Luciferin solution荧光素底物
Luciferin solution
Citation information:
(HuaMin Chen et al., 2008a; H. Chen et al., 2008b)
Reagent: D-Luciferin sodium salt, Purifity>99%, MW=320.32
Solvent: ddH2O
Stock solution: 10mM store in -80℃
Preparation stock solution (10mM)
1.Weight appropriate D-luciferin sodium salt, count the volume of stock solution ( weight/320
* 103 /10 * 103 , for example 320mg, it can be prepared to 100mL 10mM D-luciferin sodium salt).
2.Sterilization by a 0.22 M filter.
3.Distribute the stock solution into 1.5ml/2.0ml centrifuge tubes.
4.Store at -80℃.
Working solution for spraying on leaves
10% Triton-100
1.dilute the stock solution 10 times, and add final concentration 0.1% Triton X-100(volume
ration), mix well(100ul 10mM stock solution, 10ul 10% Triton X-100, plus 890ul ddH2O).
2.spray the diluted working solution on plant leaves uniformly by a high pressure sprayer. Working solution in liquid system
For protoplast relative experiment, add stocking solution into protoplast buffer up to 1:200~1000(volume ratio), usually use the lowest concentration first.
Note:
Please keep in dark place at any time!
Stock solution and working solution can be stored -20℃for a month or 4℃for several days(may be the efficiency will decrease)
Chen H., Zou Y., Shang Y., Lin H., Wang Y., Cai R., . . ., Zhou J.M. (2008b) Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol, 146, 368-376.
Chen H., Pan J., Zhao X., Zhou J. & Cai R. (2008a) Reporter-based screen for Arabidopsis mutants compromised in nonhost resistance. Chinese Science Bulletin, 53, 1027-1034.
检测时先检测hLUC的荧光，然后加入淬灭剂同时激活hRLUC的荧光；
firefly Luciferase 可以催化Luciferin氧化成Oxyluciferin，在氧化过程中会发出生物荧光（bioluminescence），发光波长为560nm；
Renilla（海肾）Luciferase可以催化Coelenterazine氧化成Coelenteramide，氧化过程中也会发出生物荧光，波长为465nm；
所发出荧光可以通过荧光测定仪也称化学发光仪（luminometer）或液闪测定仪测定Luciferase催化的氧化过程中释放的生物荧光。
Reference information
D-luciferin sodium salt
Tested and Certified for in vivo imaging (See "Luciferin FAQ" in additional information)
Luciferin is a common bioluminescent reporter used for in vivo imaging of the expression of luciferase. This water soluble substrate for the Firefly luciferase enzyme utilizes ATP and Mg2+ as co-factors to emit a characteristic yellow-green emission in the presence of oxygen, which shifts to red light in vivo at 37°C. Through the utilization of ATP, the reaction can be further used to indicate the presence of energy or life in order to function as a life-death stain.
Luciferin is a common reagent used throughout the Biotechnology field and specifically for in
vivo imaging. Luciferase labeled tumor cells, stem cells, or infectious diseases are often inoculated into research animals such as rats or mice for investigation. The injection of Luciferin allows for the real-time, non-invasive monitoring of disease progression and/or drug efficacy in these model systems through Bioluminescence Imaging (BLI).
Luciferin is also commonly used for in vitro research; including luciferase and ATP assays, gene reporter assays, high throughput sequencing and various contamination assays.
Firefly Luciferin is identical to Beetle Luciferin. (See "Additional Information" for structures.)
Product Specifications:
D-Luciferin, Sodium Salt
4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt
MOLECULAR BIOLOGY GRADE (Premium Pure)
Formula: NaC11H7N2O3S2 · H2O
MW: 320.32 g/mol
Color: Light yellow powder
Purity: >99% pure (Quality verified by nine independent criteria including HPLC and FTIR.)
Storage/Handling: Store dessicated at -20°C. Protect from light.
