CTAB法提取植物总DNA (2)

CTAB法提取植物基因组DNA

这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

一、材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料

二、试剂

1、2×CTAB溶液：

CTAB (W/V) 2%,

Tris-HCl 100 mM（pH8.0）

EDTA 20 mM（pH8.0）

NaCl 1.4M

PVP 1%

巯基乙醇 0.2%

配制时先不加巯基乙醇，将其它五种加热搅拌混匀灭菌后再加入巯基乙醇。

2、乙醇 70%

3、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）或氯仿-异戊醇（24:1）体积比

4、RNaseA 10mg/ml

5、乙醇或异丙醇

三、方法步骤：

1、取适量CTAB于60℃预热30min.

2、取0.2g新鲜叶片蒸馏水洗净用吸水纸吸干至于液氮遇冷的灭菌研钵，液

氮迅速研磨成粉末;

3、取一预冷灭菌1.5ml EP管，将粉末装入后加入0.7ml CTAB，迅速振荡

混匀后置60℃水浴30 min ;

4、加入0.7 ml 酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），颠倒摇匀（10次以下）;

5、室温下（>15℃）12000 rpm 离心10 min;

6、上清移至新EP管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），颠倒摇匀

（10次以下）；

7、室温下（>15℃）12000 rpm 离心10 min;

8、移上清至一预先加入0.8倍体积异丙醇的新1.5 ml EP管中，平放旋转混

匀（动作要轻柔，防止DNA断链），冰浴20 min；

9、12000 rpm 4℃离心10 min

10、弃上清，用滤纸吸干壁上水，不能碰到沉淀；

11、加1ml 70%乙醇洗沉淀12000 rpm 4℃离心3 min,尽弃乙醇，再12000

rpm 4℃离心1 min,尽弃残余乙醇，超净台吹干;

12、用30~50 ul dd H2O溶解-20℃存贮。