芭蕉属植物内细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究

中国农业科学 2010,43(10):2045-2055

Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.10.010 芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究

蓝江林,刘 波,陈 璐,肖荣凤,史 怀,苏明星

(福建省农业科学院农业生物资源研究所,福州 350003)

摘要:【目的】分离、鉴定芭蕉属植物内生细菌,了解内生细菌的种群结构及其脂肪酸生物标记特性。【方法】采用平板分离纯化芭蕉、威廉斯蕉和野生蕉植株内生细菌,利用细菌脂肪酸鉴定技术进行鉴定。【结果】共获得内生细菌11属14种,野生蕉植株分离得到9种,威廉斯蕉植株7种,芭蕉植株3种。共检测到35个磷脂脂肪酸生物标记,这些生物标记分为4种类型,即(1)高频次分布:在14株细菌中出现10—14次,属于细菌总体类群(general)的生物标记。(2)中频次分布:在14株细菌中出现4—6次,可以用于代表细菌属类群(genus)识别生物标记。(3)低频次分布:在14株细菌中出现2—3次,可以用于指示特定细菌种间差异的生物标记。(4)微频次分布:仅在一种细菌种类出现,是细菌种(species)特征生物标记。利用磷脂脂肪酸生物标记分析内生细菌群落结构,可将14种细菌分为3类;运用多样性、丰富度、均匀度及优势度指数等生态学概念,分析了磷脂脂肪酸生物标记总量与各生态学参数之间的关系,结果表明,磷脂脂肪酸生物标记16:0、18:1 W7C、14:0、12:0、18:0、17:0 CYCLO的丰富度皆相对较高;磷脂脂肪酸生物标记的Response值总和较高,均匀度(J)较低,其Simpson 优势度指数(D)、Shannon-Wiener(H1)、Brillouin(H2)、Mcintosh(H3)多样性指数也相对较高。【结论】芭蕉属植物内生细菌及其磷脂脂肪酸生物标记存在多样性。

关键词:芭蕉属植物;内生细菌;磷脂脂肪酸生物标记

Characteristics of PLFA Biomarkers for the Endophytic

Bacteria Inside Musa Plants

LAN Jiang-lin, LIU Bo, CHEN Lu, XIAO Rong-feng, SHI Huai, SU Ming-xing

(Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003)

Abstract: 【Objective】The present paper dealt with isolation and identification of the endophytic bacteria from Musa plants as well as the characteristics of their PLFA biomarkers. 【Method】 Healthy Musa plants were collected from Zhangzhou areas in Fujian province, China. The endophytic bacteria inside the plants were isolated by streak plate method and identified by using fatty-acid identification technology. 【Result】The results showed that 14 species of endophytic bacteria were identified by means of microbe identification system.9 microbial species belonged to Musa itinerans, 7 species belonged to Musa AAA cavendish var.Williams and 3 species belonged to Musa basjoo. There were 35 PLFA biomarkers detected in 14 species of endophytic bacteria, in which based on the distribution frequency in 4 types of bacteria were clustered, e.g. (1) high frequency related to characteristics of microbe in general and the PFLA were detected in 10-14 times in 14 strains of bacteria, (2) middle frequency related to bacteria in general and the PFLA were detected in 4-6 times in 14 strains of bacteria, (3) low frequency related bacterial genus and the PFLA were detected in 2-3 times in 14 strains of bacteria, (4) tiny frequency related to species and the PFLA only in a bacteria. According to the PLFA biomarkers and the cluster analysis method, the 14 species were classified into 3 groups based on the PLFA biomarkers. The diversity and richness, uniformity and dominance of the concept index ecology were used to analyze the relationship between the fatty acid biomarker gross and ecological parameters. The results showed that the richness of 16:0,18:1 W7C, 14:0, 12:0, 18:0, and 17:0 CYCLO of PLFA biomarkers was relatively high. The higher fatty acids biological response value, the lower the sum uniformity (J), the dominance of the Simpson index (D), Shannon-Wiener (H1), Brillouin (H2), Mcintosh (H3) diversity index were relatively high. 【Conclusion】There are significant

收稿日期:2009-11-12;接受日期:2010-01-25

基金项目:国家“863”计划(2006AA10A212)、福建省发展和改革委员会专项(闽发改投资[2006]781号)、福建省科技创新平台建设-福建省农业生物药物研究与应用平台(2007N2010)

作者简介:蓝江林,副研究员,博士。Tel:0591-********;E-mail:lanfz2008@https://www.360docs.net/doc/0610013490.html,。通信作者刘波,研究员,博士。Tel:0591-********;

E-mail:liubofz@https://www.360docs.net/doc/0610013490.html,

2046 中国农业科学43卷

polymorphism among community structure of endophytic bacteria and their PLFA biomarkers in Musa plants.

Key words: Musa plants; endophytic bacteria; PLFA biomarkers

0 引言

【研究意义】植物内生细菌(endophytic bacteria)是指能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害并与植物建立了和谐联合(compatible association)关系的微生物[1]。这是一个生态学概念,在宿主的影响下,内生细菌的不同亚群会在不同的环境中形成,当宿主植物在环境恶化的情况下,它会选择那些增强其抵抗恶劣环境的内生细菌亚群的侵染[2-3]。因而,宿主植物与内生细菌经过长期的互相选择,宿主的种类和内生细菌类群之间可能形成一种相对比较稳定的对应关系,这种对应关系可以通过一些生物标记来反映。了解植物内生细菌的种类、群落结构及其脂肪酸生物标记特性,对于研究内生细菌与宿主间以及与宿主生长环境间特定的动态依存关系、更加有效地利用内生细菌资源等具有重要意义。【前人研究进展】细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性,各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱[4]。磷脂脂肪酸(phospholipids fatty acid,PLFA)谱图分析方法的原理是基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分,不同类群的微生物可通过不同的生化途径合成不同的PLFA,细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定,它具有结构多样性和微生物特异性[5],因此,PLFA可以作为微生物多样性指示性的生物标记,阐明样品中微生物群落结构的变化。利用脂肪酸鉴定细菌已经有很多研究,目前这项技术已经广泛用于细菌属、种和亚种的鉴定和多样性研究[6-10]。【本研究切入点】本文基于细菌细胞中的磷脂脂肪酸含量的恒定性、结构的多样性和特异性,研究分离、纯化鉴定芭蕉属植物内生细菌,了解内生细菌群落及其磷脂脂肪酸生物标记特性。【拟解决的关键问题】引入生态学研究概念,利用生物多样性指标为评价参数,根据微生物磷脂脂肪酸的特异性,以磷脂脂肪酸的数量和结构作为生态学研究对象,揭示芭蕉属植物内生细菌群落结构,阐明内生细菌脂肪酸生物标记特性,研究探讨利用磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记反映植物体内生细菌种群特性的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