PubChem Chemical ID: 23710675
荧光素钾盐或钠盐常见问题回答--美国Goldbio
1. 贵公司的荧光素可以用于动物活体实验吗？
答：可以！我们的许多客户用于动物活体实验。我们的荧光素作用于动物活体实验的文章已经达2000篇之多。Goldbio荧光素用于分析小鼠体内荧光素酶的例子请参看下面的图片：
2. 荧光素的纯度重要吗？
答：是的。Goldbio荧光素是99.7%到99.8%的纯度，是目前市场上可得到的最高纯度的荧光素。其它供应商认为98%的纯度是“足够的”，然而，这不足以满足严格的评估。比如，假如一个荧光素只有99%的纯度（产品中含有1%的污染物）。如果纯度不够的1g荧光素溶于缓冲液中（对于体外研究来说一个标准的稀释液），那么在缓冲液中将含有0.01g的污染物（即0.4g污染物/L）！如果按照分子量来计算那么在实验中将含有1000g/mol的污染物，那么在溶液中污染物的浓度将是400 uM，这个浓度将抑制某些酶和细胞中的生物过程，且可能会给实验结果带来偏差，并且可能会对您的动物造成伤害。
3. 甲壳虫荧光素与萤火虫荧光素之间有区别吗？
答：没有，甲壳虫荧光素与荧光虫荧光素之间没有区别。对于结构信息而言，请参看附加信息部分的“甲壳虫vs.萤火虫荧光素”。
4. 怎样溶解荧光素钾盐或钠盐？荧光素钾盐或钠盐的稳定性怎么样？
答：一些文献上描述和一些客户告诉我们，他们溶解荧光素钾盐或钠盐于水中，然后分成等份冻存于-80℃，没有有害影响。通常钾盐以60mg/ml的浓度溶解，然而钾盐的最高溶解度是100mg/ml（自由酸不溶于水，但以10mg/ml的浓度溶于甲醇，或以50mg/ml的浓度溶于DMSO）。但关于溶解后的荧光素的稳定性有一些冲突的报道，溶解之后可能会带入溶液中一些氧，如果储存的话最后用排空气体的水溶解荧光素钾盐或钠盐。
对于较敏感的实验，然而为了降低实验中的可变因素（比如，低浓度的酶或不太合适的温度或盐浓度可能需要较高浓度的底物来驱动反应的完成），我们建议反应所需的试剂最好现配再用。
5. 荧光素钾盐或钠盐之间有什么区别吗？
答：荧光素钾盐与钠盐之间在应用上无差别，在物理性质上有小的差别，比如钠盐形式的荧光素某种程度上颗粒性更强一些且比钾盐形式的更溶于水。根据文献引用的频率，钾盐形式的荧光素的使用次数是钠盐形式的3倍，且大部分研究者喜欢用钾盐形式作用于活体，但是两种盐形式的荧光素都能很好地起到同等作用。
6. 为什么在protocol里说荧光素钾盐或钠盐要溶于无Ca2+或Mg2+的PBS里？可以用其它的盐溶液溶解荧光素吗？
答：PBS或磷酸缓冲液，和Dulbecco’s磷酸缓冲液（DPBS）这些都是生物研究和细胞研究中最常用的缓冲液。PBS/DPBS是等渗缓冲液（也就是说，跟人体兼容）。这些缓冲液可维持稳定的pH7.2-7.6。PBS 和DPBS之间是没有区别的，尽管DPBS是不含钙或镁。钙和镁溶液可能抑制胰蛋白酶的活性。另外，Mg2+在荧光素到氧化荧光素的催化过程中是一个关键的成份（并且相似地Ca2+参与腔肠素的催化）。只要有阳离子存在的其它的盐溶液也可以用于溶解荧光素，不会干扰实验的结果或给实验靶标带来影响。
几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
常用指示剂配制方法
55 种指示剂的配制方法 1 、如何配制饱和溴水 在有磨口玻璃塞的瓶内，将市售溴约50g （约16mL）在2小时内注于1L 水中，时常剧烈振荡，每次摇动之后，微开瓶塞，使积聚的溴蒸气放出。在贮存瓶底要有过量的溴。将溴水倒入试剂瓶时，过量的溴应当留于贮存瓶中而不要倒出。倾倒溴和溴水时，应在通风橱中进行。在倾倒溴时，为了防止被溴蒸气烧伤，应以凡士林涂手或带医用橡胶手套。 2 、配制碘水试剂的方法 称取分析纯碘片6.5g ，放于小烧杯中，另外称取固体KI 18.5g ，并先把碘片溶解于少量酒精中，再加入 水到100 毫升，搅拌均匀即可。 3 、碘酒的配方 碘12 25 g、碘化钾KI 10 g、乙醇C2H5OH 500 mL ,最后加水至 1 000 mL。 配制时应先将KI 溶解于10 mL 水中，配成饱和溶液。再将碘I2 加入KI 溶液中，然后加入C2H5OH ，搅拌溶解后，添加蒸馏水至1000 mL，即成为常用的皮肤消毒剂。 4、①0.1（1g/L ）酚酞指示剂的配制方法 0.1 的酚酞指示剂是指100mL 溶液使用0.1g 的酚酞。配置方法：称
量0.1g 酚酞，然后用少量95%乙醇或者无水乙醇 0.1 100
