中草药和天然药物有效成分纯化工艺开拓

GE Healthcare BioSciences
中草药和天然药物 有效成分 纯化工艺开拓
中药产业 植化产业
中国地大物博,天然资源丰富,文化历史悠久。 中医药经历数千年实践,是我国宝贵的知识财富。 中国加入WTO,给中草药走向国际化带来良好的契 机,同时亦将面对更大的竞争。 中药研究急待加以继承、发展以实现中药现代化 ,提高我国在中草药、天然药物方面的国际竞争力 。 随着人类基因图谱的完成,中草药的研究更与基 因组、蛋白质组、代谢物组研究结合,可望研制出 新一代防治疾病的药物,造福于人类社会。



《中药现代化发展纲要》2002
为中药现代化提出了具体目标: ? 在2010年开发出100个中药新产品, ? 完成100个传统中成药的二次开发, ? 完成现有国家中成药标准品种整理; ? 扩大高附加值、高科技含量中药品的出口, ? 争取2-3个中药品种进入国际医药主流市场
剂 场 2003 ( 场 额: US$ 51 )
18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0
4.5
2.5 5.6
7.9 6.9
1.1 1.6 5.1 Asia
1.4 3.5 2.3 Japan
in retail prices
0.3 0.8 0.6 S. America 0.6 1.2 0.8 RoW
3.9 N. America
Europe
草药
维他命
体育专用
?Phytopharm
Source: PhytoPharm Consulting, NBJ, EuroConsult, WBP
Hong Kong Aug. 2004 Consulting/analyze & realize ag

产 级 (欧 ) Evidence Based Approach
New Products Serious Diseases
A B C T X
$$$
Major Claims Minor Claims
Traditional Medicinal Products
Fraudolent Claims
Traditionally Used for …
?Phytopharm
Hong Kong Aug. 2004 Consulting/analyze & realize ag
生命科学发展趋势 +
Genomics 基因组学
+
Proteomics 蛋白质组学
+
Metabolomics 代谢产物组学
Transcriptomics
生命科学知识, 药物开发
疾病基因, 药物靶点, 代谢调控
中草药有效成分研究、制剂工艺改进、药效物质基础、 作用机制研究、质量控制

中药现代化进程
中药现代化进程是全方位的 发展和创新 中药研究重要的一环是有效成分的 提取分离、结构鉴定、药性研究 中药新品的研制开发经常面临 有效成分的含量问题 开拓有效成分的分离纯化工艺已经是 中药生产、研究单位发展的重点
中药活性成分的复杂性
Alkaloid 生物碱 Organic acid 有机酸 Flavone 黄酮、Quinone 醌 Glycoside 甙 (e.g. saponin) Polyphenol 多酚 Coumarin 香豆素 Steroids, Terpene 内脂、萜 Polysaccharides 多糖 Protein, lectin, toxins 蛋白、凝集素、毒素
中药的化学成分极其复杂,决定了分离纯化方法的多样性
灵活及综合性地利用各种纯化技术 才有可能分离纯化出大部分单一中药活性成分。

TCM 层析方法
正相硅胶 反相硅胶 大孔树脂 聚酰胺
优点、常用范围
局限性
常用于植化研究,经济。常压 不可逆吸附, 只用 操作,加压可提高效率 一次或数次 常用于检测、少量制备;有C4, 昂贵、放大困难 C8,C18多种选择,分辨率高。 常用于组分的粗提,流速快, 选择性少,验证文 经济,吸附少。 件不健全 多用于提取和纯化黄酮、内脂 流速慢,验证文件 类成分,经济。 不健全
葡聚糖凝胶 常用于单体纯化,特别适合含 流速慢。比硅胶更 (Sephadex LH20) 羟基OH 的甙类、黄酮、多酚 适合亲水物质,与 、单宁等。可使用很多次。 硅胶为互补技术 离子交换层析 HSCCC 高速逆流色谱 适合含生物碱、有机酸等的分 受限制于代电荷的 离。有些也适合甙类纯化 物质 回收率高, 分辨率高,溶剂消 放大困难 耗较少。
综合性地利用各种纯化技术,分离中药单一活性成分
?KTA - 完整的纯化技术解决方案
实验室 研究 开发 中试生产 大规模生产 ?KTAbasic
10 ml, 25 MPa
?KTApurifier 10 ml, 25MPa
?KTAexplorer/?KTApilot 100ml, 800ml, 4-10MPa
BioProcess systems UNICORN 统一平台 实验室 到 生产