内生细菌菌株:分离自芭蕉(Musa basjoo)、威廉斯蕉(Musa AAA cavendish var.Williams)和野生蕉(Musa itinerans)植株的内生细菌14株。气相色谱系统:美国Agilent 6890N型。包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器。分析软件:美国MIDI公司开发的基于微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS4.5(Microbial Identification System)和 LGS4.5(Library Generation Software)。

1.2 内生细菌的分离和鉴定

1.2.1 内生细菌分离方法 根部分别选取根尖距土表30 cm左右的部分;茎部分别选取根茎交接处10 cm 内、茎中段10 cm部分和茎顶端10 cm以内的部分;地下球茎、叶柄、叶肉组织、叶主脉和叶侧脉组织样本随机选取。将样本用自来水冲洗干净,吸水滤纸吸干水分,称重,先用75%酒精浸泡40 s左右,用无菌水充分淋洗,再用10% KClO3溶液浸8 min,无菌水反复淋洗,无菌滤纸吸干。在无菌研钵中充分研磨匀浆,无菌水梯度稀释至102、103和104,取200 μL稀释液涂布于NA平板上,每梯度3个重复,静置20 min 后,30℃倒置暗培养24—48 h。统计菌落种类和数量。分别计数后用-80℃甘油冷冻保存待用。

以组织消毒后用无菌水淋洗的淋洗液作为对照, 涂NA平板培养,如长菌落, 则判定研磨液所培养的菌落为非内生菌, 丢弃;若对照中无菌落, 则基本可判定在研磨液中长出的菌落可能是内生菌,纯化,保存待用。

1.2.2 脂肪酸的提取和气相色谱检测[11-12]细菌培养采用TSBA培养基:30 g胰蛋白胨大豆肉汤(TSB,购于Fisher公司)+15 g琼脂+1 L水。脂肪酸提取试剂:(1)皂化试剂:45 g氢氧化钠+150 mL甲醇+150 mL水;(2)甲基化试剂:325 mL 6 mol·L-1盐酸+275 mL甲醇;(3)萃取试剂:200 mL正已烷+200 mL 甲基叔丁基乙醚;(4)洗涤试剂:10.8 g氢氧化钠+900 mL水。配制方法由MIDI公司提供。

脂肪酸提取:(1)获菌:用接种环挑取3—5环(约40 mg湿重)的菌落置入一个干净、干燥的有螺旋盖的试管中(最佳的获菌区域为第3区);(2)皂化:加入(1.0±0.1)mL皂化试剂,拧紧盖子,振荡5—10 s,放入95—100℃的沸水中5 min,室温冷却,

10期蓝江林等:芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究 2047

振荡5—10 s,再水浴25 min,室温冷却;(3)甲基化:开盖加入(2.0±0.1)mL甲基化试剂,拧紧盖子,振荡5—10 s,(80±1)℃水浴10 min,移开且快速用流动自来水冷却至室温;(4)萃取:加入(1.3±0.1)mL的萃取试剂,拧紧盖子,温和混合旋转10 min,打开管盖,利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部份;(5)基本洗涤:加入(3.0±0.2)mL洗涤试剂,拧紧盖子,温和混合旋转5 min,打开管盖,利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶,用于气相检测。

在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本:二阶程序升高柱温,170℃起始,5℃·min-1升至260℃,而后40℃·min-1升温至310℃,维持90 s;汽化室温度250℃、检测器温度300℃;载气为氢气(2 mL·min-1)、尾吹气为氮气(30 mL·min-1);柱前压10.00 psi(1 psi=6.895 kPa);进样量l μL,进样分流比100:l。

1.2.3 细菌种类鉴定(脂肪酸鉴定法) 系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值确定目标组分的存在、采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量,再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(similarity index,SI),从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果。一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果,但当其报告的几个菌种的SI比较接近时,则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断。以脂肪酸混合标样校正保留时间。

1.3 芭蕉属植物内生细菌脂肪酸生物标记特性分析

将鉴定出的内生细菌磷脂脂肪酸生物标记含量百分比列表分析,比较生物标记在各细菌中分布特性,包括高频次、中频次、低频次、微频次、特异性和无特异性生物标记的细菌等。以磷脂脂肪酸生物标记为指标,菌种为样本,构建矩阵,将矩阵数据进行中心化处理,以马氏距离为聚类尺度,用最短距离法对数据进行系统聚类分析。

1.4 PLFA生物标记多样性分析

本研究将磷脂脂肪酸生物标记作为数量测度,引入生态学多样性测度Shannon-Wiener(H1)、Brillouin (H2)、 Mcintosh(H3)多样性指数、丰富度指数(S)、Pielou均匀度(J)和Simpson优势度指数(D)等方法,分析微生物PFLA生物标记[13-15]。

(1)Shannon-Wiener多样性指数(H1)

计算公式为:

H =-∑PilnPi 式中,Pi=Ni/N,Ni为处理i的特征磷脂脂肪酸个数,N为该试验中总特征磷脂脂肪酸个数。

(2)Pielou均匀度指数(J)

计算公式为:

J=-∑PilnPi/lnS

式中S为群落中的磷脂脂肪酸的总种类数。

(3)Simpson优势度指数(D)

计算公式为:

D=1-∑Pi2

式中,Pi种特征磷脂脂肪酸占该试验中总的特征脂肪酸个数比例。

(4)Brillouin多样性指数(H2)

计算公式为:

H2=N

1

lg?

?

?

?

?

?

??????!

!

!

!

