猪瘟病毒NS3蛋白ATPase_RNA解旋酶功能区的表达与纯化

猪瘟病毒NS3蛋白ATPase/RNA解旋酶

功能区的表达与纯化

郑杰1,2,宁宜宝2

(1.中国农业大学动物医学院国家动物海绵状脑病实验室,北京　100094;2.中国兽医药品监察所,北京　100081)

摘要:采用R T2PCR技术扩增出猪瘟病毒石门株和C株NS3基因的A TPase/RNA解旋酶功能区,将其克隆到表达载体p ET228a(+)中,获得重组质粒p ET2NS3SM和p ET2NS3C;PCR、酶切鉴定和序列分析结果表明目的基因插入位置、方向和读码框完全正确;0.8mmol/L IPT G诱导得到分子量为54kD的目的蛋白,Western blotting结果表明,表达的目的蛋白与猪瘟高免血清没有出现肉眼可见的反应;通过EL ISA试验结果表明,重组蛋白能被CSFV阳性血清识别。

关键词:猪瘟病毒;NS3基因;A TPase/RNA解旋酶;克隆;表达

中图分类号:S852.65+1 文献标识码:A 文章编号:167127236(2007)1020043204

猪瘟(classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热、出血、繁殖障碍为特征的致死性传染病,是我国养猪业中直接造成经济损失最为严重的传染病之一。近年来猪瘟的流行方式和病症特点已经发生了较大的变化,出现了所谓的非典型性猪瘟和温和性猪瘟,并造成持续感染;同时病毒田间分离株有强毒株、中等毒力株和弱毒株,这给猪瘟的防疫和控制带来了新的困难。虽然猪瘟病毒(classical swine fe2 ver virus,CSFV)感染可以导致猪全身性组织损伤,但CSFV在体外细胞培养中增殖滴度低,一般无细胞病变(non2cytopat hic effect,non2CPE)(Pirtle等, 1968),CSFV的这些生物学特性极大的限制了人们对它的深入研究,因此对其致病机理的研究,特别是对CSFV与细胞相互作用关系的研究为人们所关注。

猪瘟病毒是黄病毒科(flaviridae)瘟病毒属(pestivirus)中的重要成员之一,与之同属的还有牛病毒性腹泻病病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、羊边界病病毒(border disease virus, BDV),目前对于猪瘟病毒非结构蛋白NS3的研究并不多,对这个蛋白的确切结构和具体功能更是知之甚少,从已有的资料来看,黄病毒科病毒编码的非结构蛋白在结构和功能上是密切相关的。因此我们对猪瘟病毒NS3的认识和推测主要来源于其它黄

收稿日期:2007204218

作者简介:郑杰(1975-),男,河南人,博士生,研究方向:动物微生物学。

通讯作者:宁宜宝,研究员。电话:010*********,E2mail:ningy2 ibao@https://www.360docs.net/doc/0917500735.html, 病毒科重要成员,如BVDV、登革热病毒(dengue fever virus)、西尼罗河热病毒(west nile virus)、黄热病病毒(yellow fever virus)、丙型肝炎病毒(hepa2 titis C virus)等的研究结果。

NS3是非结构蛋白,具有丝氨酸蛋白酶和核苷三磷酸酶(A TPase)/RNA解旋酶(RNA helicase)活性,NS3蛋白的丝氨酸蛋白酶及其核苷三磷酸酶/RNA解旋酶活性分别位于其N端的1/3区和C 端的2/3区,在NS3蛋白多肽上处于2个相对独立的功能结构区,前者主要参与病毒多聚蛋白翻译后的加工,产生成熟的病毒蛋白,这是病毒自我复制和组装的前提条件(Xu等,1997);而A TPase/RNA helicase则主要参与病毒RNA的复制过程。同时NS3蛋白通过阻断干扰素调节因子-3,可能阻断了干扰素的产生,从而避开了机体的先天性免疫而产生了免疫逃避(Foy等,2003;J r等,2005)。在能产生细胞病变的猪瘟病毒感染的细胞中,能够检测到NS3蛋白的表达,而无细胞病变的毒株却检测不到,说明NS3的表达、加工可能与致细胞病变有一定的关系,可能是致细胞病变毒株的分子标志。越来越多的研究结果表明(Aoki等,2003,2004,2001; Meyers等,1995,1996;Tautz等,2003),NS3与瘟病毒体外致细胞病变有关,通过对NS3与细胞病变关系的研究,将有助于分析猪瘟病毒的致病机理和持续性感染形成机制。