100mL 0.5% （5g/L ）酚酞乙0.5g 酚酞,溶于乙醇， 稀释至100mL, 无需pH8.3 10.0 ）。] 说明》100 mL 滴定 液 1 2 强酸滴定弱碱（例如氨） 5 、如何配制石蕊指示剂 ①取1g 石蕊粉末溶于50mL 水中 中加30mL95% 乙醇100mL pH4.5 8.0 l00 mL 10g,醇40ml, 回流 煮沸1 小时，静置，倾去上 理2 次，每次30ml,水10ml 50ml 煮沸 pH4.5 8.0 6 、0.1%(1g/L) 甲基 橙 100mL
LS55操作说明书荧光-磷光-发光分光光度计中文培训手册
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 ２００３ 年４月
一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图
实验室常用指示剂的配制
实验室常用得指示剂配制 1 百里香酚蓝-酚酞混合指示液 取3份体积百里香酚蓝溶液(1g/L)与2份体积酚酞溶液(1g/L)混合均匀。 2 甲基红-亚甲基蓝混合指示液 将50mL甲基红溶液(2g/L)与50mL亚甲基蓝溶液(1g/L)混合。 3 酸性铬蓝K-萘酚绿B混合指示剂 称取0、1g酸性铬蓝K,0、1g萘酚绿B与20g干燥氯化钾,置于研钵中,充分研磨混匀,贮存于棕色广口瓶中。 4 溴百里(香)酚蓝-苯酚红混合指示液 0、08g溴百里酚蓝与0、1g苯酚红溶于20mL乙醇中,加水50mL,用氢氧化钠溶液(4g/L)调至pH为7、5(红紫色),再以水稀释至100mL。 5 溴甲酚绿-甲基橙混合指示液 6份体积溴甲酚绿溶液(1g/L)与1份体积甲基橙溶液(1g/L)混合。 6 溴甲酚绿-甲基红混合指示液 3份体积溴甲酚绿溶液(1g/L)与1份体积甲基红溶液(1g/L)混合,摇匀,贮存于棕色瓶中。 7 1,10-菲罗啉-硫酸亚铁铵混合指示液 称取1、6g1,10-菲罗啉及1g硫酸亚铁铵(或0、7g硫酸亚铁),溶于100mL 水中,贮存于棕色瓶中。 8 甲基红指示液(1g/L) 称取0、10g甲基红,溶于乙醇,用乙醇稀释至100mL。 9 溴甲酚绿指示液(2g/L)
称取0、20g溴甲酚绿溶解于6mL氢氧化钠溶液(4g/L)与5mL乙醇中,用水稀释至100mL。 10 甲基橙指示液(1g/L) 称取0、10g甲基橙,溶于70℃水中,冷却,用水稀释至100mL。 11 酚酞指示液(10g/L) 称取1、0g酚酞,溶于乙醇,用乙醇稀释至100mL。 12 溴(甲)酚蓝指示液(1g/L) 称取0、10g溴酚蓝,溶于乙醇,用乙醇稀释至100mL。 13 钙指示液(钙羧酸指示剂) 称取0、20g钙指示剂〔2-羟基-1-(2-羟基-4-磺酸-1-萘偶氮)-3-萘甲酸〕(C21H14N2O7S)或其钠盐与10g在105℃干燥得氯化钠,置于研钵中研细混匀。贮存于棕色磨口瓶中。 14 铬黑T指示剂 将1、0g铬黑T与100、0g干燥得氯化钠,置于研钵中,研细混匀。贮存于棕色磨口瓶中。 15 铬黑T指示液(5g/L) 称取0、50g铬黑T与4、5g氯化羟胺,溶于乙醇中,用乙醇稀释至100mL,贮存于棕色瓶中。可保持数月不变质。 16 百里香酚蓝指示液(1g/L) 溶解0、10g百里香酚蓝于2、2mL氢氧化钠溶液(4g/L)与5mL乙醇中,稀释至100mL。 17 孔雀绿指示液(1g/L)
异硫氰酸荧光素_牛血清白蛋白标记物的化学发光反应
异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光反应 黄春保 *1 慈云祥2 常文保21(黄冈师范学院化学系,黄州438000) 2(北京大学化学与分子工程学院,北京100871) 摘 要 采用反相流动注射法,系统地研究了碱性介质中和阳离子在表面活性剂C TM AB 存在下,N aClO 氧化 异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光行为和化学发光反应的条件,提出了反相流动注射化学发 光测定牛血清白蛋白的新方法。该法测定牛血清白蛋白线性范围为0.08~16mg P L;检出限为0.032mg P L 。讨 论了蛋白质标记物化学发光增强作用的原因。 关键词 异硫氰酸荧光素,牛血清白蛋白,化学发光反应,流动注射法 2001205217收稿;2001211226接受 1 引 言 蛋白质测定在临床医学和生命科学研究中具有重要意义。这方面的研究引起了人们的广泛重视。近年来,常见蛋白质测定方法的报道,其中大多是利用蛋白质与生色探针的结合作用,生成有色复合物后以分光光度法测定[1~3],少数是将蛋白质用卟吩、四环素等荧光探针标记后,用荧光光度法测定 [4,5],也见有蛋白质电分析方法的报道[6]。这些方法在临床检测和生化分析中具有一定的应用价值。 研究发现,在碱性条件下,选用某些氧化剂氧化异硫氰酸荧光素(FI TC),能产生化学发光,但强度很弱。