植物病毒载体
植物病毒载体的类型及应用
摘要：植物病毒载体可分为5种类型，烟草花叶病毒载体是最常用植物病毒载体。植物病毒载体应用广泛，有诸多优点，也存在一些问题。本文对植物病毒载体进行综述。
关键词：植物病毒载体；类型；烟草花叶病毒载体；应用
The Types and Application of Plant Virus Vectors
Abstract: Plant virus vectors can be divided into five types. Tobacco Mosaic Virus vector is the most commonly used plant virus vector. Plant viral vectors are widely used. They have many advantages，as well as some problems. This article provides an overview of plant virus vectors. Key words: plant virus vectors; type; Tobacco Mosaic Virus vector;application
DNA 体外重组是基因工程技术的重要步骤之一，它是将外源目的基因与适当的载体相连。要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(V ector)。载体有很多种，病毒载体是其中的一种。病毒载体是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具[1]。植物病毒载体的研究开展得较晚，1984 年才诞生了第一例由植物DNA病毒——花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)构建的载体。但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白的需求。因此，1984年之后，人们尝试了多种植物病毒载体构建方法。目前已经构建了多种类型的植物病毒载体，已有用植物病毒载体pClYVV 表达了绿色荧光蛋白基因[2]、Nodulin gene基因、人的α-干扰素基因及小球状病毒抗原蛋白基因等的报告[3]。近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。
一植物病毒载体的类型
植物病毒载体可分为置换型载体、插入型载体、互补型载体、抗原展示型载体和融合/释放型载体5 种。
1置换型载体
置换型载体是最原始的载体类型，由外源基因置换对植物病毒基因组复制影响不大的基因构建而成，一般用于转染原生质体进行瞬时表达以验证构建载体的可行性，较少接种于植株来系统地表达外源基因。CaMV 首先被用于构建置换型载体的研究。用外源基因置换CaMV 的基因Ⅱ(蚜传因子)后不影响其侵染性，成功地表达了细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)和人α-D 干扰素基因[4]，IFN-αD 的表达量可达到2μg/g(鲜叶)。
DEC 2012
2 插入型载体
插入型载体是在病毒基因组中引入额外的亚基因组启动子，将外源基因插入此启动子下游，随病毒的增殖使外源基因得以大量表达。
构建插入型载体至少要考虑外源基因的插入位置、外源基因的大小和外源基因的启动子3个因素。外源基因的插入不能影响病毒正常基因的表达，外源基因不能过大，否则可能会影响病毒外壳的组装和运动而使外源基因不能表达。对于球状或二十面立体等轴对称病毒来说，包装限制决定了插入的外源编码序列不能太大。丝状或杆状植物病毒，如CaMV、马铃薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)和豇豆花叶杆状DNA 病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)等植物病毒因为不存在包装限制，适于构建插入型载体[5]。通常用病毒的CP （衣壳蛋白）或复制酶亚基因组启动子，为了避免同源重组，需采用亲缘关系较远病毒的亚基因组启动子。目前主要有马铃薯X病毒(Potato virus X，PYX)[6]、烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒和番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)这4种植物病毒用于构建插入型载体，其中PYX 载体多用做探针，研究植物和植物病毒基因结构与功能，以及病毒与宿主之间的相互作用。烟草花叶病毒和豇豆花叶病毒载体主要用于展示医药用的外源小肽。
3 互补型载体