2

1i

n

n

n

N

式中,n1为第1个磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记的个体数量,n2为第2个磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记的个体数量,n i为第i个磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记的个体数量,N为所有供试处理中磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记出现的个体总和。

(5)Mcintosh多样性指数(H3)

计算公式为:

H3 =

S

N

N

N

N i

-

-2

式中,N为特征磷脂脂肪酸总数;N i为第i个处理的土样微生物特征磷脂脂肪酸个数;S为磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记总种类数。

2 结果

2.1 芭蕉属植物内生细菌的鉴定

鉴定结果见表1,分离的14株内生细菌分布在11个属,鉴定的相似性指数都大于0.5,为典型菌种。其中,假单胞菌属有3个菌种,沙门氏菌属有2个菌种,其余9个菌种分属9个不同属。

14个菌种中,从野生蕉植株分离到9个菌种,分别是产气肠杆菌、Paucimonas lemoignei、霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、克雷白氏杆菌、伤寒沙门氏菌、门多萨假单胞菌、嗜麦芽糖窄食单胞菌和赫替假单胞菌。

从威廉斯蕉植株中分离到7个菌种,分别是戴氏西地西菌、费氏耶尔森菌、恶臭假单胞菌、大肠杆菌、

2048 中国农业科学43卷

表1 芭蕉属植物内生细菌的鉴定

Table 1 Identification of endophytic bacteria from Musa plants

编号No. 寄主

Host

种名

Species name

中文种名

Chinese name

相似性指数(SI)*

Similarity index*

1 芭蕉Musa basjoo Bacillus megaterium 巨大芽孢杆菌 0.792

2 威廉斯蕉Musa AAA Cavendish var. Williams Cedecea davisae 戴氏西地西菌 0.661

3 野生蕉Musa itinerans Enterobacter aerogenes 产气肠杆菌 0.643

4 野生蕉、威廉斯蕉Musa itinerans, Musa AAA Cavendish var. Williams Escherichia coli 大肠杆菌 0.553

5 野生蕉、威廉斯蕉Musa itinerans, Musa AAA Cavendish var. Williams Klebsiella pneumoniae 克雷白氏杆菌 0.662

6 野生蕉Musa itinerans Paucimonas lemoignei (无中文名) 0.767

7 野生蕉、芭蕉Musa itinerans, Musa basjoo Pseudomonas huttiensis 赫替假单胞菌 0.836

8 野生蕉、威廉斯蕉Musa itinerans, Musa AAA Cavendish var. Williams Pseudomonas mendocina 门多萨假单胞菌 0.608

9 威廉斯蕉Musa AAA Cavendish var. Williams Pseudomonas putida 恶臭假单胞菌 0.785

10 芭蕉Musa basjoo Rhizobium radiobacter 放射型根瘤菌 0.744

11 野生蕉Musa itinerans Salmonella choleraesuis 霍乱沙门氏菌 0.558

12 野生蕉、威廉斯蕉Musa itinerans, Musa AAA Cavendish var. Williams Salmonella typhi 伤寒沙门氏菌 0.669

13 野生蕉Musa itinerans Stenotrophomonas maltophilia 嗜麦芽糖窄食单胞菌 0.513

14 威廉斯蕉Musa AAA Cavendish var. Williams Yersinia frederiksenii 费氏耶尔森菌 0.588

*微生物自动鉴定系统对细菌的鉴定判别依赖于相似性指数(SI):SI>0.500,说明匹配性很高,为典型种;0.300<SI<0.500,说明匹配性较低,

为非典型种;SI<0.300:说明数据库没有此菌种的数据,给出的是最接近的种

*Microbial identification system depend on similarity index (SI) for the identification of bacteria: SI>0.500 means high matching and type species. 0.300<SI

<0.500 means low matching and not type species. SI<0.300 means no strain data in the database, given a hithermost species

克雷白氏杆菌、伤寒沙门氏菌和门多萨假单胞菌。

从芭蕉中仅分离得到3个菌种,分别是巨大芽孢杆菌、放射型根瘤菌和赫替假单胞菌。

2.2 芭蕉属植物内生细菌的磷脂脂肪酸(PLFA)分

布特性

试验结果见表2。芭蕉属植株14株内生细菌测定到35个有效磷脂脂肪酸生物标记,这些生物标记分为4种类型:

(1)高频次分布:磷脂脂肪酸生物标记在被测的14种细菌中出现概率很高,分布概率在0.2587—0.4之间,即在被测的14种细菌中,该类生物标记出现10—14次,属于这些生物标记的是16:0、18:1 W7C、14:0、12:0、18:0和17:0 CYCLO,共6个,表明这些生物标记可以用于代表细菌总体类群?

(2)中频次分布:磷脂脂肪酸生物标记在被测的14细菌中出现概率中等,分布概率在0.1143—0.1714之间,即在被测的14种细菌中,该类生物标记出现4—6次,属于这些生物标记的是12:0 3OH、10:0 3OH、17:0、18:1 W9C、19:0 CYCLO W8C和15:0 ISO,共6个,表明这些生物标记可以用于代表细菌属类群,如12:0 3OH生物标记,指示假单胞菌属?

(3)低频次分布:磷脂脂肪酸生物标记在被测的14细菌种出现频次较低,分布概率在0.0571—0.0857之间,即在被测的14种细菌中,该类生物标记出现2—3次,属于这些生物标记的是12:0 2OH、14:0 2OH、17:0 ISO、16:0 ISO、14:0 ISO、15:0 ANTEISO、13:0和16:0 3OH,共有8个,表明这些生物标记可以用于代表特定细菌种间差异,如13:0生物标记在克雷白氏杆菌和霍乱沙门氏菌中有分布,其它种类没有分布。

(4)微频次分布:磷脂脂肪酸生物标记在被测的14中细菌中出现在一个细菌中,分布概率为0.0286,属于这些生物标记的是10:0、11:0 ISO 3OH、ISO 17:1 W9C、12:0 ISO 3OH、13:0 2OH、13:0 ISO、13:0 ISO 3OH、15:1 ISO F、16:1 W11C、16:1 W9C、17:0 ANTEISO、17:1 W6C、17:1 W8C、11:0 ISO和19:0 10 METHYL,共15个,表明可以用于代表细菌特征性生物标记。

第(1)—(3)类生物标记共20个,编号1—20,属于常规类型的生物标记,可用于微生物群落研究。第(4)类生物标记有15个,编号21—35,属于特殊类型的生物标记,指示微生物种的特殊性,不用于微生物群落研究。

10期 蓝江林等:芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA )生物标记特性研究 2049

表2 芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA )生物标记分布特性

Table 2 Distribution characteristics of PLFA biomarkers in endophytic bacteria from Musa plants

编号 No.

