皮肤创伤愈合过程中TGF-β-1mRNA 表达与损伤时间关系的实验研究[J]
皮肤创伤愈合过程中TGF-β1mRNA表达与损伤时间
关系的实验研究
作者：李学锋1；王慧君1；罗红2(1南方医科大学南方医院病理科，广东广州 510515；2中山大学，广
东广州 510215)
摘要：目的研究TGF-β1 mRNA在皮肤创伤愈合中的表达变化规律及其在损伤时间推断中的价值。方法用实时PCR技术检测不同造创时间(生前伤15 min~2 周，死后伤1~6 h)小鼠皮肤切创创缘组织TGF-β1 mRNA含量，并同时检测GAPDH含量对结果进行均一化。结果 TGF-β1 mRNA于伤后24 h显着增高(和对照组比较P<0.01)，48 h和72 h时还保持在较高水平。死后伤1 h和3 h时，TGF-β1 mRNA的表达有增高的趋势，6 h则降至对照水平。结论 TGF-β1 mRNA在小鼠皮肤创伤后有明显的规律性表达，能作为一种代表性细胞因子参与有一定存活时间(6 h以上)的生前伤损伤时间的推断。实时PCR技术能对mRNA的表达水平进行较为精确的检测，是目前损伤时间推断研究中用于细胞因子定性和定量研究的有效方法。
关键词：TGF-β1；创伤修复；损伤时间推断；实时PCR
中图分类号：R338 文献标识码：A 文章编号：
1673-4254(2006)01-0059-03
Temporal relation of transforming growth factor-β1mRNA expression with injury in the healing process of mouse skin wounds
LI Xue-feng1；WANG Hui-jun1；LUO Hong2
1Department of Pathology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Sun Yat-sen University, Guangzhou 510215, China
Abstract: Objective To explore the time-related expression of transforming growth factor (TGF)-β1 mRNA in the healing process of mouse skin wounds and its potential application in forensic wound age estimation. Methods Real-time PCR was used to quantify TGF-β1 mRNA expression in mouse skin wounds induced at different time points (15 min to 2 weeks before and 1 to 6 h after death). The expression of GAPDH was also detected for normalization of TGF-β1 mRNA level. Results TGF-β1 mRNA in the antemortem wounds was elevated significantly 24 h after the injury (P<0.01 by Dunnet test) and maintained the high level at 48 and 72 h. In postmortem wounds, TGF-β1mRNA tended to increase 1 and 3 h after injury, and decreased to the control level at 6 h. Conclusions The expression of TGF-β1 mRNA is closely related to the time of wound and can therefore be used as a representative cytokine marker for dating the skin wounds induced over 6 h before death. Real-time PCR for detecting dynamic expression of TGF-β1 mRNA in wound healing process provides a reliable means for qualitative and quantitative cytokine analysis for forensic wound age estimation.
Key words: transforming growth factor-β1; wound healing; wound age estimation; real-time PCR
收稿日期：2005-03-24
基金项目：国家自然科学基金(39870764)
Supported by National Natural Science Foundation of China (39870764) 作者简介：李学锋(1974-)，男，博士研究生通讯作者：王慧君，电话: 020-********, E-mail: hjwang@https://www.360docs.net/doc/0910595741.html,
创伤修复是一个在时间和空间上受修复因子调控的复杂生物学过程，多种生物活性物质在创伤修复的不同阶段发挥着重要的调节作用，同时它们在创伤修复中的表达和损伤时间密切相关。其中细胞因子在创伤修复中的活跃表达，使其作为活体伤中一种分子水平的“生活反应”迹象，成为推断损伤时间新的参考参数。多种细胞因子在动物皮肤创伤修复过程中均有规律性表达，其中部分因子的表达在人体标本上得到印证
[1][2][3][4][5][6]。我们以前的研究发现，TGF-β1是与损伤时间关系较为清楚的一种细胞因子，它很可能作为一种标志性的因子，用于精确推断损伤时间[7][8]，但鉴于斑点杂交和RT-PCR等技术在核酸定量上的不足，认为有必要应用实时PCR技术，深入调查和精确阐明TGF-β1 mRNA在创伤修复过程中的表达变化规律，进一步验证和完善TGF-β1 mRNA的表达在损伤时间推断中的研究。实时PCR技术在理论上能较好地解决核酸的定量问题，已被认为是细胞因子定量有效和稳定的方法，但在损伤时间推断的应用方面，国外文献报道较少，国内未见报道。
1 材料和方法
1.1 实验动物的分组、造创和组织处理