若在碱性介质中,将异硫氰酸荧光素标记到蛋白质分子上,生成的蛋白质标记物则更易于氧化,不仅化学发光能力极大增强,而且发光强度与蛋白质的含量呈良好的线性关系。本文采用反相流动注射方法,研究了碱性介质中,次氯酸钠氧化异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白(B SA)标记物的化学发光行为、反应条件和阳离子表面活性剂的增敏作用,提出了反相流动注射化学发光测定牛血清白蛋白的新方法。体系的发光强度与B SA 的含量在0.08~16mg P L 范围内呈良好的线性关系;检测限为0.032mg P L 。由于采用反相流动注射进样方式,消除了样品背景干扰,故方法的灵敏度高,且稳定性好。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 GD 21型微光测量仪(西北有色地质研究所);LP 21型蠕动泵(北京东方仪器设备公司);自动平衡记录仪(上海大华仪表厂);821型pH 计(中山大学)。 BSA(A.R.,Sigma 公司)。FITC 溶液(1g P L):称取50mg FI TC(第三军医大学朝晖制药厂),用5mL 0.5mol P L 碳酸盐缓冲溶液和少量水使其溶解后转入50mL 容量瓶中定容。9.0@10 -2mol P L NaClO 溶液(pH=9.5):移取1.5mol P L NaClO 溶液,适当稀释,用HCl 调节溶液酸度至pH =915(酸度计测量),然后定容,该溶液在使用前配制。8.0@10-4mol P L C TM AB 溶液;0.5mol P L NaHCO 32Na 2CO 3缓冲溶液(pH= 9.5)。所用试剂均为分析纯,用二次蒸馏水配制溶液。 2.2 实验方法 2.2.1 FITC 2BSA 标记物的制备与分离 准确称取40mg B SA 置于比色管中,依次加入1.5mL 水,0.5mL 碳酸盐缓冲溶液,摇匀后缓慢滴加1mL FI TC 溶液,混合均匀后置于冰箱(4e )中反应12h 。用G 225色谱柱分离游离的FI TC 。收集FI TC 2BS A 标记物并定容20mL 。该液准确稀释250倍后用于化学发光体系的条件实验。 2.2.2 测定方法 采用反相流动注射法。测定装置流程和抽取试液速度、试液混合顺序如图1所示。NaClO 溶液通过旋转六通阀注入,每次注射体积为100L L 。试液在流动过程中混合,并立即流进发光仪第30卷 2002年4月 分析化学(FE NXI HUA X UE) 研究简报 Chinese Journal o f Analytical Chemistry 第4期 447~449
常见指示剂配置方法
8.1百里香酚蓝-酚酞混合指示液 取3份体积百里香酚蓝溶液(1g/L)和2份体积酚酞溶液(1g/L)混合均匀。 8.2甲基红-亚甲基蓝混合指示液 将50mL甲基红溶液(2g/L)和50mL亚甲基蓝溶液(1g/L)混合。 8.3酸性铬蓝K-萘酚绿B混合指示剂 称取0.1g酸性铬蓝K，0.1g萘酚绿B和20g干燥氯化钾，置于研钵中，充分研磨混匀，贮存于棕色广口瓶中。 8.4溴百里(香)酚蓝-苯酚红混合指示液 0.08g溴百里酚蓝和0.1g苯酚红溶于20mL乙醇中，加水50mL，用氢氧化钠溶液(4g/L)调至pH为7.5(红紫色)，再以水稀释至100mL。 8.5溴甲酚绿-甲基橙混合指示液 6份体积溴甲酚绿溶液(1g/L)和1份体积甲基橙溶液(1g/L)混合。 8.6溴甲酚绿-甲基红混合指示液 3份体积溴甲酚绿溶液(1g/L)与1份体积甲基红溶液(1g/L)混合，摇匀，贮存于棕色瓶中。 8.7 1，10-菲罗啉-硫酸亚铁铵混合指示液 称取1.6g1，10-菲罗啉及1g硫酸亚铁铵(或0.7g硫酸亚铁)，溶于100mL水中，贮存于棕色瓶中。 8.8甲基红指示液(1g/L) 称取0.10g甲基红，溶于乙醇，用乙醇稀释至100mL。 8.9溴甲酚绿指示液(2g/L) 称取0.20g溴甲酚绿溶解于6mL氢氧化钠溶液(4g/L)和5mL乙醇中，用水稀释至100mL。 8.10甲基橙指示液(1g/L) 称取0.10g甲基橙，溶于70℃水中，冷却，用水稀释至100mL。 8.11酚酞指示液(10g/L) 称取1.0g酚酞，溶于乙醇，用乙醇稀释至100mL。 8.12溴(甲)酚蓝指示液(1g/L) 称取0.10g溴酚蓝，溶于乙醇，用乙醇稀释至100mL。 8.13钙指示液(钙羧酸指示剂) 称取0.20g钙指示剂〔2-羟基-1-(2-羟基-4-磺酸-1-萘偶氮)-3-萘甲酸〕 (C21H14N2O7S)或其钠盐与10g在105℃干燥的氯化钠，置于研钵中研细混匀。贮存于棕色磨口瓶中。 8.14铬黑T指示剂 将1.0g铬黑T与100.0g干燥的氯化钠，置于研钵中，研细混匀。贮存于棕色磨口瓶中。 8.15铬黑T指示液(5g/L) 称取0.50g铬黑T和4.5g氯化羟胺，溶于乙醇中，用乙醇稀释至100mL，贮存于棕色瓶中。可保持数月不变质。 8.16百里香酚蓝指示液(1g/L) 溶解0.10g百里香酚蓝于2.2mL氢氧化钠溶液(4g/L)和5mL乙醇中，稀释至 100mL。 8.17孔雀绿指示液(1g/L) 称取0.10g孔雀绿，溶于水，稀释至100mL。