本试验将NS3基因的A TPase/RNA解旋酶功能区克隆到原核表达载体p ET228a(+)中,表达了部分CSFV NS3抗原,为研究NS3蛋白与细胞病变的关系奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　材料　p ET228a(+),菌株BL21/DE3,猪瘟病毒石门株,猪瘟阳性血清和阴性血清,均为本室保存;猪瘟病毒NS3单克隆抗体购自TropBio公司;核酸内切酶、T4连接酶为N EB公司产品;核酸分子量标准购自Ta KaRa公司;硝酸纤维素膜购自Am2 ersham p harmacia biotech公司;辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G,羊抗小鼠Ig G,购自SIGMA公司;高保真Pf u DNA聚合酶、His-Bind预装柱为M ER2

C K产品。

1.2　引物设计及合成　按试验目的设计上下游引物,上游带有SalⅠ酶切位点,下游带有NotⅠ酶切位点。上游引物:5’2C TCCGTC GACAAA GTAC2 CACA GAC T T GACA23’,下游引物:5’2GT GC G2 GCC GCAA T TC TCA GC T GT T GA TA GCCC23’。

1.3　R T2PCR　R T2PCR按常规方法进行。

1.4　重组表达载体的构建与鉴定　PCR扩增的片段经过加A后插入pMD182T载体,转化、培养,抽取质粒,酶切鉴定,阳性克隆送上海英俊生物技术公司测序,以确定读码框的正确性。取正确质粒用SalⅠ、Not Ⅰ双酶切重组质粒,用胶回收试剂盒回收片段,同时用SalⅠ、NotⅠ双酶切p ET228a(+)并纯化回收,以T4DNA连接酶16℃连接过夜,连接产物转化感受态菌TOP10,将转化菌涂布于含卡那抗性的2×YT琼脂平板,12～15h后,挑菌培养,抽取质粒,双酶切鉴定。取正确质粒转化BL21(DE3),再次挑菌培养,提取质粒,酶切分析、鉴定,含正确插入目的基因的重组质粒分别命名为p ET2NS3SM和p ET2NS3C。

1.5　NS3基因A TPase/RNA解旋酶功能区在大肠杆菌中的表达　

1.5.1　蛋白表达条件的优化及大量表达　取鉴定正确的含有阳性重组质粒的表达菌菌株,以1%的体积接种含有卡那霉素(50μg/ml)的2×YT培养基, 37℃,250r/min条件下摇菌3h,通过OD600检测,在OD600值达到0.6～1.0时,加入终浓度为0.1～1.4 mM的IPTG进行诱导,同时设置不同的表达温度(25～37℃)。每2h取菌液检测有无表达外源蛋白。

1.5.2　大量表达　用无菌牙签从转化的平皿挑取菌落,过夜培养,然后以1∶100转接入2L培养瓶中,经3h左右,测定OD600=0.6～0.8时,按优化的条件诱导培养。

1.6　表达蛋白的检测

1.6.1　SDS2PA GE电泳　取诱导后的细菌悬液2 ml,离心后加1ml的2×SDS上样buffer,煮沸裂解10min后,4℃,12000r/min离心10min,取上清,按常规方法制备12%的分离胶和5%的浓缩胶。将处理好的样品(包括空白对照)取15μl上样,采用垂直凝胶电泳装置,固定电流20mA,电泳完毕后取下凝胶,考马斯亮蓝R250染色2h,脱色液脱色30min。

1.6.2　Western blotting、EL ISA检测表达蛋白　取SDS2PA GE电泳后的凝胶,直接用B IO2L AB转印装置将其转印于NC膜上(200mA,3h),转印结束后,按常规方法进行Western blotting反应。一抗使用猪瘟高免血清(1∶50),用猪瘟非免疫猪血清为阴性对照,二抗使用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪Ig G抗体和羊抗小鼠Ig G(1∶1000),最后用DAB显色。

取表达蛋白按照常规EL ISA方法作包被,倍比稀释,一抗用猪瘟高免血清(1∶100),二抗用兔抗猪Ig G(1∶1000),O PD显色,1.25M H2SO4终止,酶标仪读数。

1.7　蛋白纯化与复性　取大量表达的菌液,4℃, 8000r/min离心,菌泥先用PBS洗涤2次,以0.1倍体积的菌体裂解液作用30min,再超声处理(200 mW,30次),离心,用包涵体洗液洗涤2次,然后用含8M尿素的结合缓冲液溶解。蛋白的纯化按His2Bind预装柱说明书进行。取纯化的蛋白,按照So m等(2002)所述的复性方法进行。