编程只需三步,立即上手
1. 选层析方法 2. 选模板程序 3. 选层析柱
OK !
连续99次条件摸索全自动化
选介质 选溶剂系统 选梯度模式 选流速 选上样量 选。。。。

实验室到生产,完整的硬件支持系统
种类最多的厂家 层析介质:数百种层析填料 层 析 柱: 直径4.6~2000mm 色 谱 仪: ng~Kg的制备产量 色谱软件:Unicorn 色谱平台 (从实验室到生产) 类型规格最全的厂家 高中低压,大中小型 通过FDA认证
唯一具此完全规模的制备色谱供应商
Sepharose High Performance 离子交换层析
高选择性层析 分辨率高 载量大 工艺控制可自动化 放大容易 具有显著的浓缩效果,适合于初步纯化 阳离子交换 SP Sepharose HP
可以直接从中药的稀酸 浸提液中捕捉生物碱 成功的案例
阴离子交换 Q Sepharose HP
可以直接从中药的稀碱浸提液中捕捉 皂甙、黄酮甙、有机酸、单宁类等 成功的案例
从粉防己中分离粉防己碱 从黄连中分离盐酸小檗碱 从马钱子中分离马钱子碱 从苦参中分离苦参碱、 槐定碱和氧化苦参碱 从虫草中分离虫草素
从柴胡中分离柴胡皂甙C 从大黄中分离大黄素 从紫草中分离紫草素 从葛根中分离葛根素 从三七中分离三七素 以及甘草酸、阿魏酸、咖啡 酸、阿魏酸等的分离。

H 2C
Alkaloids生物碱
H N H N H O
H HO H 3C H O N
By SP Sepharose HP
N
O
奎宁
士的宁
咖啡因
CH3
CH3
OH NH
O O N
+
Cl
O
CH3 CH3
小檗碱
CH3 N
O
喜树碱 Camptothecin
普鲁卡因
麻黄碱
阿托品
O O OH
CH3 O NH
CH3 N
哈尔明碱
吗啡 Morphine 虫草素 Cordycepin
AKTA 探索SP、Q Sepharose HP 离子交换纯化工艺 自动配液系统 Automated BufferPrep
Pump A 50% Flow 原液 酸 盐 Pump B 50% Flow 水
?KTAexplorer
pH调节
梯度调节
只需换原液,其余不变,可包含pH 2-11广阔的范围

SP Sepharose HP 阳离子交换纯化生物碱
SP HP04:1_UV1_210nm mAU SP HP04:1_UV2_280nm SP HP04:1_UV3_260nm SP HP04:1_Conc SP HP04:1_Inject
H
3500
N H N H O
Column: HiTrap Sepharose SP HP Sample: atropine,procaine,quinine,strychnine,caffeine, 10mg/ml
3000
咖啡因
2500
CH 3 N
O
士的宁
O O OH
Buffer A: 20%ethanol pH1.5; Buffer B: A+1MNaCl Gradient: 0-5%10CV; 15%-30%20CV Flowrate: 1ml/min
2000
H2C
阿托品
1500
H HO
1000
N H
普鲁卡因
H 3C
O N
500
奎宁
0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 ml
SP Sepharose HP 阳离子交换纯化生物碱 - pH 探索
Caffeine
3500
Strychine
Quinine
3000
Atropine
2500
A: 50mM Phosphate B: A + 1M NaCl
Sample (MW): Caffeine(194.2), Atropine(289.4), Strychnine(334.4), Procaine(272.8), Quinine(324.4)
2000
1500
1000
500
0 0.0 5.0 10.0 15.0 ml
3500
3000
2500
2000
1500
Column: HiTrap Sr SP HP Above: pH 2.9 Below: pH 4.8
1000
500
0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
ml