为了弥补置换型载体和插入型载体的不足，研究人员设计了互补型载体。互补型载体是将外源基因插入缺陷型病毒或亚病毒粒子中，通过转基因植物或与辅助病毒共侵染而互补缺陷。利用转基因植物表达病毒基因是由转基因植株提供失活基因产物，弥补缺陷型病毒载体失去的功能。亚病毒互补载体系统利用亚病毒表达外源基因，与辅助病毒共接种，由辅助病毒提供失活基因产物。构建亚病毒互补载体系统是一个很有希望的方向，但需要进一步研究外源基因插入的位点、载体的稳定性及对寄主植物症状和病毒运动的影响。4 抗原展示型载体
抗原展示是将外源基因选择性地插入病毒CP 基因中融合表达，而正好使外源多肽呈现在病毒粒子表面，通过提纯重组病毒即可获得大量的抗原[7]。这种方法避免了双亚基因组启动子可能的同源重组，增强了外源多肽的抗原性，因而适用于抗原性较差、难以用其他方法表达和纯化的小肽。但构建抗原展示型载体需要在原子水平了解病毒的结构，因而仅用于结构较为清楚的几种病毒，应用较多的是TMV、CPMV 和TBSV。
5融合/释放型载体
这是新近发展的病毒载体类型。它建立在插入型载体的基础之上，为了避免双亚基因组启动子可能带来的不稳定性和融合表达可能影响病毒的系统侵染，在插入外源基因的同时在病毒基因组中引入病毒自身蛋白酶的切割加工位点或口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白酶序列，使外源基因与CP的融合表达产物能被蛋白酶切割而释放。Santa等构建了PVY 的融合/释放载体，研究表明该载体不仅能系统侵染和表达游离的绿色荧光蛋白(GFP)和CP(能提供系统侵染功能)，也产生大量的GFP-CP 融合蛋白，并组装成病毒粒子，子代病毒粒子的浓度约为野生型PVY 的2 倍。
二烟草花叶病毒载体
烟草花叶病毒(TMV)是目前研究最为广泛的一类植物病毒，病毒粒子为短杆状，能在被侵染的植物细胞中大量积累，具有作为表达载体的潜力[8]。迄今，TMV 载体成功表达的外源基因至少已有150 种。
1TMV的基因组结构
TMV是单链RNA 病毒，基因组长6395个核苷酸，包括4个编码区，至少编码4种多肽，分别是126ku、183ku、30ku 和17.5ku 蛋白[9]。其中126ku 和183ku两种病毒蛋白参与病毒的复制，而30ku 蛋白质则与病毒从一个细胞转移
到另一个细胞的运动有关，又称移动蛋白(MP)，17.5ku 蛋白为病毒的外壳蛋白(CP)。由此可见，这3 种蛋白质是TMV在被感染的植株中传播繁殖的基本条件。鉴于外壳蛋白质能够大量地合成，同时又是病毒繁殖的非必要成分，即使外源基因插入导致外壳蛋白突变失活，对病毒的繁殖也是无关紧要的。因此，该基因被认为是导入和表达外源基因的理想位点[10]。
2TMV克隆载体的构建
N. Takamatsu 等在1987 年发展出一种经过修饰改造的、可以在体外转录出具感染性的TMV-RNA 的全长TMV-cDNA 克隆。把细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，插入在该克隆中紧挨外壳蛋白基因起始密码子的下游，构成了TMV-cDNA-CAT重组体。然后把此重组体体外转录形成的转录物接种烟草植株，结果在被接种的烟草叶片中观察到了CA T 活性。
由于TMV不存在包装限制，Dawson 等于1989 年构建了一个可复制的附加载体来弥补TMV替换载体的不足，在这个附加载体中保留了完整的野生型基因组[11]。Dawson 及其同事在TMV 基因组的运动蛋白基因和外壳蛋白基因之间加上了一个细菌cat 基因，这个cat 基因受双倍的外壳蛋白亚基因组启动子调控。在这种情况下，系统性感染伴随着高水平CA T 活性而发生，但是在感染植物中发生的重组会使外源转入基因产生缺失并产生野生型的TMVRNA。用齿瓣兰环斑病毒上的等价基因替换TMV 外壳蛋白基因可以防止同源重组的发生。这种方法已用来产生一系列非常稳定的表达载体，这些载体可用于在植物中合成许多有价值的蛋白。
三植物病毒表达载体的应用
1 基础研究领域的应用
植物病毒载体的出现为许多基础生物学研究提供了强有力工具，包括基因重组，植物病毒的运动，包壳和传播，鉴定和分析基因的功能以及基因沉默等。
2商业应用
植物病毒载体最有价值的应用是生产医用蛋白或疫苗[12]，因而备受重视。迄今为止，利用植物病毒载体至少已有20 多种医用蛋白或疫苗抗原获得成功表达。例如，在大肠杆菌中表达α天花粉蛋白时，表达量仅占细菌总蛋白的0.01%，而用TMV 做载体，表达量高达可溶性蛋白的2%，而且构建的载体还可以系统侵染烟草植株。由于α天花粉蛋白在治疗人免疫缺陷病毒(HIV)病中具有很好的疗效，因此大量生产α天花粉蛋白不仅可望用于临床治疗，还可以用于研究HIV 的分子致病机理。
四植物病毒载体表达外源基因的优点
①部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，它能够将其基因组扩散到被感染植株的所有细胞。因此，如果在病毒的基因组上插入外源基因，那么它也就会系统地分布到整个植株，无须经过从原生质体到再生植株的繁琐程序。病毒的这种感染方式，为简化植物基因工程中外源基因的传递过程提供了极大的可能性。