2　结果

2.1　NS3基因片段的体外扩增及重组表达载体的构建　通过RT2PCR分别扩增出2株CSFV的AT2 Pase/RNA解旋酶基因片段,测序证明大小为1484 bp,与设计相符(图1)。插入pMD182T载体,SalⅠ、NotⅠ双酶切鉴定后,进一步构建成重组表达载体p ET2NS3SM和p ET2NS3C,SalⅠ、NotⅠ双酶切后均与理论值相符,证明重组表达载体构建正确。测序结果表明,目的基因插入位点及读码框完全正确。

2.2　表达条件的优化　经过SDS2PA GE证明,表达质粒在37℃,IP T G浓度为0.8mM,表达5h时表达量最多。同时表明表达产物为包涵体。

2.3　重组菌裂解物的SDS2PA GE电泳结果　IP T G诱导表达后,12%SDS2PA GE电泳,与未诱导重组菌相比,可见额外条带。融合蛋白分子量约54 kD,与理论值相符(图2)。未经IP T G诱导的重组菌未出现多余条带。

2.4　重组菌裂解物的Western blotting和EL ISA 试验结果　将SDS2PA GE电泳后的凝胶进行免疫转印,并做Western blotting,猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清、未经IP T G诱导的重组菌都未出现该特异性染色条带。而表达蛋白与猪瘟高免血清没有发生可见反应的原因将在讨论中进一步解释。

EL ISA 结果表明表达蛋白能与猪瘟高免血清发生较好的反应(在包被0.1μg 表达蛋白时,还能

检测到抗体)。2.5　蛋白纯化　取经过纯化、复性的表达蛋白,经透析、浓缩后,检测蛋白浓度,共获得30mg 的纯化蛋白。同时抗体的制备正在进行

。

图1　PCR 扩增鉴定

　注:3为石门株,4为C

株。

图2　SDS 2PAGE 电泳图

　注:1为DE2对照,2为质粒对照,3为未加IP T G 对照,4、5、6为

表达的菌株,7、8为经包涵体洗液洗涤后产物,9为纯化产物。

3　讨论

本试验中我们克隆了猪瘟病毒石门株和C 株NS3基因的A TPase/RNA 解旋酶功能区,构建了

表达载体质粒p ET 2NS3SM 和p ET 2NS3C 。对表达条件进行优化时,在25～37℃温度范围内,对每一个温度都作了筛选,发现只有在37℃才有目的蛋白表达;而在37℃条件下,IP T G 的浓度(0.1～1.4mM )对目的蛋白的表达量影响较小。在优化表达

条件时,取2种质粒的第一代进行表达,发现目的蛋白都有较大量的表达,但在取第二代质粒大量表达时却没有目的条带出现,这可能与该段基因具有酶活性,导致对表达菌产生毒性有一定的关系,最后我们在大量表达时,只好取第一代质粒大量表达,然后

通过SDS 2PA GE 验证有无目的蛋白的表达,实践证明我们的做法是正确的。对于p ET 2NS3SM 和p ET 2NS3C ,在表达量方面没有明显的差别。

在试验中我们利用表达蛋白作Western blot 2ting ,用猪瘟高免血清孵育后,没有出现预期的结

果,可能的原因有:①作为非结构蛋白的NS3表达量较少,用全病毒作高免血清时产生的抗体更少,因此Western blotting 的反应结果不能用肉眼观察到。②原核表达的目的蛋白可能与抗体的反应性较差。故我们采用EL ISA 试验来验证,通过进一步试验发现,表达的蛋白能与猪瘟高免血清发生较好的反应(在包被0.1μg 表达蛋白时,还能检测到抗体)。

蛋白的表达、纯化及抗体的制备,为进一步研究NS3蛋白与猪瘟病毒致细胞病变的关系打下了一定的基础。

参

考

文

献

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Cloning Expression,Purif ication of Partial ATPase/RNA H elicase Functional Domain of NS3G enes of Classical Swine Fever Virus

ZH EN G Jie1,2,N IN G Y i2bao2

(1.National Animal Transmissible Spongiform Encephalopathies Laboratory,College of Veterinary Medicine,

China Agricultural University,Beijing100094,China;2.National Classical Swine

Fever Reference Laboratory,China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing100081,China)

Abstract:Partial A TPase/RNA helicase f unctional domain of NS3genes of CSFV SHIM EN rain and C rain were amplified by R T2PCR;The recombinant plasmids p ET2NS3SMand p ET2NS3C were obtained after being cloned them into expression vector p ET228a(+);And then the54kD target proteins were produced by inducing with0.8mmol/L IPT G;Western blotting showed that the expressed proteins couldn’t be recognized by superserum against csfv.And EL ISA showed that the expressed proteins could be recognized by superserum against csfv.

K ey w ords:classical swine fever virus(CSFV);NS3gene;A TPase/RNA helicase;cloning

;expression