SP Sepharose HP 阳离子交换纯化生物碱 - 从1mg 到 100g 工艺放大
目标生物碱
AKTA100系统:从 1ml HiTrap SP 柱到5L BPG300柱
Q Sepharose HP 阴离子交换纯化生物酸
三七素
mA U
200 0
150 0
100 0
香草酸
原儿茶酸 阿魏酸 咖啡酸
50
0 0. 5. 10. 15. 20. m

Glycoside 甙
甘草酸 Glycyrrhizic acid
Rutin 芦丁
橙皮甙 (base)
黄芩甙 Baicalin 芦荟甙 苦杏仁甙 Amygdalin
齐墩果酸 Oleanolic acid
葛根素 Puerarin
Q Sr HP 阴离子交换纯化甙类、去除植物色素
U V 1 _2 30 nm mAU 2 50 0 U V 2_ 2 15 nm C on d C on c
A :2 5 m M ? ? ? , 0
B :1 M N a C L P H = 1 1 ? ?
S a m p le
2 4
5
2 00 0
柴胡皂甙C Saikosaponin C
3 1
1 50 0
1 00 0
5 00
0
0. 0
5. 0
10 .0
15 .0
2 0 .0
ml
U V 2 _2 54 nm m A U
C on d
C on c
pH
I n j e ct
S t a n d + S a m p le
2 50 0
橙皮甙 Hesperidin
H e s p e r id in
2 00 0
1 50 0
1 00 0
5 00
0 0. 0 5 .0 1 0 .0 1 5.0 2 0 .0 m l
U V 1 _2 30 nm mAU
U V 2_ 2 20 nm
C on d
C on c
pH
In je ct
S am p leF l ow
A :2 5m M ? ? ?
pH = 11 .00
5
B :1M N a c l p H = 1 1.0 0 S hiko n in Q H P 0 20 6 14 0 01 6? 11 ? ? , 6 ? 14 ? ? ? ( ? ? ) ?
6 00
紫草素 Shikonin
1


5 00
4 00
3 00
4 3
2 00
2
S hiko nin
1 00
Q Sepharose HP 有效去除样品色素
1 5. 0 ml
0 0. 0 5.0 10 .0

Sephadex? LH-20 and Sephadex? LH-60
? 吸附层析 ? 分配色谱 ? 分子筛 德国著名植化学家Prof. Hans Henke著有《Sephadex LH-20制 备凝胶色谱分离》专著 18-1113-89
Sephadex? LH-20 可用各种溶剂系统
注:梯度溶剂系统更有利于增加载量和分辨率

Flavonoid 黄酮 by Sephadex LH20
槲皮素 Quercetin
山奈酚 Kaempferol
橙皮素 Hesperetin
乌药碱 by Sephadex LH20

贝母素 by Sxphadex LH20
正相层析应用 NPC(Normal Phase Chromatography)
硅胶Silica正相层析 是植物化学和中药化学的 主流技术 应用广泛 最经典的分离纯化技术 正相层析 hydrophilic stationary phase 固定相:亲水 nonpolar/polar mobile phase 流动相:非极性/极性 (organic solvents only 有机溶剂/有机溶剂)

反相层析应用 RPC
聚苯乙烯为基架的中压反相介质 5, 15, 30 um Source RPC 具极强的化学稳定性,兼容pH 1-14 中压反相层析 使用寿命长,可用1M NaOH在位清洗 疏水性和 C18 相当 高流速低反压,容易自行装填、放大
成功的案例 合成肽、重组肽 Kromasil 高压 硅胶反相层析
适合极高精度精细纯化 3.5, 5, 7, 10, 13, 16 um 分辨率、寿命、载量为同类产品中 最高。配合Dan Process HPLC系统 和柱发挥最佳纯化效果 成功的案例 紫杉醇、胰岛素、合成肽
中草药成分纯化工艺平台建议
(例子粉防己碱、虫草素) 阳离子交换SP SrHP+ 反相中、高压 有机酸纯化平台 (例子三七素、迭迷香酸 ) 阴离子交换Q SrHP +Sephadex LH-20 黄酮、黄酮甙纯化平台 (例子红花素、葛根素) Q SrHP去色素+ Silica、Sephadex LH-20 皂甙纯化平台: (例子柴胡皂甙) 阴离子交换Q SrHP + Silica反相 多酚纯化平台 (例子茶多酚、白藜芦醇) Silica正相+ Sephadex LH-20 动物小分子毒素纯化平台 (例子河豚鱼毒素) 阳离子交换SP SrHP +中压反相 萜类纯化平台 (例子紫杉醇) Silica正相中、高压
生物碱纯化平台

