高效液相凝胶过滤色谱法测定沙蚕金属蛋白酶的纯度_邓志会
常见蛋白酶抑制剂
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要 : 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
凝胶色谱法
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同 的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗 粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在 凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过 程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分 子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后 流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大， 完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应 的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变 凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子， 在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而 分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操 作 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。 ②凝胶介质的处理和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约 1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。 ③上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经μm孔径滤膜过滤或10， 000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为 mol/L；Sephacryl凝胶应为 mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达 mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在 1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。 ⑤分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。
凝胶渗透色谱法
实验6 凝胶渗透色谱法 测定聚合物的分子量和分子量分布 聚合物分子量具有多分散性，即聚合物的分子量存在分布。不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。分子量对聚合物的性能有十分密切的关系，而分子量分布的影响也不可忽视。当今高分子材料已向高性能化发展，类似分子量分布等高一层次的高分子结构的问题，越来越引起人们的重视。 自高分子材料问世以来，人们不断探索分子量分布的测定方法，直到60年代凝胶渗透色谱诞生，成为迄今为止最有效的分子量分布的测定方法。 一．实验目的 1.了解凝胶渗透色谱的原理； 2.了解凝胶渗透色谱的仪器构造和凝胶渗透色谱的实验技术； 3.测定聚苯乙烯样品的分子量分布。 二．实验原理 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）也称为体积排除色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC）是一种液体（液相）色谱。和各种类型的色谱一样，GPC/SEC的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物种不同分子量的高分子组份。当样品中不同分子量的各组份的分子量和含量被确定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。 一般认为，GPC/SEC是根据溶质体积的大小，在色谱中由于体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。 凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、
葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动，它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。反之，高分子体积增大，淋洗体积减小，因而达到依高分子体积进行分离的目的。基于这种分离机理，GPC/SEC 的淋洗体积是有极限的。当高分子体积增大到已完全不能向微孔渗透，淋洗体积趋于最小值，为固定相微球在色谱中的粒间体积。反之，当高分子体积减小到对微孔的渗透几率达到最大时，淋洗体积趋于最大值，为固定相微孔的总体积与粒间体积之和，因此只有高分子的体积居于两者之间，色谱才会有良好的分离作用。对一般色谱分辨率和分离效率的评定指标，在凝胶色谱中也沿用。 图16－1是GPC/SEC 的构造示意图，淋洗液通过输液泵成为流速恒定的流动相，进入紧密装填多孔性微球的色谱柱，中间经过一个可将样品送往体系的进样装置。聚合物样品进样后，淋洗液带动溶液样品进入色谱柱并开始分离，随着淋洗液的不断洗提，被分离的高分子组份陆续从色谱柱中淋出。浓度检测器不断检测淋洗液中高分子组份的浓度响应，数据被记录最后得到一张完整的GPC/SEC 淋洗曲线。如图16－2。 图16－1 GPC/SEC 的构造 淋洗曲线表示GPC/SEC 对聚合物样品依高分子体积进行分离的结果，并不是分子量分布曲线。实验证明淋洗体积和聚合物分子量有如下关系： e BV A M ?=ln 或 e V B A M log ''log ?= （16－1） 式中M 为高分子组分的分子量，A 、B （或A’、B’）与高分子链结构、支化以及溶剂温度等影响高分子在溶液中的体积的因素有关，也与色谱的固定相、体积和操作条件等仪器因素有关，因此（1）式称为GPC/SEC 的标定（校正）关系。（1）式的适用性还限制在色谱固定相渗透极限以内，也就是说分子量过高或太低都会使标定关系偏离线
基质金属蛋白酶及其抑制因子与盆底功能障碍性疾病的关系
基质金属蛋白酶及其抑制因子与盆底功能障碍性疾病的关系 盆底功能障碍性疾病（PFD）是中老年女性的常见病，MMP7、TIMP1及其相互作用对ECM的降解过程有着重要影响，进而也与PFD的发生发展密切相关。 标签：盆底功能障碍性疾病（PFD）；基质金属蛋白酶（MMPs）；组织型金属蛋白酶抑制物（TIMPs） 盆底功能障碍性疾病（PFD）是中老年女性的常见病，是威胁妇女健康的慢性疾病之一，随着社会老龄化的到来，发病率逐渐升高。PFD以女性压力性尿失禁（SUI）、盆腔器官脱垂（POP）和生殖道损伤为常见问题，是一组由于盆腔支持结构缺陷或退化、损伤及功能障碍而导致的疾病。PFD的发病危险因素有妊娠、阴道分娩损伤、长期腹压增加、先天缺陷及盆底肌肉退化薄弱，而支持盆底器官的盆底肌肉组织结构功能异常为主要因素[1]。 骨盆底由多层肌肉和筋膜构成，封闭骨盆出口，承托并保持盆腔脏器于正常位置[1]。细胞外基质（ECM）是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。ECM是盆底结缔组织的主要成分，其合成与分解处于动态平衡中，以维持组织形态结构及功能的稳定。因此，其含量及结构的改变与PFD的发生发展关系密切。目前已经发现多种作用于ECM不同成分的酶，其中胞外基质降解最重要的蛋白水解系统由结缔组织及肿瘤组织合成、分泌的基质金属蛋白酶（MMPs）构成。MMPs是一个依赖锌离子的内肽酶类，在细胞外基质中其活性可被内源性抑制剂—组织型金属蛋白酶抑制物（TIMPs）家族所调节。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员MMP1～26，分为6类。其中MMP3、7为基质溶解素类，不仅可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白还能降解纤维连接蛋白和层粘连蛋白等，它们的内源性抑制剂TIMP1可以抑制MMP3、MMP7的活性。由此可见，MMP7，TIMP1及其相互作用对ECM的降解过程有着重要影响，进而也与PFD的发生发展密切相关。现就MMP7，TIMP1与PFD之间关系的相关研究做一综述。 盆腔肌肉群与盆底结缔组织共同作用支撑着阴道与子宫。盆底结缔组织主要由胶原构成，胶原蛋白是盆底韧带、筋膜的主要成分。盆底的阴道上皮、肌纤维组织与结缔组织的胶原构成主要是Ⅰ型与Ⅲ型。 1 PFD患者盆底结缔组织中胶原含量改变 许多文献报道女性SUI及POP患者，膀胱阴道筋膜，主韧带组织中胶原含量减少。2009年李萍等[2]在研究中发现PFD患者宫颈组织中1型蛋白含量减小。2009叶明等[3]在研究中发现POP患者韧带和盆底筋膜组织Ⅲ型胶原含量减少。 2 胶原代谢情况改变 2.1 胶原分解代谢增加
影响凝胶色谱的分离的因素及其改进方法
影响凝胶色谱的分离的因素及其改进方法 吴承志张宁封树林孙振鹏 （西南大学药学院，重庆，400716） 摘要：凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 关键词：凝胶色谱；影响因素；填料；改进方法 Influence factors of the separation gel chromatography and improving methods Wu chengzhi Zhang ning Fengshuling Sun zhenpeng （College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716） Abstract:Gel chromatography was developed in the early sixties a quick and simple separation techniques, because the equipment is simple, easy to operate, does not require organic solvents, the polymer material has a high separation efficiency. Also known as gel permeation chromatography molecular exclusion chromatography. GPC is mainly used for classification of polymer molecular weight and molecular weight distribution of the test. Has now been biochemistry, molecular biology, biological engineering, medicine, molecular immunology and related fields widely used, not only used in scientific experimental research, and has a large scale for industrial production. Keywords: gel chromatography; Influencing factors; Packing; Improvement methods 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。用于