②植物病毒载体有可能解决将外源基因导入像玉米这样的单子叶植物的问题。Ti质粒载体只能有效地转化双子叶植物，但对诸如小麦、水稻这样的单子叶植物，依然有不少困难。而像双生病毒(geminivirus)由于具有广泛的寄主范围，有可能被发展成单子叶植物基因克隆载体。
③被感染的植株能够繁殖出大量的病毒颗粒，因此有可能通过重组病毒载体利用植物来生产大量的外源蛋白质[13]。这也就是说，可以不必使用高成本、高投入的酵母或细菌发酵罐，就可以直接在大田种植，获取大量廉价的药用蛋白及具有重要经济意义的商品蛋白质。
五植物病毒载体存在的问题
1 稳定性
植物病毒载体的致命缺点是稳定性较差，常由于病毒基因的重组而导致丢失外源基因[14]。这可能是由于插入型载体的双亚基因组启动子的同源重组造成的。
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2 外源基因大小限制
置换载体表达外源基因的大小受被置换基因大小的限制，而插入载体表达中的外源基因如果过大，则可能导致表达困难或不能系统侵染。 3 病毒载体的接种方法
目前构建的植物病毒载体通常用体外转录产物
或用基因枪导入质粒DNA 感染植物，因而较为昂贵和繁琐。
4 安全性
病毒是植物重要的病原物，大部分病毒具有较广的寄主范围，尽管部分病毒载体已被修饰不能引起严重症状或被介体传播，但释放修饰和未修饰的病毒载体仍要严格管理或保证不引起病毒病的流行。此外，已有研究表明，少数病毒载体可在转病毒基因植物中发生重组，这也提出了新的安全性问题。
六 结语与展望
植物病毒载体虽然还存在一些需要解决的问题,但是具备许多其它载体无法具有优点，如表达水平高、增殖速度快、宿主范围广和外源蛋白易于纯化和保存。因此植物病毒载体在应用方面非常受欢
迎，其诱人的应用前景值得人们去探索，去研究。 由于植物体内、体外均不含对人体有害的物质及病原菌, 所以用植物生产经口医药品( 口服疫苗等各种多肽及蛋白质) 等要比用细菌及动物细胞生产安全得多, 且生产过程中易于无菌管理,也无需从生产材料中除去有害物质, 从而易于达到安全、低成本、大批量生产的目的。有望通过植物病毒载体转化植物，来用转基因植物工业化生产工业蛋白和医药蛋白。
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pClYVV/CP/W 的构建及GFP 的表达[J].安
植物病毒病的有效防治方法
植物病毒病的有效防治方法 现在病毒病的危害有日益严重的趋势，发病病毒种类越来越多，常见到的有厥叶病毒，花叶病毒，条斑病毒，银叶病毒，黄化病毒，等几十种，而且混发的现象日趋严重。当前如何解决植物病毒病，是目前农业生产中非常紧迫的问题。植物病毒病的解决也是农民增产增收的保证。 一、病毒病的发病原因 （1）传染源 （2）传媒 （3）高温 （4）干旱 （5）光照过强 （6）品种本身的原因 二、预防措施 （1）切断传染源，措施：种子消毒，接种抗毒免疫剂。选择无毒种苗。利用茎尖脱毒克隆方法繁育种苗。 （2）消灭传媒，做好蚜虫，白粉虱等害虫的防治工作。 （3）尽量控制好温度，最高温度应控制在32度以下，如温度过高，就要采取措施，地面要经常浇小水，叶面多喷喷抗毒免疫剂或灌根。 （4）避免干旱，小水勤浇。要控制合适的湿度。 （5）夏天光照强时要进行适当遮光。 （6）增喷抗毒免疫剂，中药及生物的为最好。 （7）选育抗病毒品种 （8）改进栽培措施，选择先进的有机栽培模式。增强本身抗病毒能力。 三、治疗措施
（1）种子用脱毒剂进行处理，磷酸三钠10倍浸泡10分钟，或高猛酸钾100倍浸泡，或抗毒免疫剂100倍浸种10分钟，冲洗干净后播种或催芽。 （2）用无毒无菌无虫卵基质育苗。 (3)要尽量用有机栽培模式，利于根系发育，提高本身抗病毒能力 (4)出苗后接种抗病毒疫苗三次以上。 (5)移栽后定期喷洒抗病毒疫苗或制剂。 (6)冲施肥要以天然有机肥为主，用生物发酵好的肥料，厌氧菌或放线菌类有益防腐微生物为最好，养根壮根，提高产量的同时提高其抗病毒能力。 关于植物病毒病 植物病毒对寄主的危害，素有“植物癌症”之称，防治上十分困难。病毒在侵染寄主后，不仅与寄主争夺生长所必需的营养成分，而且破坏植物的养分输导，改变寄主植物的某些代谢平衡，使植物的光合作用受到抑制，致使植物生长困难，产生畸形、黄化等症状，严重的造成寄主植物死亡。为了有效地控制植物病毒病，人们采用了各种措施，包括轮作、种子脱毒、病毒间的弱毒株系交叉保护、抗病品种的选用、传毒介体的控制及化学农药的使用等，近年来转基因植物抗病研究也有了新的进展。但这些措施还不能有效克服病毒的危害，且化学农药的使用对环境造成了很大危害，在当前大力提倡绿色食品和环境保护的前提下，加强植物病害的综合防治和减少化学农药的使用已成为植保工作者工作的重点内容之一。为了能开发出有效控制病毒且不会造成环境污染的抗病毒药剂，研究人员不断寻找和筛选天然的生物源抗病毒物质。目前，国内外已报道的天然抗病毒活性物质种类很多，有的已形成产品，在农业生产中发挥着重要作用。 一、改变耕作制度，加强栽培管理，预防植物病毒病的发生和流行 1．轮作套种采用不同作物和品种的轮作和套种，可以减少病原积累，防止病害严重发生。 2．选择适宜播种期播种期的选择对病毒病的发生也有很大影响。 3．加强苗期管理苗床和苗期的管理对预防和控制病毒病的发生十分重要，因为苗床上的病株，可能成为大田发病的重要毒源。因此，要尽力保证幼苗不生病或少生病，加强田间栽培管理，提高植物抗病毒病的能力，铲除田间地头杂草，拔除病株以除掉毒源，及时治虫防病，也能减轻病害。 二、种植抗、耐病品种 采用抗病和耐病品种可以经济有效地防治和减轻病毒病的发生。多数抗病品种可以抵抗病毒复制和扩散，有些蔬菜可以抗传毒介体。