磷脂脂肪酸 PLFA

频次 Frequency 分布概率

Probability of distribution

编号 No.

磷脂脂肪酸 PLFA

频次 Frequency

分布概率

Probability of distribution

1 16:0 14 0.4000 19 13:0

2 0.0571 2

18:1 W7C

13 0.3714 20

16:0 3OH

2 0.0571

3 14:0 12 0.3429 21 10:0 1 0.0286

4 12:0 11 0.3143 22 11:0 ISO 3OH 1 0.0286

5 18:0 11 0.3143 23 ISO 17:1 W9C 1 0.028

6 6 17:0 CYCLO 10 0.285

7 24 12:0 ISO 3OH 1 0.0286 7 12:0 3OH 6 0.1714 25 13:0 2OH 1 0.0286

8 10:0 3OH 6 0.1714 26 13:0 ISO 1 0.0286

9 17:0 6 0.1714 27 13:0 ISO 3OH 1 0.0286 10 18:1 W9C 6 0.1714 28 15:1 ISO F 1 0.0286 11

19:0 CYCLO W8C 6 0.1714

29 16:1 W11C 1

0.0286 12 15:0 ISO 4 0.1143 30 16:1 W9C 1 0.0286 13 12:0 2OH 3 0.0857 31 17:0 ANTEISO 1 0.0286 14 14:0 2OH 3 0.0857 32 17:1 W6C 1 0.0286 15 17:0 ISO 3 0.0857 33 17:1 W8C 1 0.0286 16 16:0 ISO 3 0.0857 34 11:0 ISO 1 0.0286 17

14:0 ISO

2 0.0571 35 19:0 10 METHYL 1 0.0286 18 15:0 ANTEISO

2

0.0571

2.3 基于脂肪酸生物标记的芭蕉属植株内生细菌聚

类分析

将高频次、中频次、低频次分布的14株细菌的20个磷脂脂肪酸生物标记列表3。

以磷脂脂肪酸生物标记为指标,菌株为样本,构建矩阵,以马氏距离为聚类尺度,用最长距离法对数据进行系统聚类分析,分析结果见图1。

当λ=16.95时,可将14株内生细菌分为3类:菌株1、2、3、10和13为1类,共同特征为均含有脂肪酸生物标记16:0,均不含磷脂脂肪酸生物标记10:0 3OH 、17:0、12:0 2OH 、14:0 2OH 和13:0。

菌株4、5、6、7和8为1类,均含有磷脂脂肪酸生物标记16:0、18:1 W7C 、12:0和18:0,均不含磷脂脂肪酸生物标记17:0 ISO 、16:0 ISO 、14:0 ISO 和15:0 ANTEISO 。

菌株9、11、12和14为1类。均含有磷脂脂肪酸生物标记16:0、18:1 W7C 、14:0、12:0、18:0和17:0 CYCLO ,均不含有磷脂脂肪酸生物标记14:0 2OH 、14:0 ISO 、15:0 ANTEISO 和16:0 3OH 。

以磷脂脂肪酸生物标记为样本,菌株为指标,构

图1 芭蕉属植物内生细菌聚类分析

Fig. 1 Cluster analysis of endophytic bacteria from Musa

plants

建矩阵,以马氏距离为聚类尺度,用最长距离法对数据进行系统聚类分析,分析结果见图2。当λ=14.79

10期 蓝江林等:芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA )生物标记特性研究

表3 内生细菌主要磷脂脂肪酸生物标记

Table 3 The main PLFA biomarkers of endophytic bacteria

菌株编号 Strain No.

磷脂脂肪酸编号 PLFA No. 磷脂脂肪酸 PLFA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 16:0 2170 14127 5857 28616 17893 20218 7684 17736 35105 18914 19591 19596 8647 21248

2 18:1 W7C 0 6921 3378 21509 8715 20610 7490 39310 1821

3 118831 14106 13031 1010 9350 3 14:0 767 2428 1651 3423 412

4 2910

0 494 806

0 4577 3008 3201 3066 4 12:0 0 1764 410 3625 2116 429 775 7301 2313 0 2484 2490

0 2566

5 18:0 0

0 1274 1380 1977 520 789 953 1110 1279 640 1801 1178

6 17:0 CYCLO 0 3229 1592 5545 5093 4305 571 0 4647

0 8832 5998 0 6288

7 12:0 3OH 0

0 2323 739 4091 6183 0

0 1173 2514

8 10:0 3OH 0 0 0 0 0 985 381 4232 3736 0 0 1137 0 1078 9 17:0 0

0 1182 1171

0 1275

0 3027 922

0 649

10 18:1 W9C

0 0 0 1241 1360 995 0 0 0 0 1608 0 1260 1798

11 19:0 CYCLO W8C 0 0 538 801 545 0 0 0 0 1685 751 0 0 629 12 15:0 ISO 27414 0 0 0 0 1023 0 0 0 0 0 0 20964 395

13 12:0 2OH 0 0 0 0 0 991 0 0 6950 0 0 1305 0 0 14 14:0 2OH 0 0 0 2254 0 852 455 0 0 0 0 0 0 0 15 17:0 ISO 1366 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1931 473 16 16:0 ISO 598 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3014 438 17 14:0 ISO

2264 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2365 0

18 15:0 ANTEISO 21721 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14970 0 19 13:0 0 0 0 0 482 0 0 0 0 0 793 0 0 0 20

16:0 3OH

0 0 0 0 0 456 0 0 0 6216 0 0 0 0

10期蓝江林等:芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究

2051

图2 磷脂脂肪酸生物标记系统聚类图

Fig. 2 Cluster analysis of PLFA biomarkers in endophytic bacteria from Musa plants

时,可将20个磷脂脂肪酸生物标记分为3个类群:类群Ⅰ包括磷脂脂肪酸生物标记16:0、18:1 W7C、14:0、12:0、18:0、17:0 CYCLO、17:0、12:0 3OH和10:0 3OH 共9个,在菌株样本中出现的频率为高频次和中频次,且所有菌株样本中均含有脂肪酸生物标记16:0。