组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化
组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维 化 (作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ ) 【摘要】基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMP) 是体内重要的水解酶之一，几乎能降解细胞外基质(extracellular matrix ，ECM的所有成分；基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue in hibitor of metalloprote in asas ，TIMPs )是MMP 啲内源性抑制 系统。近年来发现，MMPs/TIMPs调节失衡与肝纤维化的关系密切，可从多方面影响肝纤维化的形成。通过干扰MMP与TIMPs基因的表达，研究肝纤维化的发病机制和药物治疗是有希望的途径。 【关键词】MMPs ;TIMPs;肝纤维化 肝纤维化是许多慢性肝病的共同病理过程，是细胞外基质(ECM)的合 成与降解失衡，导致在细胞间质的过度沉积［1-4 ］，肝组织结构改建。 许多细胞因子参与了这一过程，但是MMP是最重要的一种［5］。MMPs 几乎能降解细胞外基质(ECM)的所有成分，而其天然抑制剂-基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能与MMPs成员结合成复合物抑制其活性⑹。二者的调节异常将引起ECM合成或降解的失衡，与各种器官纤维化疾病密切相关。研究发现，通过调节MMP与TIMPs基因的表达
来治疗肝纤维化是肝纤维化治疗的新途径。本文就MMPs/TIMPs与肝纤维化的关系及治疗前景作一综述。 1 MMPs分类、功能、结构及活性的调控 MMPs是一组基质金属蛋白酶。M MPs在肝内主要由肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞表达分泌，参与细胞外基质降解的一类锌-钙离子依赖的内源性蛋白水解酶家族，因其需要Ca2+ Zn 2+等金属离 子作为辅助因子而得名，是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，几乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，在生理病理过程中发挥着重要的作用。MMP家族由24种成员组成，其中有23种存在于人体中。 1. 1 MMPs可被分成六类［7］（1）胶原酶类。主要包括MMP-1 MMP-8 MMP-13和MMP-18它们能够降解间质胶原（I、H、皿型胶原），也能消化许多别的ECM及可溶性蛋白［5］。 MMP-1又称成纤维细胞型，是人类主要的间质胶原酶，结缔组织细胞、肝内HSC肝细胞、枯否氏细胞均有分泌，分解底物为胶原蛋白（皿I II）。而MMP-13 是鼠类主要的间质胶原酶。MMP-取称中性粒细胞胶原酶，主要降解I型胶原。（2）明胶酶类（gelatinases）。包括MMP-2阴胶酶A）及MMP-9明胶酶B）。它们可降解明胶（变性胶原）和W、V和幻型胶原、层粘连蛋白、蛋白聚糖等。MMP-2和胶原酶类以相似的方式可以降解I, I,和皿型胶原，但其活性较MMP-1弱［8］。（3）基质分解素（strogylisin）。主要包括MMP-3 MMP-1（和MMP-11 仅有MMP-3在肝脏中存在。底物广泛，包括蛋白多糖、层粘蛋白、纤维连接蛋白、
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC） 一、凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。 柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。 图1 GPC分离原理 不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。 二、测定原理 凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各
种分子流体力学提及的不同进行分离的。比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。（见图2） 图2 GPC淋出曲线 溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。 凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。 三、分子量校正曲线（LogM-V曲线） 凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数