生物碱建议纯化平台
阳离子交换 SP SrHP +
mAU
mAU 300
反相中、高压 虫草素 >95%
1500
250
1000
200
500
150
100
0
50
-500 0.0 5.0 10.0 15.0 ml
0
mAU
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
cv
mAU
SrSPHP XK16/14
4000
2500
Source 15RPC HR10/30
粉防己碱 >98%
2000
3000
1500
2000
1000
1000
500
0
0 0 100 200 300 400 500
0
ml
50
100
150
200
ml
梁旭清等,粉防己碱纯化工艺研究
中国新医药 2003 年第 2 卷第 5 期
12-15 页
皂甙建议纯化平台
阴离子交换 Q SrHP
U V1_230 nm mA U 250 0 UV 2_ 215 nm Cond Con c

U V1_2 30nm mA U 1 20 1 00
反相中、高压
Con d Con c pH
A:25mM? ? ? , B:1MNaCL PH=11 ? ? 0
S ample
2 4
5
3
200 0
Peck 1
1
150 0
80
60
100 0
40
5 00
20
柴胡皂甙C
0.0 5.0 10 .0 15.0 20.0 2 5. 0 30 .0 3 5.0 ml
0
0
0. 0
5. 0
10.0
15 .0
20 .0
ml
U
300 0
15 00
250 0
10 00
200 0
5 00
150 0
100 0
0
甘草酸
0 .0 2.0 4 .0 6.0 8. 0 1 0.0 12 .0
500
-50 0
0
A 1
A 2
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
C 8
W ast

有机酸建议纯化平台
阴离子交换 Q SrHP + Sephadex LH-20
三七素
迭迷香酸
(Rosmarinic Acid) 用Sephadex LH-20 一步纯化就可将3%的迭迷香酸纯化至66%
黄酮、黄酮甙建议纯化平台
阴离子交换 Q SrHP去色素+硅胶、Sephadex LH-20
5
0. 0
10.0
20.0
30.0
40. 0
50.0
0
20
40
60
80
ml
葛根素
60.0
ml
红花素
大豆异黄酮

多酚建议纯化平台
Sephadex LH-20 + 硅胶正反相中、高压
茶多酚
白藜芦醇
动物小分子毒素纯化平台
阳离子交换SP SrHP +中压反相SOURCE RPC
工艺开发过程: 仪器:AKTAexplorer 100 研究:Resource 15RPC 小试:HR 10/30 Column 中试:FineLINE 35 Polit Column
河豚鱼毒素

萜类纯化平台
正相硅胶中压、反相高压
系统: BioProcess MPLC 10mm 层析柱: FineLINE 350 介质: 正相硅胶 样品: 50% purity 纯度: >99%
Polysaccharides 多糖
- 溶于水,需分子量相近的去除水溶性大分子 -Sevag 去除蛋白 (致敏源)需重复十多次,烦琐、无法放大 -多糖过Q, SP Sepharose FF 可有效去除蛋白、核酸 - 折光检测;有磷酸基可用UV 206nm检测
Sephadex G-200
-传统介质: Sephadex G50,100,150,200 -新一代介质: Superdex 200, Sephacryl 300,400,500 分辩率大大 提高,流速快5倍以上
600 min
Superdex 200 prep grade
80 min

Polysaccharides 多糖
层析纯化凝胶
Sx G100 Sx G150 Sx G150 Sx G100 DEAE Sx25A,SxG100 SephadexG-100 SrCL6B,ConA-Sr DEAE-Sephadex A-50 SephadexG-100 DEAE-SephadexA-50,Se SephadexG-100 SephadexG-25,DEAE-Sp SephadexG-200 SephadexG-50,Sephadex SephadexG-75
多糖
中药材
功效
GL-2
(
分子筛纯化芦荟多糖 、灵芝多糖
芦荟多糖
灵芝多糖
基因组学
蛋白质组学

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