类群Ⅱ包括磷脂脂肪酸生物标记18:1 W9C、12:0 2OH、14:0 2OH、16:0 ISO、19:0 CYCLO W8C、13:0、15:0 ISO、14:0 ISO、17:0 ISO和15:0 ANTEISO共10个,在菌株样本中出现的频率为中频次和低频次,且在菌株2和8均不含有这些脂肪酸生物标记。

当λ=9.86时,可将类群Ⅱ分为2个亚类。亚类Ⅰ包括磷脂脂肪酸生物标记18:1 W9C、12:0 2OH、14:0 2OH和16:0 ISO 共4个,在菌株样本中为中频次分布,且不存在于菌株2、3、8和10中;亚类Ⅱ包括磷脂脂肪酸生物标记19:0 CYCLO W8C、13:0、15:0 ISO、14:0 ISO、17:0 ISO和15:0 ANTEISO,在菌株样本中主要以低频次分布,且不存在于菌株2、7、8、9和12中。

类群Ⅲ仅包括磷脂脂肪酸生物标记16:0 3OH,为低频次分布,仅在菌株6和10中存在。

2.4 芭蕉属植株内生细菌PLFA生物标记多样性指数

分析

以菌株为样本,磷脂脂肪酸生物标记的种类为物种数,其Response值为个体数量,分析各菌株中磷脂脂肪酸生物标记的多样性。芭蕉属植株内生细菌多样性、丰富度、均匀度及优势度指数统计结果见表4。

表4 芭蕉属植株内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记反应值及各多样性指数

Table 4 The diversity index and total response of the PLFA biomarkers in endophytic bacteria from Musa plants

磷脂脂肪酸编号PLFA No.

频次

Frequency

Response Simpson

(D)

Shannon-Wiener

(H1)

Evenness

(J)

Brillouin

(H2)

Mcintosh (Dmc)

(H3)

1 14

237402

0.9105

3.6057

0.9470

3.6053

0.7023 2 13

282474

0.7803

2.8486

0.7698

2.8482

0.5322 3 12

30455

0.8955

3.3723

0.9407

3.3699

0.6806 4 11

26273

0.8562

3.0828

0.8911

3.0803

0.6246 5 11

12901

0.8971

3.3623

0.9719

3.3575

0.6851 6 10

46100

0.8760

3.1186

0.9387

3.1168

0.6508 7 6

17023

0.7633

2.2871

0.8848

2.2851

0.5174 8 6

11549

0.7344

2.1713

0.8400

2.1686

0.4891 9 6

8226

0.7810

2.3931

0.9258

2.3894

0.5378 10 6

8262

0.8274

2.5591

0.9900

2.5553

0.5910 11 6

4949

0.7949

2.4440

0.9455

2.4381

0.5549 12 4

49796

0.5192

1.1700

0.5850

1.1696

0.3080 13 3

9246

0.4036

1.0536

0.6647

1.0522

0.2301 14 3

3561

0.5260

1.2906

0.8143

1.2873

0.3167 15 3

3770

0.5908

1.4008

0.884

1.3977

0.3661 16 3

4050

0.4128

1.0717

0.6762

1.0689

0.2374 17 2

4629

0.4999

0.9997

0.9997

0.9983

0.2971 18 2

36691

0.4831

0.9754

0.9754

0.9752

0.2825 19 2

1275

0.4706

0.9567

0.9567

0.9524

0.2800 20 2

6672

0.1274

0.3597

0.3597

0.3589

0.0667

2052 中国农业科学43卷

2.4.1 PLFA生物标记总量与丰富度的关系 不同的菌株,检测到磷脂脂肪酸生物标记种类和量的不同,其多样性指数不同。对于丰富度,即PLFA生物标记出现频次(S)而言,编号1—6的磷脂脂肪酸16:0、18:1 W7C、14:0、12:0、18:0、17:0 CYCLO出现的频次在10次以上,说明在菌株样本中上述PLFA生物标记丰富度皆相对较高。

2.4.2 PLFA生物标记多样性指数之间的关系 从表

4中可知,其Response值总和较高,均匀度(J)较低,其Simpson优势度指数(D)、Shannon-Wiener(H1)、Brillouin(H2)、Mcintosh(H3)多样性指数也相对较高;编号2磷脂脂肪酸18:1 W7C出现在13个菌株样本中,SIMPSON(D)为0.7803,SHANNON(H1)为2.8486,均匀度(J)0.7698,Brillouin(H2)多样性指数为2.8482,McIntosh(Dmc)(H3)多样性指数为0.5322。

2.4.3 PLFA生物标记分布频次与多样性指数的关系 编号17—20的磷脂脂肪酸14:0 ISO、15:0 ANTEISO、13:0、16:0 3OH只在2个菌株样本中出现,说明在菌株样本中,上述PLFAs丰富度皆相对较低,均匀度(J)较高,其Response值总和较低,其Simpson优势度指数(D)、Shannon-Wiener(H1)、Brillouin(H2)、Mcintosh(H3)多样性指数也相对较低。

3 讨论

植物内生细菌在长期进化过程中与其宿主建立了和谐共生关系[16-17],目前,已从小麦、棉花、水稻、花生、马铃薯、番茄、柠檬、柑桔等近30种植物中分离了近60个属的内生细菌。这些内生细菌不仅将植物组织作为其栖息场所,且往往对寄主植物起到促生、防病虫、固氮等多方面的作用,有的还是良好的外源基因载体[18]。

香蕉植株内生环境作为特定的生态位,吸引着特定的细菌定殖,能够在香蕉体内生存的内生细菌,形成了特定的细菌群落,与寄主形成了依存关系。而对于芭蕉属植物内生细菌的研究,仅见付业勤等[19]对香蕉内生细菌分离、活性评价及数量分布进行研究;Cruz 等[20]对分离自香蕉和菠萝的固氮菌运用16S rRNA基因序列分析方法进行鉴定,得到织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、接种草螺菌(Herbaspirillum rubrisubalbicans)、伯克霍尔德菌(Burkholderia brasilensis)和伯克霍尔德菌热带假丝酵母(Burkholderia tropicalis)。本研究从芭蕉、威廉斯蕉和野生蕉植株中分离到内生细菌14株,分属10个属。研究结果极大丰富了芭蕉属植物内生细菌的种类。其中假单胞菌属(Pseudomons)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)为最常见属[21],已从许多植物中分离到,包含许多作为生防因子开发的菌株[22-24],如假单胞菌属[25-26]、芽孢杆菌等,展现了芭蕉属植物内生细菌广阔的开发前景。