病毒学试题(回忆版)
一、名词解释： 1. spike 2. DI(defective interfering) 3. Replication intermediate (RI) 4. Plague（噬斑） 5. PFU（噬斑形成单位）、CPE（细胞病变）、隐蔽期 6、信息体（informosome） 7、温度敏感性变异株连 8、抗原漂移与抗原转变 9 准种10、互补11、细胞原癌基因12、干扰素 13、Ribozyme 14、DNA疫苗15单克隆抗体 16法氏囊，网状内皮组织增殖症等（传染病英文翻译成中文） 二、简答题： 1、慢病毒感染的概念及原因（两个方面即病毒方面与机体方面） 2、病毒载体活疫苗的概念并举例说明病毒载体构建的技术路线 3、亚病毒的分类及其定义 4、病毒的特性及其疫苗的研究进展（病毒学） 5、病毒的吸附和侵入过程（分两步）（病毒学） 6、请设计试验方案，如何证明某一种病毒的核酸具有感染性（病毒学） 7、简述病毒对细胞的损害作用方式（病毒学） 8、叙述新病毒出现的机制（病毒学） 9、叙述反转录病毒的复制步骤（病毒学） 10、有几个是写出病毒的英文名称让写出分别属哪科、哪属（不常见的几个） 11、如果一牛场发生布氏杆菌，请制定免疫计划（传染病）？ 12、假如发生烈性传染病如何做？（传染病） 三、论述题
1、详细叙述禽流感病毒的基因组结构，并写出每段基因组所编码的蛋白及其每 种蛋白的功能（病毒学） 2、详细叙述SARS病毒与禽流感病毒在分子水平上的异同（传染病）。 2003年农科院考博题 动物病毒学 一、名词解释 1 DI 2 Antigentic drift 3 感染性cDNA 4 核酸疫苗 5 PFU 6 Ribozyme 7 LTR 8 温度敏感突变株 9 envelope 10 准种 二、简答题 1 类病毒与朊病毒的区别。 2 鉴定新城疫病毒毒力的依据。 3 病毒血凝、血凝抑制作用及血吸附机理。 4 写出下列各科病毒的一种病毒 Herpesviridae, Adenoviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae 5 黄病毒科有几个属，各写出一个病毒。 6 OIE高致病力禽流感病毒的特征。 7 J亚群白血病病毒的致病特点。 三、问答题 1 动物病毒的分离与鉴定过程。 2 以某动物病毒为例，论述研究病毒的分子致病机理的技术路线。 传染病试题可能与中国农大相同 2003年中国农业大学考博试题 微生物试题 1 名词解释： prion 感染性核酸回复突变CTL MAC 合胞体溶原化重组抗体cytokine 2 简答： 缺损病毒微RNA病毒属共有几个科，各种的代表病毒 动脉炎病毒属蛋白特性内源性抗原 胞内菌相关的细胞内免疫抗体产生的动力学 3 论述 阻断ELISA的原理，技术路线，操作，判定 分子生物学诊断技术 外源性抗原的加工过程 2003传染病试题 1 进口动物时应如何做 2 鸡呼吸道疾病的区别 3 子猪肠道疾病的病变 4 非典型猪瘟的控制 5 猪伪狂犬病的种猪场净化 6 从传染病流行的三因素，论述防治措施
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
植物病毒载体
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高级植物病毒学
高级植物病毒学
高级植物病毒学 第一讲 1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别： ⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuous bilayer membrane）与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virus particle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别： ①大小: 一些痘病毒（pox virus）比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellular parasite）如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。
植物病毒田间接种、传染方式教材