清洁级昆明小鼠，雌雄不拘，6~7周龄，购自南方医科大学实验动物中心。随机分为实验组和对照组，实验组按生前不同造创时间分为12组(伤后15 min，30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h，1 周，2 周)，每组3只动物。动物于造创前1 d用8%硫化钠背部脱毛，乙醚吸入麻醉，局部碘伏消毒，用无菌手术刀片于背部脊柱两侧皮肤各作一切口，长约1.5 cm，深达肌肉筋膜。动物造创后入清洁笼内饲养，给清洁饮水，自由取食。于造创后相应时点颈椎脱臼处死动物，取创口及周围0.5 cm全层皮肤及皮下组织。对照组动物不造创，处死后取相应部位皮肤及皮下组织。另设死后伤组，于动物处死后1、3 、6 h造创，造创后30 min
取材，每组3只动物。皮肤组织离体后，立即置液氮保存待检。
1.2 引物和Taqman探针的设计、合成
小鼠TGF-β1和GAPDH特异性引物和Taqman探针用PE公司的Primer Express 2.0软件设计，上海生工公司合成。序列如下：
TGF-β1:
上游引物: 5'-TCGACATGGAGCTGGTgAAA-3'
下游引物: 5'-GAGCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3'
Taqman探针: 5'-AAGCGCATCGAAGCCATCCGTG-3'
GAPDH:
上游引物: 5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'
下游引物: 5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'
Taqman探针: 5'-TCGTGGATCTGACGTGCCGCC-3'
1.3 皮肤组织总RNA的提取
用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[9]抽提总RNA，操作过程中严防RNA酶污染。
1.4 逆转录反应
反应体系为：5×逆转录缓冲液 4 μl，MMLV-RT(10 U/μl)2 μl，dNTP(10 mM)0.4 μl，下游引物0.4 μl，总RNA 5 μl，DEPC水7.8 μl；反应条件：37 ℃ 1 h，95 ℃ 3 mi n灭活逆转录酶。TGF-β1和GAPDH逆转录的反应体系和条件相同，但加入的为各自的下游引物。
1.5 TGF-β1和GAPDH目的片段的克隆
按以下反应体系分别扩增TGF-β1和GAPDH目的片段：5×buffer 10 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，Taq酶(3 U/μl ) 1 μl，Forward primer 1 μl，Reverse primer 1 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 31 μl，反应条件为：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环，72 ℃ 10 min。产物经3%琼脂糖凝胶电泳证明无杂带。取约250 μl产物用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PCR纯化试剂盒(Promega)纯化，纯化产物连接入PGEM-T载体(Promega)，转化DH 5α菌，挑选阳性菌落用PCR 扩增目的片段进行初筛，选PCR阳性菌落进一步进行序列测定验证目的片段，并提取制备质粒。
1.6 实时PCR
根据质粒提取液的D260值换算分子拷贝数(copy/μl)，并作梯度稀释，作为阳性标准品，用于标准曲线的生成。质粒标准品和待检样品cDNA 均按以下体系进行反应：5×定量缓冲液10 μl，Taq酶(3 U/μl)1 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl，Forward primer 1 μl，Reverse primer 1 μl，Taqman Probe 1 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 30 μl，反应条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，40个循环。以灭菌ddH2O代替模板作为阴性对照。使用试剂为ABI荧光定量试剂盒，购自华美公司，仪器为PE7000全自动荧光定量PCR仪(Perkin Elmer)。
1.7 结果的统计学处理
计算同一样品目的基因(TGF-β1)和参照基因(GAPDH)拷贝数的比值，代表TGF-β1 mRNA的表达水平，结果以各组比值的均数±标准差表示。用Dunnet检验进行统计学分析。
2 结果
TGF-β1 mRNA在包括对照组和死后伤组在内的各时点的组织中均有表达。样品TGF-β1的拷贝数用GAPDH的拷贝数均一化，结果示在伤后24 h 显着增高(和对照组比较P<0.01)，48 h和72 h时还保持在较高水平。死后伤1 h，3 h时，TGF-β1 mRNA的表达有增高的趋势，6 h则降至对照水平(图 1)。3%琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物片段长度和预期相符，除目的条带外，无杂带。
图1 伤后不同时间TGF-β
mRNA表达
1
mRNA at different time points Fig.1 Expression of TGF-β
1
after injury
*P<0.01 vs control group
3 讨论
TGF-β1 mRNA表达的实时PCR检测显示，TGF-β1 mRNA在伤后6 h以前均未见明显增高，伤后6~12 h有上升趋势，至24 h达到峰值，并持续至伤后72 h。TGF-β1表达的免疫组化检测证明，在创伤修复早期，TGF-β1主要在表皮表达，后期则主要在炎性细胞和修复细胞中表达。一般认为，mRNA先于相应蛋白的表达，而TGF-β1mRNA的表达峰值于伤后24 h出现，说明TGF-β1在创伤早期表皮的表达比重不高，主要大量表达于后期的巨噬细胞和成纤维细胞等炎性细胞和修复细胞。这种表达规律和TGF-β1在创伤修复中的作用是相吻合的。
于动物死后1 h，3 h造创后，创缘组织TGF-β1 mRNA含量和对照组比较有增高的趋势，直至6 h才降至对照组水平，这与斑点杂交和免疫组化的结果类似[7]。认为死后伤细胞因子增高的原因是：⑴ 死后短期内，