利用脂肪酸鉴定细菌已经有很多研究,目前这项技术已经广泛用于细菌的鉴定和多样性研究中[10,26-30]。本研究采用该项技术鉴定分离获得的内生细菌,选用相似性指数高于0.5的细菌鉴定的结果,能可靠地反映细菌鉴定的种类。本研究获得的菌种14株,作为植物内生细菌,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)[31]、戴氏西地西菌(Cedecea davisae)[32]以及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)[33]均见相关文献记载,且有较为详细的研究。

本研究分离的其它菌株作为植物内生细菌尚未见报道,有些是人体病原菌,如克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)[34]、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)[35]、霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)[36]和费氏耶尔森菌(Yersinia frederiksenii)[37]等。针对这些细菌一方面需要再运用其它的鉴定手段来肯定它们的分类地位,另一方面,特别是针对这些菌株的内生定殖特性,仅凭目前普遍采用的表面消毒、平板分离的方法判定存在着很大的局限性,需进一步研究加以证实。

植物内生细菌的分布与群落结构不仅与植物的种类、基因型有关,还与植物的生长阶段、环境条件有关,存在复杂的多样性。一般来说,生物多样性是衡量生态系统稳定和健康的一个重要指标[38]。不同种芭蕉,其内生细菌组成也存在差异。本研究选取的3个品种的芭蕉属植株的内生细菌种类存在差异。付业勤等[19]从香蕉健康植株的根、假茎、叶柄、叶片等组织中分离获得386份内生细菌分离物。这些分离物的基础生物学特性的分类地位初步归属为不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)细菌。本研究获得14个菌种,从野生蕉植株分离到有9个菌种,从威廉斯蕉植株中分离到7个菌种,其中大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)4个菌种在野生蕉和威廉斯蕉植株中均可分离到。从芭蕉中仅分离得到3个菌

10期蓝江林等:芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究 2053

种。

磷脂脂肪酸生物标记作为细菌的指示物,标识着细菌的类群,同一种细菌,含有不同的磷脂脂肪酸生物标记,同一种脂肪酸生物标记,标识着不同的细菌,不同菌种的磷脂脂肪酸在组成和含量上有较大差异,它与细菌的遗传变异、耐药性等有极为密切的关系[27,39],目前这项技术已经广泛用于细菌的鉴定和多样性研究中[10]。本研究共分离获得11属14个菌种,共有磷脂脂肪酸生物标记35个,其中高频次分布的6个,中频次分布的6个,低频次分布的8个,这些可用于微生物群落研究。微频次分布的生物标记有15个,属于特殊类型的生物标记,指示着微生物种的特殊性,不用于微生物群落研究。

植株内生细菌群落结构受植株生长环境、生长状态影响,或者说,植株体内某些特殊的内生细菌群落结构特性可能表征植株的生长环境或状态。适宜的生长环境,其多样性高、优势度低、均匀度高。本研究以菌株为样本,以磷脂脂肪酸生物标记的种类为物种数,引入多样性、丰富度、均匀度及优势度指数等生态学概念,分析了几种芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸生物标记总量与各生态学参数之间的关系,尝试说明内生细菌的磷脂脂肪酸生物标记的分布规律。结果表明,在菌株样本中编号1—6的磷脂脂肪酸16:00、18:1 W7C、14:00、12:00、18:00、17:0 CYCLO生物标记丰富度皆相对较高;磷脂脂肪酸生物标记的Response值总和较高,均匀度(J)较低,其Simpson 优势度指数(D)、Shannon-Wiener(H1)、Brillouin (H2)、Mcintosh(H3)多样性指数也相对较高。将特定植物内生细菌的磷脂脂肪酸生物标记的分布规律研究清楚,对于利用磷脂脂肪酸作为植物内生环境的生物标记,总体地研究不同植物内磷脂脂肪酸生物标记的多样性,识别不同植物内生环境的异质性具有重要意义。

4 结论

本研究共分离获得14个菌种,分属11个属。从野生蕉植株分离到有9个菌种,从威廉斯蕉植株中分离到7个菌种,从芭蕉中仅分离得到3个菌种。测定到35个有效磷脂脂肪酸生物标记,高频次分布的磷脂脂肪酸生物标记的是16:0、18:1 W7C、14:0、12:0、18:0和17:0 CYCLO,共6个,可以用于代表细菌总体类群;中频次分布的磷脂脂肪酸生物标记的是12:0 3OH、10:0 3OH、17:0、18:1 W9C、19:0 CYCLO W8C 和15:0 ISO,共6个,可以用于代表细菌属类群;低频次分布的磷脂脂肪酸生物标记的是12:0 2OH、14:0 2OH、17:0 ISO、16:0 ISO、14:0 ISO、15:0 ANTEISO、13:0和16:0 3OH,共有8个,可以用于代表特定细菌种间差异;微频次分布的磷脂脂肪酸生物标记共15个,可以用于代表细菌特征性生物标记。磷脂脂肪酸生物标记的Response值总和较高,均匀度(J)较低,其Simpson优势度指数(D)、Shannon-Wiener(H1)、Brillouin(H2)、Mcintosh(H3)多样性指数也相对较高。

References

[1] Zinniel D K, Lambrecht P, Harris N B, Feng Z, Kuczmarski D, Higley

P, Ishimaru C A, Arunakumari A, Barletta R G, Vidaver A K.

Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(5): 2198-2208.

[2] Taghavi S, Garafola C, Monchy S, Newman L, Hoffman A, Weyens N,

Barac T, Vangronsveld J, van der Lelie D. Genome survey and characterization of endophytic bacteria exhibiting a beneficial effect on growth and development of poplar trees. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(3): 748-757.

