漆酶的来源与分离纯化技术_靳蓉
10．3969/j．issn．1000－7067．2012．03．003
漆酶的来源与分离纯化技术*
靳蓉张飞龙
（西安生漆涂料研究所，陕西西安710061）
摘要：漆酶最早是从漆树所产的生漆中发现的，广泛分布于高等植物和真菌，在昆虫和细菌中也有发现。它是一种含铜的多酚氧化酶，既是聚合酶，也是降解酶，参与愈伤组织形成、木质化过程、生漆成膜、氧化酚类、苯胺类等一系列有机化合物。漆酶的去甲基化作用可以使木质素降解，也能够参与自然界中花色的形成。漆酶的应用以分离纯化为基础，主要用到沉淀、透析、色谱、电泳等技术。
关键词：漆酶；来源；分离纯化
Abstract：Laccase，firstly found in the raw lacquer of Rhus vernicifera，is widely distributed in higher plants and fungi，and has been found also in insects and bacteria．As polyphenol－oxidase containing copper，it is polymerase as well as lyase that joins renewal of tissue，lignifications，formation of lacquer film，oxidation of a broad range of organic substrates，including phenols，anilines etc．The demethylation of laccase is applied to lignin degradation and formation of color within natural flowers．Isolation and purification is the foundation of application，including sedimentation，dialysis，chromatograph and electrophoresis mainly．
Keywords：Laccase；Origin；Isolation and purification
漆酶（Laccases，Lac，EC1．10．3．2），即对苯二酚：（双）氧氧化还原酶，又名酚酶，多酚氧化酶等，是一种含铜的糖蛋白氧化酶，它和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶（blue multi－copper oxidase）家族［1］。在生漆中，漆酶是生漆固化成膜的生物催化剂，它催化漆酚形成聚合物。在过去的数十年，漆酶由于其广泛而绿色的可应用价值，备受研究者和生产加工者的关注，其身影几乎出现在化学、分析、食品、医疗、生物和环保等各个领域，因此，漆酶研究也可以认为是漆树资源的重要分支［2］。
漆酶最早是从漆树所产的生漆中发现的，1883年，日本学者吉田（Yoshi）发现在生漆中存在一种对热敏感的物质，这种物质能够促进生漆变色及硬化，基于自身的科学素养与大胆猜想，吉田推测这种物质就是催化生漆成膜固化的生物催化剂———酶，但是，遗憾的是吉田将其误以为是淀粉酶物质（diastatic matter）。1894年，法国人G．Bertranel将促进生漆固化成膜的活性物质提取出来，并将这种蛋白质命名为“Laccase”（即漆酶），从此“漆酶”的概念确定并沿用至今［3－5］。1909年，Euler错误地认为G．Bertranel 所谓的“漆酶”是单、双和三羟基酸的钙盐混合物，还发现其中有柠檬酸、苹果酸和草酸等，并认为这些酸的钙盐是生漆成膜硬化的促进因子。随着科学技术的进步和相关研究的积累，1934年，P．Fleurg在众多漆酶理化特性研究基础上，采用硫酸铵沉淀法，建立了一整套从生漆中分离提纯漆酶的方法，这是早期分离提纯漆酶最有效方法。直到1939年，D．Kelin 才确定漆酶的本质是含铜蛋白质［6］。
漆酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体的各种
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2012年9月Journal of Chinese Lacquer Sep．2012 *收稿日期：2012－04－08
器官或组织中，一般幼嫩部分含量较多，成熟部分含量较少。目前漆酶的最普遍来源是真菌，已知在多种真菌菌株分泌物中都检测到了漆酶的活性［7］。相对于真菌而言，植物、动物、昆虫来源的漆酶研究资料稍少。
漆酶作为生物产物，不仅具有参与应激防御反应、细胞壁重建、形态发生、与宿主相互作用、腐殖质的代谢更新等生物学功能，而且被广泛地应用于不同的工业氧化处理过程中，例如木质素的降解、各类漂白、生物去污、乙醇生产、生物传感器、生物燃料电池等。这些工业应用主要基于漆酶具有环境友好地氧化不同的芳香族和非芳香族化合物的功能。随着分子生物学的发展，利用微生物作为载体，构建漆酶的功能性表达系统，可使得漆酶的大规模生产成为可能，有助于改善目前漆酶产量低、价格昂贵、不能大范围产业化的现状。极端环境微生物研究的进展，有助于能够适应例如高压、盐碱等极端环境下应用的新型漆酶形成，它的发现将给一些特殊领域的工业化应用带来福音，期待给人类带来更多的新价值。
1漆酶的来源
漆酶的传统来源是植物、微生物和一些昆虫：植物是最早发现的来源；微生物是漆酶产量最大和研究较深入的来源；昆虫是漆酶的特殊来源，也是尚有争议的来源［8］。近年来，越来越多的漆酶同工酶的发现，为漆酶的差异化研究的深入奠定了基础，这是漆酶的科研之源；而工业化的应用需求催生了漆酶的生产来源，即漆酶的异源表达系统。
1．1植物漆酶