实验六植物病毒病及其传染方式 一、实验目的 认识植物病毒形态和病毒病主要症状类型，通过植物组织汁液的摩擦接种和蚜虫传播试验了解病毒病的主要传染方式。 二、讲解要点 1．病毒颗粒很小，必须用电子显微镜才能观察到。植物病毒颗粒可以分为圆球状（或等边多面体）、炮弹状、长杆状和线条状4种。这些在课堂和本次实验课上只能通过观看电镜照片或幻灯片来了解。 2．植物病毒病的主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑坏死、畸形。应该注意：一方面这些症状类型的分辨在病毒病鉴定上具有比起它病害更重要的意义，另一方面在实际观察中，也会发现同一种病毒病在发病过程中或在不同环境条件下会有不同的表现（不同病状甚至隐症）。 3．病毒病多为系统性侵染，没有病征，易与非侵染性病害相混淆，往往需要通过一定方式的传染试验证实其传染性。植物病毒病的传染方式有：机械（摩擦）接触传染、嫁接传染、介体（包括昆虫、线虫、真菌、螨类和菟丝子）传染、花粉及种子传染等。由于病毒是专性寄生物，它的侵染来源都与活体（活的动、植物体或介体）有关，传染要使病毒接触活体。例如汁液摩擦接种，要用新鲜的病毒汁液，摩擦的目的是造成寄主植物体表面的微伤，使病毒有可能进入活的细胞，过重的损伤造成组织坏死并不利于病毒的传染。蚜虫、飞虱等刺吸式口器昆虫取食植物汁液的方式更容易满足植物病毒传播的两方面要求。 4．大白菜病毒病的症状为幼苗受侵后首先心叶出现明脉即沿叶脉失绿，继呈花叶及皱缩。成株被害，出现不同程度的叶片皱缩、变硬而脆，后期出现褐色斑点或褐色坏死条纹；植株矮化。我国十字花科蔬菜病毒病主要由芜菁花叶病毒（简称TuMV）、黄瓜花叶病毒（简称CMV）和烟草花叶病毒（简称TMV）所致，前两种病毒能由蚜虫和汁液传染，第三种只能以汁液传染。 马铃薯病毒病主要是皱缩花叶病和卷叶病两种。前者的症状为叶片皱缩、变小；叶尖向下弯曲，全株矮化，叶片色泽深浅不均，以后出现黑褐色坏死斑，质地变脆，严重时全株发生坏死性叶斑，自下而上枯死。马铃薯皱缩花叶病是由马铃薯X病毒（简称PVX）和马铃薯Y 病毒（简称PVY）两种病毒复合侵染引起的。PVX只能由汁液传染，昆虫不传染。PVY的传染方式有汁液与蚜虫传染。马铃薯卷叶病的症状为叶缘向上卷曲，病重时呈圆筒状。叶片色泽较浅，有时叶背面呈红色或紫色。叶片变厚变脆，病叶不出现萎蔫下垂的现象，矮化亦
高级植物病毒学
高级植物病毒学 第一讲 1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别： ⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuous bilayer membrane）与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virus particle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。 ⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别： ①大小: 一些痘病毒（pox virus）比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellular parasite）如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。 3.专著和刊物 《植物病毒学》《植物病毒研究方法》《植物病毒种类的分子鉴定》《Plant Virology》《微生物学报》《植物保护学报》《植物病理学报》Plant Disease、Phytopathology、Molecular Plant Microbe Interactions、Molecular Plant Pathology、Virus Genes、Archives of Virology、Virus Research、Journal of General Virology 第二讲 1.类病毒：不具病毒粒体，而是裸露的RNA，能侵染细胞，进行自我复制，称为类病毒。 2.卫星核酸：是指依赖于辅助病毒才能复制的线状和环状小分子核酸，其核酸序
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
植物抗病基因研究进展
植物抗病基因研究进展 摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。 关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景 一、植物抗病基因工程原理 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。 二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性 一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在