[3] Siciliano S D, Fortin N, Mihoc A, Wisse G, Labelle S, Beaumier D,

Ouellette D, Roy R, Whyte L G, Banks M K, Schwab P, Lee K, Greer

C W. Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in

response to soil contamination. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(6): 2469-2475.

[4] Chen Y, Dumont M G, McNamara N P, Chamberlain P M, Bodrossy L,

Stralis-Pavese N, Murrell J C. Diversity of the active methanotrophic community in acidic peatlands as assessed by mRNA and SIP-PLFA analyses. Environmental Microbiology, 2008, 10(2): 446-459.

[5] 颜慧, 蔡祖聪, 钟文辉. 磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物

多样性研究中的应用. 土壤学报, 2006, 43(5): 851-859.

Yan H, Cai Z C, Zhong W H. PLFA analysis and its applications in the study of soil microbial diversity. Acta Pedologica Sinica, 2006, 43(5): 851-859. (in Chinese)

[6] 张国赏, 吴文娟, 潘仁瑞. 气相色谱—质谱法检测细胞脂肪酸及其

在细菌鉴定上的应用. 合肥联合大学学报, 2000, 10(4): 92-96.

Zhang G S, Wu W J, Pan R R. Determination of fatty acids in cells by GC-MS and its application in bacterium identification. Journal of Hefei Union University, 2000, 10(4): 92-96. (in Chinese)

[7] Abel K, de Schmertzing H, Peterson J I. Classification of

microorganisms by analysis of chemical composition. I. feasibility of

2054 中国农业科学43卷

utilizing gas chromatography. Journal of Bacteriology, 1963, 85: 1039-1044.

[8] Athalye M, Noble W C, Minnikin D E. Analysis of cellular fatty acids

by gas chromatography as a tool in the identification of medically important coryneform bacteria. Journal of Applied Bacteriology, 1985, 58: 507-512.

[9] Bernard K A, Bellefeuille M, Ewan E P. Cellular fatty acid

composition as an adjunct to the identification of asporogenous, aerobic gram positive rods. Journal of Clinical Microbiology, 1991, 29(1): 83-89.

[10] 吴愉萍, 徐建明, 汪海珍, 胡宝兰, 吴建军. Sherlock MIS 系统应

用于土壤细菌鉴定的研究. 土壤学报, 2006, 43(4): 642-647.

Wu Y P, Xu J M, Wang H Z, Hu B L, Wu J J. Application of Sherlock MIS in identification of soil bacteria. Acta Pedologica Sinica, 2006, 43(4): 642-647. (in Chinese)

[11] 蓝江林, 朱育菁, 苏明星, 葛慈斌, 刘芸, 刘波. 水葫芦内生

细菌的分离与鉴定. 农业环境科学学报, 2008, 27(6): 2423-2429.

Lan J L, Zhu Y J, Su M X, Ge C B, Liu Y, Liu B. Isolation and identification of the endophyte bacteria from Eichhornia crassipe(Mart. )Solms. Journal of Agro-Environment Science, 2008, 27(6): 2423-2429. (in Chinese)

[12] 王秋红, 陈亮, 林营志, 朱育菁, 蓝江林, 杨淑佳, 刘波. 福建

省青枯雷尔氏菌脂肪酸多态性研究. 中国农业科学, 2007, 40(8): 1675-1687.

Wang Q H, Chen L, Lin Y Z, Zhu Y J, Lan J L, Yang S J, Liu B.

Polymorphism of fatty acid of Ralstonia solanacearum in Fujian province. Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40(8): 1675-1687. (in Chinese)

[13] Magurran A E. Ecological Diversity and Its Measurement. Princeton:

Princeton University Press, 1988: 141-162.

[14] 张玉波, 王晓蕾, 樊美珍, 王林, 李智增. 马尾松林生态系中虫

生真菌及其寄主的多样性和消长动态的研究. 安徽农业大学学报, 2007, 34(3): 342-347.

Zhang Y B, Wang X L, Fan M Z, Wang L, Li Z Z. Diversity of entomogenous fungi and their hosts and population dynamics of the fungi in a Masson’s pine plantation ecosystem. Journal of Anhui Agricultural University, 2007, 34(3): 342-347. (in Chinese)

[15] 孙海新, 刘训理. 茶树根际微生物研究. 生态学报, 2004, 24(7):

1353-1357.

Sun H X, Liu X L. Microbes studies of tea rhizosphere. Acta Ecologica Sinica, 2004, 24(7): 1353-1357. (in Chinese)

[16] Kobayashi D Y, Crouch J A. Bacterial/fungal interactions: from

pathogens to mutualistic endosymbionts. Annual Review of

Phytopathology, 2009, 47: 63-82.

[17] McInroy J A, Kloepper J W. Survey of indigenous bacterial

endophytes from cotton and sweet corn. Plant and Soil, 1995, 173: 337-342.

[18] 何红, 邱思鑫, 胡方平, 关雄. 植物内生细菌生物学作用研究

进展. 微生物学杂志, 2004, 24(3): 40-45.

He H, Qiu S X, Hu F P, Guan X. Advance in biological effects of endophytic bacteria. Journal of Microbiology, 2004, 24(3): 40-45. (in Chinese)

[19] 付业勤, 蔡吉苗, 刘先宝, 黄贵修. 香蕉内生细菌分离、活性评价

及数量分布. 热带作物学报, 2007, 28(4): 78-83.

Fu Y Q, Cai J M, Liu X B, Huang G X. Isolation, bioactivity evaluation and quantity distribution of endophytic bacteria in banana.

Chinese Journal of Tropical Crops, 2007, 28(4): 78-83. (in Chinese) [20] Cruz M L, de Souza E M, Weber O B, Baldani J I, D?bereiner J,

Pedrosa F O. 16S ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from banana(Musa spp.) and pineapple (Ananas comosus (L. ) Merril). Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(5): 2375-2379.

[21] 邹文欣, 谭仁祥. 植物内生菌研究新进展. 植物学报, 2001, 43(9):

881-892.

Zou W X, Tan R X. Recent advances on endophyte research. Acta Botanica Sinica, 2001, 43(9): 881-892. (in Chinese)

[22] 马艳, 赵江涛, 常志州, 黄红英, 叶小梅, 张建英. 西瓜内生枯

草芽胞杆菌BS211的拮抗活性及盆栽防效. 江苏农业学报, 2006, 22(4): 388-393.