常用指示剂溶液的配制
常用指示剂溶液的配制 一、常用酸碱指示液和混合酸碱指示液 1．酸碱指示液 酸碱指示液一般用质量体积百分浓度表示，配制方法也比较简单，常用指示液法及变色范围列于表2-5 表2-5 常用酸碱指示液的配制及变色范围 2.混合酸碱指示液 酸碱混合指示液，一种是由两种或两种以上的指示液混合而成，利用颜色的互补作用，使变色更加敏锐，另一种是由一种指示液和一种惰性染料溶液混合而成，也是利用颜色的互补使变色更加敏锐，常用酸碱混合指示液的组成及颜色变化如下表2-6
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表2-6 常用酸碱混合指示液的组成及颜色变化 二、氧化还原滴定指示液 用于氧化还原滴定反应的指示液有以下几种。 1.氧化还原型指示液 这种指示液本身就是氧化剂或还原剂，它的氧化型和还原型颜色不同，因此，在等量点附近发生氧化还原反应，从而引起颜色改变，指示终点的到达，常用以下几种： (1)二苯胺磺酸钠(5 g/L) 要时过滤备用。用时现配。 (2)邻苯氨基苯甲酸（2g/L） 过滤，能保持几个月不分解。 (3)邻二氮菲亚铁（1g/L） 可保存一年。 2．专属指示液 专属指示剂是指在碘量法中使用的淀粉指示液。淀粉中的直链淀粉（可溶性）可以和 I 2生成蓝色配位化合物，而支链淀粉（不溶部分）与I 2 作用较弱，且生不易逆转的红紫色 配合物。所以，在配制指示液时，要用可溶性淀粉。淀粉指示液的浓度为5g/L，可按下法配制： 称取0.5g可溶性淀粉，于烧杯中，加10mL水调匀，徐徐倒人90mL沸水中，微沸2min，
F-27000荧光分光光度计使用操作步骤
F-2700荧光分光光度计操作规程 1、开机： （1）开启计算机 （2）开启仪器主机电源按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色为正常。 （3）双击桌面图标（FL Solutions 4.1 for F-7000），主机自行初始化，扫描界面自动进入 （4）初始化结束后，须预热15-20分钟，出现操作主界面（界面右下角出现Ready） 2、点击扫描界面右侧“Method” 在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（发射光谱/激发光谱） 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence (荧光测量) 设定波长扫描范围 扫描荧光激发光谱(Excitation)：需设定激发光的起始/终止波长（EX Start/End WL）和荧光发射波长（EM WL） 扫描荧光发射光谱(Emission)：需设定发射光的起始/终止波长（EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL） 其他选项可选择默认值（也可根据具体实验要求自行设定） 参数设置好后，点击“确定” 3、设置文件存储路径（此步也可不进行参数设置，可以在按5中方法进行保存） （1）点击扫描界面右侧“Sample” （2）样品名可自行命名 （3）选中“Auto File”，可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据（4）参数设置好后，点击“OK” 4、扫描测试 （1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子（请勿用力） （2）点击扫描界面右侧“Measure”，窗口在线出现扫描谱图 5、数据处理与保存 （1）选中自动弹出的数据窗口 （2）右键--“Trace”，进行读数并寻峰等操作 （3）“File”--“Save as”对数据进行保存 6、关机顺序： （1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000 （2）选中“Close the lamp，then close the monitor windows？”点击“Yes”窗口自动关闭同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色 （4）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热） （5）从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用 （6）关闭计算机