高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.
组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化
组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化【摘要】基质金属蛋口酶(matrix metalloproteinase> MMP)是体内 重要的水解酶之一，几乎能降解细胞外基质(extracellular raatrix> ECM)的所有成分;基质金属蛋口酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinasas^ TIMPs )是MMPs的内源性抑制系统。近年来发现，MMPs/TIMPs调节失衡与肝纤维化的关系密切，可从多方而影响肝纤维化的形成。通过干扰MMPs与TIMPs基因的表达，研究肝纤维化的发病机制和药物治疗是有希望的途径。 【关键词】MMPs ;TIMPs：肝纤维化 肝纤维化是许多慢性肝病的共同病理过程，是细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致在细胞间质的过度沉积［1-4］,肝组织结构改建。 许多细胞因子参与了这一过程，但是MMPs是最重要的一种［5］° MMPs 几乎能降解细胞外基质(ECM)的所有成分,而其天然抑制剂-基质金属 蛋口酶抑制剂(TIMPs)能与MMPs成员结合成复合物抑制其活性［6］。 二者的调节异常将引起ECM合成或降解的失衡，与各种器官纤维化疾病密切相关。研究发现，通过调节MMPs与TIMPs基因的表达来治疗肝纤维化是肝纤维化治疗的新途径。木文就MMPs/TIMPs与肝纤维化的关系及治疗前景作一综述。 1 MMPs分类、功能、结构及活性的调控 MMPs是一组基质金属蛋口酶。MMPs在肝内主要由肝星状细胞(HSC) 和Kupffer细胞表达分泌，参与细胞外基质降解的一类锌-钙离子依赖的内源性蛋口水解酶家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅 助因子而得名，是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，几乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，在生理病理过程中发挥着重要的作用。MMPs家族由24种成员组成，其中有23种存在于人体中。 L 1 MMPs可被分成六类［7］（1）胶原酶类。主要包括MMP-K
GE公司培训讲义—凝胶过滤层析技术
-pores filled with eluent 孔内充满洗脱液 -carefully controlled size range 孔径精密控制 -chemically /physically inert (lack of adsorptive properties) 1. Spherical particles packed into a column. 2. Sample applied. 3. Buffer (mobile phase) and sample move through column.Molecules diffuse in and out of matrix 4. Large molecules leave the column first followed by smaller molecules in Molecules larger than the pass straight through. Diffusion Buffer Diffusion into the pores Diffusion out of the pores Buffer
V o = void volume V R = retention volume or elution volume V t = total liquid volume of the bed V i = inner pore volume = V V c = total geometric volume of the column V = volume of gel matrix V o V t V c V R1V R2 V R3 V R4 V o V R volume c o n c e n t r a t i o n 非常大的分子在外水体积洗出, V o volume c o n c e n t r a t i o n V t V c V o V R V t = V 0+V i 柱床的几何体积K d
多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术
多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术 仪器组成： Wyatt DAWN HELEOS Ⅱ（十八角度激光光散射检测器） Wyatt ViscoStar Ⅱ(粘度检测器) Wyatt Optilab rEX （示差折光检测器） 配一套Waters 515单元泵和柱温箱。 检测原理： 光散射法是测定高分子物质重均分子量的绝对方法。高分子溶液可视为不均匀介质，当光通过它时，入射光的电磁波诱导高分子成为振荡偶极子，并产生强迫振动作为二次光源发出散射光。高分子溶液的散射光强度远远高于其溶剂，并且强烈依赖于高分子的分子量、链形态、溶液浓度、散射光角度和折光指数增量（dn/dc值）等基本参数，从而得到高分子物质的绝对分子量。 凝胶渗透色谱可将溶剂中的高分子物质按照分子量的大小依次洗脱出来。利用光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术，除了可以得到物质的平均分子量，还可以测得不同的高分子物质的分布及其相应分子量大小，并且不需要使用结构相似的标准样品做标准曲线。在直接测定