实验 15 植物病毒病害抗性鉴定
实验15 植物病毒病害抗性鉴定 植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。 植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。 本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。 一、试材及用具 1．试材发病的植物组织及家兔等。 2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。 二、方法步骤 （一）病毒检测 可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、 图5－1 病毒抗原的分离与纯化
灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。 利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。 2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示： 图5－2 病毒抗血清的制备与保存 3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。 （二）病毒病抗性鉴定 病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是： 1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；
动物病毒学(DOC)
《动物病毒学》实验课 讲稿 任课教师：方六荣 授课对象：2002级动物医学专业1-4班 授课时间：2004.09-2005.01
目录 实验一鸡胚接种 (1) 实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 (6) 实验三原代细胞培养 (9) 实验四病毒TCID50的测定 (11) 实验五中和试验 (13)
实验一鸡胚接种 一、实验目的 了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。 二、鸡胚接种的作用 主要用于： ①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验） ④测定病毒毒力 三、材料 1、鸡胚10日龄 2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球 四、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点 1、组织分化程度低 2、可选择不同的日龄和接种途径 3、病毒易于增殖 4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒 5、容易采集和处理 6、来源充足 7、设备和操作简便易行 （二）缺点 1、胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒 2、母源抗体 3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
五、鸡胚的结构与功能 1、卵壳上有细孔，进行气体交换 2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 3、气室呼吸和调节压力 4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中 尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。 6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。 六、受精卵的选择 1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。 2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。 3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。 七、鸡胚的孵育 1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 2、相对湿度：50%-60% 3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法 植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 二.农杆菌介导的基因转化方法 （一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti
（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构 在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中 T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
植物病原病毒
植物病原病毒 一、概述 1. 病毒定义：病毒是一组（一种或一种以上）DNA或RNA核酸分子，包围在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞借助于寄主蛋白合成体系、物质和能量完成复制，伴随核酸突变发生变异的分子寄生物。简单讲，病毒是一类由核酸和蛋白质组成的非细胞状态的分子生物。 主要特征：①结构简单的（核酸+蛋白或脂蛋白衣壳）；②严格专性寄生的（依赖寄主的核酸和蛋白质合成系统）；③非细胞生物（分子寄生物）。 2. 类群：根据病毒的寄主类型，习惯上将病毒划归为下列几大类群 寄生植物的称为植物病毒 寄生动物的称为动物病毒 医学病毒（人类病毒） 真菌病毒 寄生细菌的称为噬菌体（细菌病毒） 二、病毒与人类的关系 有害方面：引起人类疾病（天花、爱滋病、非典型肺炎、肝炎、流感、小儿麻痺等）。 引起畜禽疾病（狂犬病、口蹄疫、猪瘟、牛瘟、鸡瘟、鸭瘟）。 引起植物病害。 有益方面：用作基因工程的载体或元件。 有害生物控制（害虫、真菌及杂草生防）。 环境保护（利用藻类病毒消除水面藻类污染）。 花卉增色（金心黄杨、金边瑞香、杂色郁金香）。目前已研究和命名的植物病毒达1000多种，其中许多为重要的农作物病原，其所造成的损失仅次于真菌病害。 植物病毒也有利用的价值，如 TMV导致分子生物学的产生； 病毒在开发基因工程的载体、转 基因植物研究等方面，也发挥了 很大作用。 三、病毒在生物中的地位 生物：细胞生物、分子生物 细胞生物：原核生物（原核生物 界）、真核生物（动物界、植物 界、菌物界、原生生物界） 分子生物：病毒界？：真病毒、 亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病 毒） 四、植物病毒的一般性状 （一）、植物病毒的形态 病毒粒体：病毒的基本存在形 式（形态）。 病毒粒体的形态微小，只有在放 大数万倍的电镜下才能观察到， 其度量单位通常采用纳米（nm， 1nm=10-9m）。 植物病毒粒体形态主要有：球 状、线状、杆状、弹状、双联体 状、丝线状、柔软不定形等。形 态多样性。 ◆许多植物病毒由不只一种粒 体构成。 一些球状病毒也有多种粒体组 分，但这些粒体形态相同，只是 其中所包含的核酸含量不同而 重量存在差异。 这些病毒被称为多分体病毒，必 需有多种病毒粒体组分同时侵 染寄主细胞，才能增殖并完成其 生物学功能。 （二）植物病毒的结构 植物病毒粒体主要含有核酸和 蛋白两大部分。中间为核酸芯 （RNA或DNA），外部有外壳蛋 白（CP）包被形成衣壳，少数病 毒在蛋白衣壳外面还包被一层 那囊膜，称为包膜病毒,如植物弹 状病毒。 1. 杆状或线状病毒：蛋白质亚基 螺旋状排列，中间是一个由核酸 构成的空心管子，核酸也呈螺旋 状排列，嵌入到螺旋状排列的蛋 白质亚基内端。如，TMV杆状 粒体。 TMV：2130个蛋白质亚基；130 圈；16 1/3亚基/圈，3 圈一个周期，49个亚基 /3圈；2.3nm亚基间隔/ 圈。 2. 球状病毒：蛋白质亚基镶嵌在 粒体表面，构成多面体形，内心 是病毒的核酸；球状病毒并非光 滑的球体，而是多面体（多为二 十面体），多个正三角形组合而 成。 （三）植物病毒组分及其生物学 功能 植物病毒的主要成份是核酸和 蛋白质，有些还含有少量的金属 离子、多胺和水等。 1. 核酸 核酸是病毒遗传信息的载体，植 物病毒粒体中的核酸主要是其 基因组，有些含mRNA。一套基 因组含有病毒侵染、复制、运转、 传播等生命活动所需的全部基 因，决定病毒的增殖、生物学特 性及致病性等。 植物病毒基因组所包含的基因 数目从一个（卫星病毒）至十二 个（植物呼肠孤病毒），一般为 4~7个基因，分子量从0.4×106d 到15.5×106d，通常具有外壳蛋 白基因、复制酶基因及运动蛋白 基因等。大部分植物病毒基因组 能编码4~7种蛋白质。 （1）植物病毒的核酸类型 植物病毒的基因组多数为核糖 核酸（RNA），少数为脱氧核糖 核酸（DNA）。 根据核酸性质及功能，可将植物 病毒基因组分为下列5种类型：
第十四章 病毒学实验技术
第三篇病毒学实验技术 实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
基因工程应用——抗病毒