几种常用指示剂配置方法
常用指示剂配置方法 1. 1%酚酞 配制方法：称取1g酚酞，用100mL无水乙醇溶，变色范围pH8.3～10.0（无色→红）。2. 甲基红指示剂 用途：配制甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 配制方法：称取1g甲基红，用1000mL无水乙醇溶解 3. 0.1%溴甲酚绿 用途：配制甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 配制方法：称取1g溴甲酚绿，用1000mL无水乙醇溶解，变色范围pH3.6～5.2（黄→蓝）。 4. 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 用途：测蛋白质用指示剂 配制方法：临用时按0.1%甲基红：0.1%溴甲酚绿=1：5体积比混合而成 5. 淀粉指示液 配制方法：取可溶性淀粉0.5g，加水5ml搅匀后，缓缓倾入100ml沸水中，随加随搅拌，继续煮沸2分钟，放冷，倾取上层清液，即得。本液应临用新制。 6. 溴百里香酚蓝（溴麝香草酚蓝） 配制方法：0.10g溶于8.0ml 0.02mol/L氢氧化钠溶液中，稀释至250ml。黄6.0--7.6蓝7.甲基红－溴甲酚绿混合指示液取0.1％甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2％溴甲酚绿的乙醇溶液30ml，摇匀，即得。 8. 甲基橙指示液 配制方法：取甲基橙0.1g，加水100ml使溶解，即得。变色范围pH3.2～4.4（红→黄）。 9. 铬黑T指示剂 配制方法：取铬黑T 0.1g，加氯化钠10g，研磨均匀，即得。 10. 碘化钾淀粉指示液 配制方法：取碘化钾0.2g，加新制的淀粉指示液100ml使溶解 11. 1，10-菲罗啉-硫酸亚铁铵混合指示液 配制方法：称取1.6g1，10-菲罗啉及1g硫酸亚铁铵(或0.7g硫酸亚铁)，溶于100mL水中，贮存于棕色瓶中。
高等仪器分析实验-荧光分光光度计的使用
高等仪器分析实验(荧光分光光度计的使用) 实验目的 1．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步荧光光谱 2．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方法：?laman=1/(1/?ex-?H2O/107),其中波长单位为nm，?H2O为溶剂的红外吸收波长，单位为波数，溶剂为水时，主要的红外吸收是O-H伸缩振动，波长在3300波数。 狭缝的选择：激发和发射狭缝通常并不要求严格一致，为获得较好的灵敏度和准确反应谱峰形状，测定激发光谱时，选用较大的发射狭缝和较小的激发狭缝是比较好的。而测定发射光谱时则恰好相反。 灵敏度档的选择：灵敏度档与仪器中光电倍增管的放大倍数有关，对荧光比较弱的样品，应选择灵敏度较高的档位，反之亦反。但注意不同档位之间的荧光强度值没有确定的换算关系，不能相互比较。进行定量分析时，所有样品必须在同样的狭缝和灵敏度档位测量。 仪器及试剂 970MC荧光分光光度计 缓冲溶液：10-2mol/L Na2HPO4-NaOH缓冲溶液，pH=11-12 1-萘酚储备液：10?g/ml
常见指示剂与指示液的配制方法
指示剂与指示液 乙氧基黄叱精指示液取乙氧基黄叱精0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得。变色范围pH3.5～5.5（红→黄）。二甲基黄指示液取二甲基黄0.1g。加乙醇100ml使溶解，即得。变色范围pH2.9～4.0（红→黄）。 二甲基黄－亚甲蓝混合指示液取二甲基黄与亚甲蓝各15mg，加氯仿100ml,振摇使溶解（必要时微温），滤过，即得。 二甲基黄－溶剂蓝19混合指示液取二甲基黄与溶剂蓝19各15mg,加氯仿100ml使溶解，即得。 二甲酚橙指示液取二甲酚橙0.2g，加水100ml使溶解，即得。 二苯偕肼指示液取二苯偕肼1g，加乙醇100ml使溶解，即得。 儿茶酚紫指示液取儿茶酚紫0.1g，加水100ml使溶解，即得。变色范围pH6.0～7.0～9.0（黄→紫→紫红）。 中性红指示液取中性红0.5g，加水使溶解成100ml，滤过，即得。变色范围pH6.8～8.0（红→黄）。 孔雀绿指示液取孔雀绿0.3g，加冰醋酸100ml使溶解，即得。