高分子物质的绝对分子量的同时，由于联用了粘度检测器和示差折光检测器，还可得到特性粘数、均方根旋转半径等重要参数。 应用： 光散射强度与分子大小直接相关，凝胶渗透色谱能分离不同分子量大小的高分子物质，结合次两种特性，可得到许多重要信息，已经被广泛应用于高分子化学、生物化学等众多研究领域。 第一，高分子物质的分子量的测定。不需要标准品、校正曲线以及任何假设，即可直接求得高聚物、多糖、蛋白质等多种高分子物质的绝对分子量。测定范围广泛，可达103～107，且采用十八角度激光光散射检测器，准确度高。 第二，多组分高分子物质的平均分子量及其相应组分对应的绝对分子量的测定。不仅可以单机操作测定混合物质的平均分子量，还可结合凝胶渗透色谱分离技术，测定各个分子量不同的各个不同组分的绝对分子量。 第三，高分子物质的折光指数增量（dn/dc值）、均方根旋转半径（Rg）、第二维里系数（A2）等重要参数和重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）等多种不同分子量的测定，可得到分子的分枝程度等形态特征，研究高分子物质与溶剂的相互作用，研究高分子物质的聚合与降解作用等。 具体检测工作： 第一，化学品、药品的合成过程中的质量控制，通过测定分子量的变化，控制反应的进程与方向，确定药品的含量品质。例如，以某一高聚物为母体，在其上进行聚合反应，通过分子量的测定，控制反应的进行程度。 第二，食品生产过程中的质量控制。通过测定分子量的变化，控制反应的进程与方向，确定食品的品质。例如，在高蛋白牛奶中的蛋白质的分子量，当蛋白质过大时是不利于人体吸收的，通过测定其分子量，对食品的品质进行鉴定。 第三，医疗器材材料的降解聚合作用的研究。例如，聚乳酸被广泛应用于心血管支架、假牙的医学材料中，在医疗器材申报的过程中要求对其降解作用进行研究。 标准： 1、GB/T 21864-2008 聚苯乙烯的平均分子量和分子量分布的检测标准方法高效体积排 阻色谱法 2、GB/T 21863-2008 凝胶渗透色谱法(GPC) 用四氢呋喃做淋洗液 3、SH/T 1759-2007 用凝胶渗透色谱法测定溶液聚合物分子量分布
肝癌中基质金属蛋白酶及其抑制因子的研究进展
怂鑫妻盏豁翳要）Ｅｄｉ，２０?ｏ，Ａ叭２９（２）：２，５—２均．２，５． ｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ［Ｐ］．２００４．［６４］ＣＵＩ Ｈ，ＣＵＩＹ．ＣＮｌｌ３４２３４一Ａ，ＣＮｌ０７３３６２一Ｃ：Ｔｅａｆｏｒｅ．ｇ． ［５７］ＭＡＢ．ＣＮｌ０１４７４３１１。Ａ：Ｓｏｆｔｃａｐｓｕｌｅｆｏｒｕｓｅａ８ａｎ ａｎｆｉｏｘｉ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｌｉｖｅｒａｎｄｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇｓｐｌｅｅｎ［Ｐ］．１９９８．ｄａｎｔｆｏｒａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇｅｙｅｓｔｒａｉｎ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓｓｏｆｔｃａｐｓｕｌｅｓｈｅｌｌ，［６５］ＰＡＮＧＹ．ＣＮｌｌ２４１０８－Ａ：Ｎｕｔｒｉｔｉｖｅｈｅａｌｔｈ．ｃａ弛ｓ锄ｓａｇｅ［Ｐ］．ｘａｎｔｈｉｎｉｎｍａｒｉｇｏｌｄｅｘｔｒａｃｔ，ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓｉｎｂｌｕｅｂｅｒｒｙ１９９７． ｅｘｔｒａｃｔ，ｂｅｔａ。ｃａｒｏｔｅｎｅ，ａｎｄｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅｉｎＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ６－［６６］ＢＡＲＴＯＮＢ，ＡＮＴＯＮＥＬＬＩＪ．ＵＳ２００７２６９５７６．Ａ１：ＮｕｔｒｉｔｉｏＩｌａｌ ｔｒａｃｔ［Ｐ］．２００９．ｆｒｕｉｔｄｒｉｎｋｆｏｒ ｕｓｅｉｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ．ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓａｒｌｄｍｅｄｉ． ［５８］ＸＩＡＰ，ＢＥＩＳ，ＦＥＮＧＹ．ＣＮｌ０７５８７８。Ａ：Ｎｕｔｒｉｔｉｏｕｓ ｌｉｑｕｉｄｃｉｎｅｆｉｅｌｄｓ，ｃｏｎｔａｉｎｓｆｒｕｉｔｉｕｉｃｅ，ｅ．ｇ．ｄｕｒｉａｎ。ａｎｄｓｉｌｖｅｒ ｆｏｒｅｙｅｓｉｇｈｔｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｓｏｆｃａｓｓｉａｓｅｅｄ，ｆｒｕｉｔｏｆｌｙｃｉｕｍ￥ｏｎｌ＇ｅｅ［Ｐ］．２００７． ｂａｒｂａｒｕｍ，ｍｕｌｂｅｒｒｙｆｌｏｗｅｒｈｅａｄ，ｖｉｔａｍｉｎＡ，ｖｉｔａｍｉｎＣｅｔｅ［６７］ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．ＤＥ２０２００８０１１７２１．Ｕ１：ｃ砌．［Ｐ］．１９９４．ｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｕｓｅｆｕｌｔｏｔｒｅａｔｃ帅ｃｅｒ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓａｍｉｘｔｕｒｅｏｆｅ】【－ ［５９］ＹＵＢ．