Ma Y, Zhao J T, Chang Z Z, Huang H Y, Ye X M, Zhang J Y.

Antagonistic activity of an endophytic strain BS211 of Bacillius subtilis and its biocontrol efficacy against fusarium wilt of watermelon. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2006, 22(4): 388-393. (in Chinese)

[23] Ravel F, Courty C, Coret A, Charmet G. Beneficial effects of

neotyphodium lolii on the growth and the water status in perennial ryegrass cultivated under nitrogen deficiency or drought stress.

Agronomie, 1997, 17: 173-181.

[24] 刘国奇, 蒋如璋. 韭菜根际荧光假单胞菌株的分离和初步研究. 微

生物学通报, 1999, 26(3): 189-192.

Liu G Q, Jiang R Z. Isolation and preliminary study on Pseudomonas fluorescent rhizobacterial strain from Chinese chives. Microbiology, 1999, 26(3): 189-192. (in Chinese)

[25] 黎起秦, 谢义灵, 林纬, 韦继光, 罗宽. 广西番茄内生细菌的

多样性和数量动态. 生物多样性, 2006, 14(6): 534-540.

Li Q Q, Xie Y L, Lin W, Wei J G, Luo K. Distribution and diversity of

10期蓝江林等:芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究 2055

endophytic bacteria in tomato plants from Guangxi. Biodiversity

Science, 2006, 14(6): 534-540. (in Chinese)

[26] 洪永聪, 胡方平, 黄晓南. 成团泛菌(Pantoea agglomerans)对稻谷

的致病性. 福建农林大学学报: 自然科学版, 2002, 31(1): 1-3.

Hong Y C, Hu F P, Huang X N. Pathogenicity of Pantoea

agglomerans on rice seeds. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University: Natural Science Edition, 2002, 31(1): 1-3. (in Chinese)

[27] 刘志辉, 蔡杏姗, 竺澎波, 关平, 许婉华, 吴龙章. 应用气相色

谱技术分析全细胞脂肪酸快速鉴定分枝杆菌. 中华结核和呼吸杂

志, 2005, 28(6): 403-406.

Liu Z H, Cai X S, Zhu P B, Guan P, Xu W H, Wu L Z. Study on species identification of Mycobacteria by gas chromatography analysis of whole-cell fatty acid. Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases, 2005, 28(6): 403-406. (in Chinese)

[28] 张晓霞, 王直强, 李世贵, 顾金刚, 姜瑞波. 脂肪酸组分分析在不

动杆菌鉴定中的应用. 生物技术通报, 2009(6): 151-154.

Zhang X X, Wang Z Q, Li S G, Gu J G, Jiang R B. Identification of Acinetobacter spp. using fatty acid compositions analysis.

Biotechnology Bulletin, 2009(6): 151-154. (in Chinese)

[29] Sundh I, Nilsson M, Borg? P. Variation in microbial community

structure in two boreal peatlands as determined by analysis of phospholipid fatty acid profiles. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(4): 1476-1482.

[30] Tighe S W, de Lajudie P, Dipietro K, Lindstr?m K, Nick G, Jarvis B

D W. Analysis of cellular fatty acids and phenotypic relationships of

Agrobacterium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and

Sinorhizobium species using the sherlock microbial identification system. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50: 787-801.

[31] 陈敏, 许丽君, 吴斌娟, 陈金丹. 黄瓜青枯病内生拮抗菌株HE-1

的初步鉴定及培养优化条件. 科技通报, 2008, 24(4): 489-493.

Chen M, Xu L J, Wu B J, Chen J D. Identification and optimum culture of cucumber entophytic strain HE-1. Bulletin of Science and Technology, 2008, 24(4): 489-493. (in Chinese)

[32] 赵明, 贺声蓉, 陈小静, 黄春萍, 王一丁. 产甾体皂甙华重楼内

生菌的筛选与鉴定. 微生物学报, 2005, 45(5): 776-779.

Zhao M, He S R, Chen X J, Huang C P, Wang Y D. Screening and identification of steroidal saponins-producing endophytes from Paris polyphylla var. Chinensis Franch. Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(5): 776-779. (in Chinese)

[33] Andreote F D, de Araújo W L, de Azevedo J L, van Elsas J D, da

Rocha U N, van Overbeek L S. Endophytic colonization of potato (Solanum tuberosum L.) by a novel competent bacterial endophyte, Pseudomonas putida strain P9. and its effect on associated bacterial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(11): 3396-3406.

[34] Goldfarb D, Harvey S B, Jessamine K, Jessamine P, Toye B,

Desjardins M. Detection of plasmid-mediated KPC-producing Klebsiella pneumoniae in Ottawa, Canada: evidence of intrahospital transmission. Journal of Clinical Microbiology, 2009, 47(6): 1920-1922.

[35] Namdari H, Hamzavi S, Peairs R R. Rhizobium(Agrobacterium)

radiobacter identified as a cause of chronic endophthalmitis subsequent to cataract extraction. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(8): 3998-4000.

[36] 郎福伟. 一起猪霍乱沙门氏菌食物中毒调查报告. 中国饮食卫生

与健康, 2005, 3(5/6): 46-47.

Lang F W. Investigation on food poisoning caused by Salmonella choleraesuis of pig. Chinese Journal of Food Sanitation and Health, 2005, 3(5/6): 46-47. ( in Chinese)

[37] 崔树玉, 温宪芹, 孟蔚, 孙启华, 周国清, 程伯鲲, 徐建国. 山东

省腹泻病人携带耶尔森菌HPI毒力岛大肠杆菌的调查. 中华流行

病学杂志, 2001, 22(1): 46-48.

Cui S Y, Wen X Q, Meng W, Sun Q H, Zhou G Q, Cheng B K, Xu J G..

Study on diarrhea disease and Escherichia coli strain harboring HPI pathogenicity island of Yersinia enterolitica in Shandong provine.

Chinese Journal of Epidemiology, 2001, 22(1): 46-48. ( in Chinese) [38] Bertollo P. Assessing landscape health: a case study from northeastern

Italy. Environmental Management, 2001, 27: 349-365.

[39] Welch D F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clinical

Microbiology, 1991, 4(4): 422-438.

(责任编辑岳梅)

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