变色范围pH0.0～2.0（黄→绿）；11.0～13.5(绿→无色) 石蕊指示液取石蕊粉末10g,加乙醇40ml,回流煮沸1小时，静置，倾去上层清液，再用同一方法处理2次，每次用乙醇30ml,残渣用水10ml洗涤，倾去洗液，再加水50ml煮沸，放冷，滤过，即得。变色范围pH4.5～8.0（红→蓝）。 甲基红指示液取甲基红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液7.4ml使溶解，再加水稀释至200ml，即得。变色范围pH4.2～6.3（红→黄）。 甲基红－亚甲蓝混合指示液取0.1％甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2％亚甲蓝溶液8ml，摇匀，即得。 甲基红－溴甲酚绿混合指示液取0.1％甲基红的乙醇溶液20ml，加0.2％溴甲酚绿的乙醇溶液30ml，摇匀，即得。 甲基橙指示液取甲基橙0.1g，加水100ml使溶解，即得。变色范围pH3.2～4.4（红→黄）。 甲基橙－二甲苯蓝FF混合指示液取甲基橙与二甲苯蓝FF各0.1g,加乙醇100ml使溶解，即得。 甲基橙－亚甲蓝混合指示液取甲基橙指示液20ml,加0.2％亚甲蓝溶液8ml,摇匀，即得。 甲酚红指示液取甲酚红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液5.3ml使溶解，再加水稀释至100ml，即得。变色范围pH7.2～8.8（黄→红）。
主要荧光素一览表
（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。
荧光分光光度计- 原理
分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能
常用指示剂配制方法
55种指示剂的配制方法 1、如何配制饱和溴水 在有磨口玻璃塞的瓶内，将市售溴约50g （约16mL）在2小时内注于1L 水中，时常剧烈振荡，每次摇动之后，微开瓶塞，使积聚的溴蒸气放出。在贮存瓶底要有过量的溴。将溴水倒入试剂瓶时，过量的溴应当留于贮存瓶中而不要倒出。倾倒溴和溴水时，应在通风橱中进行。在倾倒溴时，为了防止被溴蒸气烧伤，应以凡士林涂手或带医用橡胶手套。 2 、配制碘水试剂的方法 称取分析纯碘片6.5g ，放于小烧杯中，另外称取固体KI 18.5g，并先把碘片溶解于少量酒精中，再加入 水到100毫升，搅拌均匀即可。 3 、碘酒的配方 碘I2 25 g、碘化钾KI 10 g、乙醇C2H5OH 500 mL，最后加水至1 000 mL。 配制时应先将KI溶解于10 mL水中，配成饱和溶液。再将碘I2加入KI溶液中，然后加入C2H5OH，搅拌溶解后，添加蒸馏水至1000 mL，即成为常用的皮肤消毒剂。 4 、①0.1（1g/L）酚酞指示剂的配制方法 0.1 的酚酞指示剂是指100mL溶液使用0.1g 的酚酞。 配置方法：称量0.1g 酚酞，然后用少量95%乙醇或者无水乙醇
溶解，定量转移至100mL容量瓶后再用乙醇定容稀释到100mL 即可。 ②0.5% （5g/L）酚酞乙醇溶液：取0.5g 酚酞,溶于乙醇，用乙醇稀释至100mL,无需加水。变色范围pH8.3～10.0（无色→红）。] 《说明》100 mL滴定液加1～2滴。本指示液对酸敏感，例如，对碳酸变色，可用来检查是否含碳酸气。适用于强碱滴定无机酸、有机弱酸，也适用于乙醇溶液的滴定。强酸滴定弱碱(例如氨)不适合。硅酸和铝存在，对本溶液变色无妨碍。与浓碱接触红色消失。 5 、如何配制石蕊指示剂 配制方法：①取1g 石蕊粉末溶于50mL水中，静置一昼夜后过滤。在滤液中加30mL95%乙醇，再加水稀释至100mL。变色范围pH4.5～8.0（红→蓝）。 ②1 g溶于微碱性水溶液，然后加微酸性水溶液至l00 mL，呈紫色保存。 ③取石蕊粉末10g,加乙醇40ml,回流煮沸1小时，静置，倾去上层清液，再用同一方法处理2次，每次用乙醇30ml,残渣用水10ml 洗涤，倾去洗液，再加水50ml煮沸，放冷，滤过，即得。变色范围pH4.5～8.0（红→蓝）。 6 、0.1%(1g/L)甲基橙的配制 称取0.1克甲基橙加蒸馏水100毫升，热溶解，冷却后过滤备用。
常见荧光素
常见荧光素： （1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 （6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。 （7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA
化学常用指示剂的配制