动物作为整体已经死亡，但局部的组织细胞对缺血缺氧有一定的耐受力，还具有超生反应能力，在局部切割的机械刺激下，还能释放甚至合成生物活性物质[9][10][11]，而此时细胞因子之间相互作用的抑制机制可能已经消失，从而导致相应时点的死后伤表达高于生前伤；⑵ 死后造创时，伤口部位由于局部血管破裂导致血液从血管流出，进入组织间隙，血液中存在的细胞因子也可能造成检测结果的升高。因此，对死后伤与生前伤的鉴别而言，单凭TGF-β1 mRNA一种细胞因子的表达水平，不能区别6 h以内的生前伤和死后伤，可通过结合其它较早期表达的细胞因子(如bFGF)综合分析[12]。
尸体材料死后间隔时间不等，尸体所处环境各异，机体死亡后以及标本离体后组织中mRNA的稳定性如何，直接关系到mRNA作为损伤时间推断指标的实际应用价值和可行性。由于样本量的限制，我们没有作这方面的探讨。但实验结果证实[13][14]，动物死亡后，组织总RNA包括mRNA的含量随死亡时间呈规律性的线性下降，而且在死后短期(36~96 h)内未发现有急剧的RNA降解，直至死后1周组织中仍可检出靶mRNA。这些发现进一步证明死后尸体的创伤组织用于分子水平细胞因子检测的可行性，因此，在损伤时间推断中具有应用价值。
总之，TGF-β1 mRNA在小鼠皮肤创伤后有明显的规律性表达，能作为一种代表性极强细胞因子参与有一定存活时间(6 h以上)的生前伤损伤时间推断。实时PCR技术能对mRNA的表达水平进行较为精确的检测，是目前损伤时间推断研究中用于细胞因子定性和定量的有效方法。
参考文献：
[1]Kondo T, Ohshima T, Eisenmenger W. Immunohistochemical and morphometrical study on the temporal expression of interleukin-1α(IL-1α) in human skin wounds for forensic wound age determination[J]. Int J Legal Med, 1999, 112: 249-52.
[2]Kondo T, Ohshima T, Mori R, et al. Immunohistochemical detection of chemokines in human skin wounds and its application to
wound age determination[J]. Int J Legal Med, 2002, 116: 87-91.
[3]Takamiya M, Saigusa K, Aoki Y. Immunohistochemical study of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor expression for age determination of cutaneous wounds[J]. Am J Forensic Med Pathol, 2002, 23(3): 264-67.
[4]Grellner W, Georg T, Wilske J. Quantitative analysis of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, TNF-alpha) in human skin wounds[J]. Forensic Sci Int, 2000, 113(1-3): 251-64.
[5]Kibe Y, Takenaka H, Kishimoto S. Spatial and temporal expression of basic fibroblast growth factor protein during wound healing of rat skin[J]. Br J Dermatol, 2000, 143(4): 720-27.
[6]Kondo T, Ohshima T. The dynamics of inflammatory cytokines in the healing process of mouse skin wound: a preliminary study for possible wound age determination[J]. Int J Legal Med, 1996, 108(5): 231-36.
[7]王慧君, 李东, 杨木兰, 等. 在大鼠皮肤切创愈合过程中TGF-β1基因及蛋白表达变化与损伤时间关系的实验研究[J]. 中国法医学杂志, 2001, 16(4): 193-97.
[8]王慧君, 丁云川. RT-PCR检测不同时间大鼠皮肤切创TGF-β1mRNA 表达[J]. 中国法医学杂志, 2003, 18(2): 67-69.
[9]Chomczynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987, 162: 156-59.
[10]王慧君, 杨木兰. 超生反应阶段骨骼肌机械性损伤的形态学研究[J]. 中国法医学杂志, 1997, 12(4): 193-97.
[11]王慧君, 杨木兰. 超生反应阶段骨骼肌电损伤的形态学研究[J]. 中国法医学杂志, 1998, 13(1): 1-6.
[12]Takamiya M, Saigusa K, Nakayashiki N, et al. Studies on mRNA expression of basic fibroblast growth factor in wound healing for wound age determination[J]. Int J Legal Med, 2003, 117: 46-50.
[13]Inoue H, Kimura A, Tuji T. Degradation profile of mRNA in
a dead rat body: basic semi-quantification study[J]. Forensic Sci Int, 2002, 130: 127-32.
[14]Marchuk L, Sciore P, Reno C, et al. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon and cartilage[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1379: 171-77.