讨论为什么植物转入病毒外壳蛋白（coat protein, CP）基因或病毒复制酶基因就具备抗病性，本人开始也没想明白，后来请在大学的同学帮忙才查到，欢迎大家补充！ （1）病毒外壳蛋白（coat protein, CP）基因：在植物中表达病毒外壳蛋白基因可以阻止病毒的侵染或症状的产生。 病毒外壳蛋白的抗性机理：一种假说认为，当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，它们立即被细胞中的自由CP所重新包裹，从而阻止了入侵病毒核酸的翻译和复制。在离体条件下，附加自由CP能够抑制末装配病毒的翻译的实验结果支持了上述假说；另一假说认为，抗性机制是在CP水平上抑制病毒脱壳，此说法最有力的证据是转基因植株可抗完整病毒的侵染．但不能抵御裸露病毒RNA的入侵；还有一种观点认为病毒外壳蛋白的抗性机制不是外壳蛋白在起作用，而可能是它的RNA转录物与入侵病毒RNA之间的相互作用 （2）病毒复制酶基因：RNA病毒（如烟草花叶病毒）的复制酶是依赖于RNA 的RNA聚合酶。病毒复制酶一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成的。在植物中表达不完整的病毒复制酶基因可以显著提高植物对病毒的抗性，作用机制还不十分清楚，可能与基因转录后沉默有关。 下面是文献: 植物抗病毒基因工程 植物病毒病难以防治已成为植物界的“癌症”，给全球农业生产造成巨大的损失。有效地防治植物病毒病，减少经济损失，满足日益增长的世界人口需求。是农业生产当务之急。病毒分子生物学，植物基因工程的迅速发展，为筛选培育抗病、优质、丰产的新植物开辟了广阔的前景。自1986年，全球范围内兴起了多种利用分子生物学及基因工程研究成果防治植物病毒病害的策略，并成功地培育筛选出多种抗病毒的工程植物。 1．病毒外壳蛋白介导的基因工程抗病性 外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，它的功能是将病毒基因组核酸包被起来，保护核酸；与宿主互相识别，决定宿主范围；参与病毒的长距离运输等。1986年，美国的Beachy实验室的Powell－Abel等第一次将烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV－Cp）基因插入修饰过的农杆菌质粒中，并置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子下，经农杆菌侵染而将TMV－Cp基因转入烟草，并在烟草中表达TMV－Cp，分子生物学检测表明TMV－Cp基因已整合到烟草的基因组中，并能稳定地遗传给子代，在转基因烟草中TMV－Cp表达量占叶蛋白0．1％左右。
作物病毒病
作物病毒病 定义：由植物病毒寄生引起的病害。植物病毒必须在寄主细胞内营寄生生活，专一性强，某一种病毒只能侵染某一种或某些植物。但也有少数为害广泛；如烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。一般植物病毒只有在寄主活体内才具有活性；仅少数植物病毒可在病株残体中保持活性几天、几个月、甚至几年，也有少数植物病毒可在昆虫活体内存活或增殖。植物病毒在寄主细胞中进行核酸（RNA或DNA）和蛋白质外壳的复制，组成新的病毒粒体。植物病毒粒体或病毒核酸在植物细胞间转移速度很慢，而在维管束中则可随植物的营养流动方向而迅速转移症状识别。 田间常因多种病毒复合侵染而使症状表现复杂。可分为以下4种类型： 1、花叶型：典型症状是病叶、病果出现不规则退绿、浓绿与淡绿相间的斑驳，植株生长无明显异常，但严重时病部除斑驳外，病叶和病果畸形皱缩，叶明脉，植株生长缓慢或矮化，结小果，果难以转红或只局部转红，僵化。 2、黄化型：病叶变黄，严重时植株上部叶片全变黄色，形成上黄下绿，植株矮化并伴有明显的落叶。
3、坏死型：包括顶枯、斑驳环死和条纹状坏死。顶枯指植株枝杈顶端幼嫩部分变褐坏死，而其余部分症状不明显；斑驳坏死可在叶片和果实上发生，病斑红褐色或深褐色，不规则型，有时穿孔或发展成黄褐色大斑，病斑周围有一深绿色的环，叶片迅速黄化脱落；条纹状坏死主要表现在枝条上，病斑红褐色，沿枝条上下扩展，得病部分落叶、落花、落果，严重时整株枯干。 4、畸形型：表现为病叶增厚、变小或呈蕨叶状，叶面皱缩.植株节间缩短，矮化，枝叶丝生呈丛簇状。病果呈现深绿与浅绿相间的花斑，或黄绿相间的花斑，病果畸形，果面凸凹不平。病果易脱落。。 发病特点 蚜虫是植物病毒的主要传播者。有的种类只传播一种病毒，也有的可传播多种病毒；还有某一种病毒由多种蚜虫传播的。高温、干旱、蚜虫为害重，植株长势弱，重茬等，易引起该病的发生，可通过摩擦、打杈、邦架等作业时接蛹传播，也可通过蚜虫，机械传播。 防治方法 1 农业防治：①选用抗病品种。②加强栽培管理，合理轮作，收获后清除病残株，注意田间操作中手和工具的消毒。③种子消毒，用清水浸种4小时后捞出放入10%的磷酸三钠液中浸20分钟后洗净催芽播种。 2 也可用新型的病毒病诱抗剂葡聚烯糖或氨基寡糖素来防治。 病毒病应以防为主，综合防治。市场上防治病毒病的药剂有植病灵、32%核苷·溴·吗啉胍(全新配方)、抗病威（病毒K）、病毒立克、病