化学常用指示剂的配制 1. 石蕊溶液 方法一将1g石蕊溶入50mL水中，静置一昼夜后过滤，在滤液中加入30mL 95%的乙醇，再加水稀释至1000 mL即可。 方法二将5~10g石蕊加入100mL85%的乙醇中，在水浴上加热，并搅拌，倾去溶液以除去其中的有色杂质。将残渣用1L热水浸煮，并不断搅拌，滤去不溶物，便得石蕊溶液。 用蒸馏水配制的石蕊溶液滴入酸性溶液中，呈明显的红色。但滴入中性溶液和碱性溶液时，两者的区别往往不明显，都有一定程度的蓝中略带紫色，改进的方法是：用蒸馏水配制好以后，用滴管取1·L－1的乙酸溶液，逐滴加入锥形瓶中，并不断振荡，严格控制乙酸的用量，并随时从锥形瓶中用滴管取出数滴溶液分别加入酸性氯化铵溶液、中性蒸馏水和碱性碳酸钠溶液中，至分别呈红、紫、蓝三色且清晰可辨为宜。 如不小心调节过头，可用1mol·L－1氨水反调。 经过调节的紫色石蕊溶液对一般酸碱溶液反应敏感，对盐类水解所呈现的酸碱性也反应明显。 2. 酚酞溶液 将1g酚酞溶液溶于1L60%～90%的乙醇中即得。或者取医药用的无色酚酞片(又名“果乐比”，是一种轻泻剂)两粒，放入约50mL的乙醇中溶解，过滤即得酚酞溶液。 3. 甲基橙溶液 取甲基橙1g，加蒸馏水1L，溶解过滤即得。 4. 品红溶液 品红是一种人工合成的红色染料，成分是盐酸蔷薇苯胺。配制时可将0.1品红溶于100水中即可。 5. 淀粉溶液 将1g可溶性淀粉加少量水调成糊状，倾入100mL沸水中，煮沸片刻，即得1%的淀粉溶液不可久藏，因为久置后，检查碘分子时其颜色不是天蓝色而是蓝紫色，甚至不起作用。若加入少量(约1g)氯化锌或碘化汞作防腐剂，可放置较久。 6. 淀粉碘化钾溶液 将0.5g淀粉加水1mL，在试管中加以振荡调成浆状，然后倒入100mL沸水，维持煮沸1～2min，冷却后，将0.5g碘化钾及0.5g结晶碳酸钠溶于少量水，加入此试管中，振荡得无色溶液。该溶液要临时配制，不能久藏。 7. 甲基红溶液 将1甲基红溶于1 60%的乙醇中即可。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
各种指示剂配制方法
各种指示剂配制方法 1乙氧基黄叱精指示液取乙氧基黄叱精，加乙醇100ml使溶解，即得。变色范围～（红→黄）。二甲基黄指示液取二甲基黄。加乙醇100ml使溶解，即得。变色范围～（红→黄）。 2二甲基黄－亚甲蓝混合指示液取二甲基黄与亚甲蓝各15mg，加氯仿100ml,振摇使溶解（必要时微温），滤过，即得。 3二甲基黄－溶剂蓝19混合指示液取二甲基黄与溶剂蓝19各15mg,加氯仿100ml使溶解，即得。 4二甲酚橙指示液取二甲酚橙，加水100ml使溶解，即得。 5二苯偕肼指示液取二苯偕肼1g，加乙醇100ml使溶解，即得。 6儿茶酚紫指示液取儿茶酚紫，加水100ml使溶解，即得。变色范围～～（黄→紫→紫红）。 7中性红指示液取中性红，加水使溶解成100ml，滤过，即得。变色范围～（红→黄）。 8孔雀绿指示液取孔雀绿，加冰醋酸100ml使溶解，即得。变色范围～（黄→绿）；～(绿→无色) 9石蕊指示液取石蕊粉末10g,加乙醇40ml,回流煮沸1小时，静置，倾去上层清液，再用同一方法处理2次，每次用乙醇30ml,残渣用水10ml洗涤，倾去洗液，再加水50ml煮沸，放冷，滤过，即得。变色范围～（红→蓝）。 10甲基红指示液取甲基红，加L氢氧化钠溶液使溶解，再加水稀释至200ml，即得。变色范围～（红→黄）。 11甲基红－亚甲蓝混合指示液取％甲基红的乙醇溶液20ml，加％亚甲蓝溶液8ml，摇匀，即得。
12甲基红－溴甲酚绿混合指示液取％甲基红的乙醇溶液20ml，加％溴甲酚绿的乙醇溶液30ml，摇匀，即得。 13甲基橙指示液取甲基橙，加水100ml使溶解，即得。变色范围～（红→黄）。 14甲基橙－二甲苯蓝FF混合指示液取甲基橙与二甲苯蓝FF各,加乙醇100ml使溶解，即得。 15甲基橙－亚甲蓝混合指示液取甲基橙指示液20ml,加％亚甲蓝溶液8ml,摇匀，即得。 16甲酚红指示液取甲酚红，加L氢氧化钠溶液使溶解，再加水稀释至100ml，即得。变色范围～（黄→红）。 17甲酚红－麝香草酚蓝混合指示液取甲酚红指示液1份与％麝香草酚蓝溶液3份,混合，即得。 18四溴酚酞乙酯钾指示液取四溴酚酞乙酯钾，加冰醋酸100ml,使溶解，即得。对硝基酚指示液取对硝基酚，加水100ml使溶解，即得。 19刚果红指示液取刚果红,加10％乙醇100ml使溶解，即得。变色范围～（蓝→红）。 20苏丹Ⅳ指示液取苏丹Ⅳ,加氯仿100ml使溶解，即得。 21含锌碘化钾淀粉指示液取水100ml,加碘化钾溶液(3→20)5ml与氯化锌溶液(1→5)10ml，煮沸，加淀粉混悬液（取可溶性淀粉5g，加水30ml搅匀制成），随加随搅拌，继续煮沸2分钟，放冷，即得。本液应在凉处密闭保存。 22邻二氮菲指示液取硫酸亚铁,加水100ml使溶解，加硫酸2滴与邻二氮菲,摇匀，即得。本液应临用新制。