ＣＮｌ０１０７７３７４一Ａ：ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｆｏｒｔｒａｃｔｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ ｅ．ｇ．Ｒａｄｉｘｇｉｎｓｅｎｇ．Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄ． ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇａｎｄｔｒｅａｔｉｎｇｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓｌｙｃｉ一哪，Ｃｏｒｄｙｅｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓｐｉｌｏｓｕｌａ，Ｌｙｃｉｕｍｂａｒ－ ｕｎｌｂａｒｂａｒｕｍｐｏｌｙｓａｃｅｈａｒｉｄｅ，ｇｉｎｓｅｎｇｐｏｗｄｅｒ，２‘ａｍｉｎｏｅｔｈ．ｂａｌ＇ｕｍ，ＬｉｇｕｓｔｒｕｍｌｕｃｉｄｕｍａｎｄＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｅａｃｉｄａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥ［Ｐ］．２００８．［Ｐ］．２００９． ［６０］ＭＡＪＥＷＳＫＩＧＰ，ＳＨＡＨＡＲ，ＧＯＲＭＬＥＹＪＬ，ｅｔａ１．［６８］帆ＬＧ．ＥＰｌ５３２８６８－Ａ１，ＤＥｌ０３５８３２８一Ａ１。ＥＰｌ５３２８６８．ＵＳ２００７１６６２６７’ＡＩ：ＣｏｓｍｅｔｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｆｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｆｉｎｅＢ１，ＤＥ５０２００４００９１２２?Ｇ：Ｐｌａｎｔｅｘｔｒａｃｔ．ａｓａｆｏｏｄｓｕｐｐｌｅ．１ｉｎｅｓａｎｄｗｒｉｎｋｌｅｓｉｎｆａｃｉａｌｓｋｉｎｂｙｉｍｐｒｏｖｉｎｇｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏ－ｍｅｎｔ，ｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｅｘｔｒａｃｔｓｏｆｗｏｌｆｂｅｒｒｉｅｓａｎｄｓｃｈｉｓａｎｄｒａｂｌａｓｔｍａｔｒｉｘ，ｃｏｎｔａｉｎｓａｃｙｌａｔｅｄｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅａｎｄＬｙｅｉｕｍｂａｒ－ｂｅｒｒｉｅｓｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｍａｇｎｏｌｉａｂｌｏｓｓｏｍ［Ｐ］．２００５． ｂａ／ｌｌｍｅｘｔｒａｃｔｉｎｃｏｓｍｅｔｉｃｖｅｈｉｃｌｅ［Ｐ］．２００７．［６９］ＳＯＫ，ＹＵＥＮｗ，ＣＨＡＮＧＲＣ，ｅｔａ１．ＵＳ２００５１９６４７８．Ａ１． ［６１］ＧＯＤＤＩＮＧＥＲＤ，ＫＲＵＥＧＥＲＭ．ＤＥｌ０２００８０１２０５９’Ａ１，Ｗ０２００５０８２３８７－Ａ２，ＤＥｌ １２００５０００３４５．Ｔ５，ＣＮｌ９５３７６１．Ａ：Ｗ０２００９１０９４２６‘Ａ１：Ｃｏｓｍｅｔｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｕｓｅｆｕｌｅ．ｇ．ｔｏＲｅｄｕｃｉｎｇｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓｄｅａｔｈｅ．ｇ．ｇｌａｕｃｏｍｉｎｖｏｌｖｅｓｔｒｅａｔｋｅｒａｔｉｎｆｉｂｅｒｓ，ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙｈｕｍａｎｈａｉｒｓ。ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ锄ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇａｇｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｗａｔｅｒｆｒｏｍｌｙｃｉｕｍｂａｒｂａｍｍｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍｆｒｕｉｔｓｏｆＬｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｍｎ，ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒ蛐ａｃｔｉｖｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ［Ｐ］．２００５． ａｇｅｎｔｅ．ｇ．ｎｏｎ。ｓｕｒｆａｃｅａｃｔｉｖｅｂｅｔａｉｎｅ，ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ，ａｎｄＣＯ－［７０］ＰｈｙｔｏｖｉｓｉｏｎｓＧｍｂｈ＆ＣｏＫＳ．ＤＥ２０２００４０１８００５一Ｕ１．ＤＥｌ０３ｅｎｚｙｍｅＱ１０［Ｐ］．２００９．５４６６７－Ａ１：ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｅｘｔｒａｃｔｓｏｆＬｙｃｉｕｍａｎｄ［６２］ＣＨＵＣ．ＣＮｌｌ２２７１２。Ａ：Ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇａｎｄｈｅａｌｔｈ－ｃａｒｅｍｅｄｉｃｉ．Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ，ｕｓｅｆｕｌｉｎｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，ｆｏｏｄｓａｎｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，ｎａｌｗｉｎｅ［Ｐ］．１９９７．ｈａｖｅａｎｔｉｓｔｒｅｓｓａｎｄａｎｔｉ．ａｇｅｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．１ａｃｋｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ［６３］ＷＡＮＧＤ．ＣＮｌ１０８０４７－Ａ，ＣＮｌ０３８３８３一Ｃ：Ｉｎｓｔａｎｔｎｏｏｄｌｅｓｈａｒｍｆｕｌ ｌｉｇｎａｎｓ ａｎｄｓｃｈｉｓａｎｄｒｉｎｓ［Ｐ］．２００５．ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｗｏｌｆ－ｂｅｒｒｙ［Ｐ１．１９９７． 肝癌中基质金属蛋白酶及其 抑制因子的研究进展 程桂丹１，陆枫林２ （１．东南大学临床医学院，江苏南京２１０００９；２．东南大学附属中大医院消化科，江苏南京２１０００９） ［摘要］基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）家族是降解细胞外基质的重要酶类，组织金属蛋白酶抑制因子（ＴＩＭＰ）是［收稿日期］２００９—０５—１８［修回日期］２００９?１Ｉ一１７ ［基金项目］江苏省自然科学基金资助项目（ＢＫ２００６１００） ［作者简介］程桂丹（１９８３一），女，湖北咸宁人，在读硕士研究生。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｇｄｋｌｚ２１９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｉｎ．ｃｎ ［通讯作者］陆枫林Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｆｅｎｇｌｉｎｍｙｔｕｔｏｒ＠１６３．ｃｏｍ
凝胶渗透色谱正确选择检测器的重要性
凝胶渗透色谱正确选择检测器的重要性 作者：Stephen Ball, 马尔文仪器纳米颗粒及分子表征产品市场经理 凝胶渗透色谱分析法或尺寸排除色谱法（GPC/SEC）是高分子、大分子和蛋白质常用的主要分析手段，其中最主要的原因是它能对分子量和分子量分布数据进行定量表征。人们通常将上述分析方法分 为两步。第一步：利用含有适当特性微孔填充材料的色谱柱对溶解样品按照分子大小/体积进行分离；第二步：利用适当的检测仪器对被分离的样品进行分析。本文中，来自马尔文仪器的产品市场经理Stephen Ball将向您阐述可以采用的检测器技术及其提高分析效率的潜在可能。 GPC/SEC系统的传统配置为：采用单个折光指数 (RI) 检测器对浓度进行测量，在这种配置下，利用 参照校准数据可以得到相对分子量分布数据。这对某些常见的高分子材料和/或质量控制比较适合， 但分析者越来越多地倾向于采用具有如下特点的多检测仪组合GPC/SEC 系统： ?无需色谱柱校准即可取得所有材料的绝对数据， ?极大提高数据处理效果 目前市面上有很多可用于GPC/SEC的检测仪。由于分析具有两阶段的特性，因此在选择合适的系统 时有很多问题需要考虑。完全一体化的单一检测器固然有优势，但我认为它与选择最佳检测仪组合解 决方案相比只能说是次优方案。对检测器的选择进行优化是一种既直接又高效的方法，具有较多优势，比如可以仅通过一次实验就获得能确定分子量、流体力学尺寸和分子结构的表征。 这就提出了一个问题：如何才能为以应用为基础发掘最佳的检测器系统？这个问题牵涉很广，但却为 我们初步了解不同检测器的优势提供了一个良好的契机。 首先从粘度计开始，它可以测量各种粘度参数，而对于聚合物溶液而言，它可以建立起与样品分子量 之间的关联。当与RI检测器一同使用时，粘度计可以实现普氏校准，系统无需再寻找与待测样品十 分接近的标准样品，同时也提高了分子量分布数据的完整性。粘度测量还可以确定结构方面的信息， 比如可以对聚合物分支进行定量分析。 接下来让我们来看看静态光散射检测器，它们可以对绝对分子量进行直接测量。由于市场上存在着各 种不同的检测仪，如LALS、RALS和 MALS，因此问题就开始变得复杂了。上述所有这些检测仪都 通过测量散射光的能量来得到分子量，但散射光能量随角度各不相同，比如，小角度光散射检测仪(LALS) 以7o的角度检测入射光线，直角光散射 (RALS) 以90o测量入射光线，此外还有多角度测量 光散射仪 (MALS)。
凝胶过滤层析分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 K av是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的K av=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的K av=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤K av﹤1，在中间位置被洗脱。可见，K av 的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因K av值不同而被分离。 三、仪器与试剂 1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 （1）标准蛋白 a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液