提取中各有什么作用? 答:苯酚:使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。

树突状细胞的分离纯化与鉴定

树突状细胞的分离纯化与鉴定 自从Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell ,DC) 以来, 人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入, 认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC。DC的纯化方法包括两大类: (1) 物理方法: ①根据细胞的黏附性进行分离, 有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法, 各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞> DC = 抗体产生细胞> B细胞> T细胞; ②根据细胞的大小比重进行分离, 包括聚蔗糖2泛影葡胺( Ficoll2 Paque) 密度梯度离心、Percoll非连续性/ 连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离; (2) 免疫分选: 包括淘洗法( Pan2 ning) 、流式细胞术(fluid cytometry ,FCM) 、磁性细胞分离术 (MACS) 。以下就不同组织DC的分离作一综述。 1 从外周血直接分离DC 首先分离外周血单个核细胞( PBMC) 。常用方法有: (1) Ficoll不连续密度梯度离心, 将人外周抗凝血稀释置于 Ficoll2Paque淋巴细胞分离液上离心, 速度(170 g~1 000 g)和时间(20~45 min) 因各个实验室而异, 分离液与血浆之间的界面层细胞即是PBMC; (2) Percoll连续/ 不连续密度梯度离心: 方法基本与密度梯度离心相同, 可在Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化DC。玫瑰花沉淀法大体上可将PBMC 分为ER+ 和ER 2细胞,其中ER+ 主要是T细胞。Nijman采用磁珠阴性选择法, 即用与抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56单抗相连的磁珠分别去除ER2细胞中的单核细胞、B 细胞、NK细胞和粒细胞, 所得的“新鲜DC”(f2DC) 纯度经流式细胞术(FACS) 检测达到85 %~90 %。如果将ER2细胞培养36 h再加2次各40 min贴壁培养去除黏附细胞, 将未黏附细胞置于1415 %甲泛葡胺上离心去除B细胞、NK细胞, 可得到90 %~95 %纯度的“培养DC” (c2DC) 。f2DC和c2DC分别具有未成熟 DC和成熟DC的典型特征。 Young的一种方法是用Percoll分离液先分离PBMC中的单核细胞, 或玫瑰花法得到的经短暂培养去除黏附细胞的ER2细胞; 另一种方法是先用玫瑰花节法分离出ER2细胞, 培养36 h去除单核细胞和黏附细胞, 两种方法最后将所得细胞经Percoll密度梯度离心, 高密度部分富含B细胞, 低密度部分DC纯度为40 %~80 %Thomas则用L亮胺酰2L亮胺酸2甲基酯(LLME) 处理ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞, 再经14-15 %

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