基因工程期末复习总结

一、单选

1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。

2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。

3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。

4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。

5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。

6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。

7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。

8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。

9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。

10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。

11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0

或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

13、

14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。例如：B acillus am ylolique faciens H、

H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind

15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。

17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。

18、承载外源DNA的大小排序：质粒（<20kb）<噬菌体（20-30kb）

19、受体细胞的种类:1）原核生物细胞例：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；蓝细菌；2）真核生物细胞包含酵母细胞、植物细胞、动物细胞。

19、常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类，非放射性探针包括生物素标记探针、地高辛标记探针、荧光素标记探针。

20、根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交（DNA）和Nothern印迹杂交（RNA）四类。（PS:如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测。

菌落（或噬菌斑）原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到用于杂交的膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用DNA探针与其杂交。）

21、重组子筛选的方法：1）遗传表型直接筛选2）依赖于重组子结构特征分析筛选3）核酸分子杂交分析4）免疫化学分析检测5）PCR 筛选法。

22、重组基因导入受体细胞的方法：Ca2+（诱导大肠杆菌）转化法、电激穿孔、基因枪法、显微注射法、病毒转染法

二、名词解释

1、多克隆位点（MCS）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段人工DNA序列。

2、衔接头：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。

3、限制性内切核酸酶：识别双链DNA中特定的核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的一类酶，简称限制酶。

4、回文序列：DNA 片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。

5、同裂酶：识别相同序列的限制性内切酶称为同裂酶。它们的切割位点可能不同

6、同尾酶：切割不同的DNA片段，但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。

7、星性活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，又称Star活性。

8、克隆载体：一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得以维持或表达的DNA分子。

9、（质粒的）不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

10、显性质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移相关的基因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的质粒。

11、隐蔽质粒：不能使宿主细胞呈现新性状的质粒。

12、基因组文库：指贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌群体。

13、cDNA 基因文库：某种生物材料的基因转录产物mRNA经反转录形成不同的cDNA片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中，这样的群体称为cDNA 基因文库。

14、受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从实验技术上讲，是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲，是有应用价值和理论研究价值的细胞。

15、感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。

16、分子探针：指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质分子。

三、简答题

1、简述聚合酶链式反应的基本原理、步骤和所需物质（反应物）。原理：模仿细胞内发生的DNA半保留复制过程，在体外由酶催化合成特异性DNA片段。

步骤：1）变性:目的双链DNA片段在94℃下解链;

2）退火:两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;

3）延伸: DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

物质：DNA Taq聚合酶、Buffer 、MgCl2 、dNTP 、上下游引物、模板DNA、ddH2O。

2、简述琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别。

琼脂糖凝胶的凝胶孔径大,适合大分子DNA电泳和需要快速简单分析的DNA电泳,电泳方式一般采用水平潜水电泳.优点是快速简单,但分辨率不是很高,对于差异较小的DNA片段难以分辨.

聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大,灵敏度高

分离鉴定6bp~1kb个核苷酸的核酸片段用聚丙烯酰胺电泳,分离鉴定70bp~80kb的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳.

3、怎样避免星性活性/引起星性活性的因素？

星性活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，又称Star活性。

控制反应条件，避免引起星性活性因素

引起星性活性因素：高浓度限制酶

高浓度的甘油

低离子强度

高PH

用Mn2+取代Mg2+

4、简述常用的DNA连接酶及其比较和原理。

常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。

E. coli DNA连接酶催化片段互补黏性末端之间的连接，以NAD+作为辅助因子；

T4 DNA连接酶不仅能催化片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA平末端之间的连接，但连接平末端的效率较低，以ATP 作为辅助因子。

原理：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。

5、按构建克隆载体DNA的来源分类及按克隆载体的用途分类。

来源分类：

①质粒载体

②噬菌体载体

③病毒载体

④质粒与病毒或噬菌体DNA 组成的载体

⑤质粒与染色体DNA片段组成的载体

⑥其它克隆载体用途分类：

①cDNA克隆载体

②转录载体

③表达载体

④普通载体

6、理想的克隆载体具备的基本条件（特性）。

①针对受体细胞的可转移性

②自主复制功能

③多种且单一的限制性内切酶切点

④容易检测的筛选标记

⑤载体的分子量适当

⑥在细胞内稳定性高

7、质粒克隆载体构建的基本策略。

1）能在受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝数。含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点。

2）含有外源DNA片段的克隆位点，且越多越好（可组装一个多克隆位点（MCS）连杆）。

3）含有选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因。

4）载体DNA分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率降低。

5）根据需要组装各种“元件”，如启动子、终止子等。

8、简述基因组文库构建的基本步骤及基因组文库的大小的计算公式。

基本步骤

①制备基因组DNA并片段化

②DNA片段与载体重组连接

③重组DNA导入受体菌细胞并扩增

④筛选鉴定基因组文库

计算公式：N=ln（1-P）/ ln（1-f）

N 为所需的重组子的数目；f 为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA总量之比；P 为选出某一基因的概率（通常期望为99%）。

（PS：基因组DNA总量=3*109）

9、简述cDNA基因文库的构建步骤。

1)分离总RNA，并从中分离纯化出mRNA

2)以mRNA为模版，合成cDNA第一链

3)合成双链cDNA(将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDN分子)

4)将双链cDNA与载体重组，导入大肠杆菌宿主细胞增殖

10、基因组文库与cDNA文库的特点比较。

11、简述目的基因的基本分离制备方法。

1）直接分离法（包括限制性核酸内切酶酶切分离法、基因分离的物理化学法、“鸟枪法”）

2）构建基因组文库分离法

3）构建cDNA基因文库分离法

4）聚合酶链式反应技术扩增目的基因

5）基因的化学合成

12、简述作为基因工程的宿主细胞必须具备的特性。

1）便于重组DNA分子的导入；

2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；

3）便于重组体的筛选；

4）遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；

5）安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；

6）有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。

7）在遗传密码的应用上无明显偏倚性；

8）具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；

9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。

13、基因工程的应用及安全伦理性。

医学，农业，国防，能源环境。

可正可反。

四、设计题

转基因植物和动物的制备。

A.转基因小鼠的制备（显微注射法）：

⑴准备假孕母鼠A：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化，而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的养母；

⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射促性腺激素（hcg）促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配。次日从输卵管内收集受精卵备用；

⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；

⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；

⑸对幼鼠的鉴定：提取幼鼠DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合

B.转基因植物的制备（农杆菌转化法）：

1.农杆菌制备：

（1）用限制酶切下目的基因。

（2）将目的基因与质粒用DNA连接酶连接起来。

（3）将含目的基因的重组质粒导入土壤农杆菌，于筛选培养基上培养。

（4）选取正常生长的土壤农杆菌，备用。

2.转化植物细胞：

（1）取植物叶片，消毒处理。

（2）切取叶片靠中心的部位。

（3）土壤农杆菌浸泡切下的组织。

（4）浸泡后的组织置于筛选培养基上培养，并诱导产生愈伤组织。（5）分离愈伤组织，置于分化培养基上培养，诱导再分化，获得目的植物幼苗。