对漆酶的研究最早是从漆树植物开始的。漆树漆酶是目前从植物源提取的活性最高的漆酶［8］。漆树（Rhus vernicifera）种属于植物界被子植物门（Magnoliophyta）双子叶植物纲（Magnoliopsida）无患子目（Sapindales）漆树科（Anacardiaceae）漆树属（Toxicodendron）［9］。中国中西部的秦巴山区和云贵高原为漆树全球分布中心，环中国东南的区域和国家，如朝鲜、韩国、日本、越南、缅甸、泰国、柬埔寨、老挝等也有分布，并集中分布在图1红线所示的三角区域：东北至日本的八户，西北至不丹的锡金，南到越南胡志明市（图1）［10］。漆树资源的分布影响着天然漆树漆酶的多寡，丰富的漆树资源为天然漆树漆酶的获得奠定了基础
。
图1全球漆树主要分布区［10］
在中国，漆树资源的整体分布主要以秦巴山区和云贵高原为中心，包括了24个省市行政区，500多个县，集中分布在陕西、湖北、四川、重庆、甘肃、贵州和云南七个省（直辖市），有佛坪、岚皋、平利、竹溪、恩施、龙山、城口、北川、大方、毕节、镇雄等60多个重点产漆县。中国漆树分布见图2［11］。其资源量约占世界的85%左右，具有丰富的漆酶植物来源
。
图2中国漆树分布区［11］
植物漆酶除了主要来源于漆树，在其他一些高等植物也有被发现，例如芒果、香蕉等。目前已知的产漆酶的植物源列于表1［8］。这些漆酶主要出现在植物木质部，叶子、根中也有。植物漆酶主要参与愈
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伤组织形成、木质化等过程［12］。
表1漆酶的植物来源［8］
来源中文名称
Rhus vernicifera漆树
Rhus succedanea安南漆
Melanorrhoea usitata缅甸连加斯
Melanorrhoea laccifera高棉漆
Manifera indica芒果
Schinus molle加州胡椒树
Pistacia palaestina巴勒斯坦黄连木
Pleiogynium timoriense帖木李
Banana香蕉
Peach梨
Grape葡萄
Lactuca virosa毒莴苣
Digitalis purpurea毛地黄
Coffer bean咖啡豆
Mungbean hypocotyls绿豆胚轴
Acer pseudoplatanus悬铃木
Pinus taeda火炬松
Populus trichocarpa西部香脂杨
Populus euramericana黄杨
Liriodendron lulipifera马栗树
Aesculus parviflora小花七叶树
Camella sinesis L．茶
Nicotiana tabacum烟草
Arabidopsis thaliana拟南芥
Podocarpaceae罗汉松
Forsythia suspensa连翘
1．2微生物漆酶
微生物漆酶，主要可以细分为真菌来源和细菌来源。目前，真菌来源的漆酶研究比较广泛、深入，研究角度也各不相同，为其他来源的漆酶研究积累了丰富的参考资料。据报道，产漆酶真菌不下于1000种，而且超过100种真菌漆酶，已经从相应的培养物中被纯化，并对其理化特性做了深入研究［7］。真菌漆酶具备多种生理生化功能，广泛参与形态发生、与植物寄主相互作用、应激防御以及木质素降解等过程。其中真菌的木质素降解功能是被人们广泛接受和认识研究的功能之一。
真菌漆酶最早由Bertrand于1896发现［13］，发现后很长一段时间未受关注，直到白腐真菌的木质素降解功能被揭示，真菌漆酶的研究才备受瞩目，而成为研究热点。有许多报道称子囊菌纲（Ascomycetes）的许多真菌产漆酶，例如Gaeumannomyces graminis、Magnaporthe grisea、Ophiostoma novoulmi、Melanocarpus albomyces、Monocillium indicum、Neurospora crassa、Po-dospora anserina等，但是很难确定具体有多少种子囊菌产漆酶，因为没有人做过系统研究［7］。此外，漆酶在担子菌纲（Basidiomycetes）和半知菌纲（Deuteromy-cetes）中也分布广泛，例如研究较多的白腐菌、革菌属、栓菌属、蜜环菌属、多孔菌属、鬼伞属等，而漆酶产量普遍较高的主要是彩绒革盖菌［14］。
细菌中存在漆酶认知较晚，早先报道的漆酶细菌来源有Bacillus sphaericus［15］、Azospirillum li-poferum［16］和地中海生海洋性细菌Alteromonas菌株［17］等，数量比较少，近年来产漆酶细菌的报道越来越多。其中第一种被广泛研究的细菌漆酶源于Azos-pirillum lipoferum，而且现在已经得到了细菌漆酶的晶体结构。Alexandre曾推断漆酶在细菌中也广泛存在，并将被不断发现［18］。近年来的研究成果证明Al-exandre的推断是正确的，例如Bacillus sp．strain HR03［19］、Bacillus licheniformis［21］和Stenotrophomonas maltophilia［20］。Bacillus licheniformis LS04是2012年才发表的新的产漆酶细菌，该细菌漆酶具有抗碱性和抗有机溶剂的特性，能在特殊环境下发挥漆酶催化活性。目前革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中都发现了漆酶编码基因，包括一些极端环境的品种，例如Oceanobacillus iheyensis和Pyrobaculum aerophi-lum也含有漆酶，这些发现为新的漆酶来源及应用带来前景。与真菌漆酶功能稍有差异，细菌漆酶一般主要参与形态发生、芽胞外被抵御紫外与过氧化物的伤害、孢子色素的生物合成和铜离子的体内平衡等［22］。
1．3动物漆酶
相对微生物和植物来讲，动物体中发现的漆酶很少。报道的有猪肾和麻蝇（Phormia cegina、Musca domestica、Lucilia sericata）、烟草天蛾（Manduca sex-ta）、绿头苍蝇（Calliphora vicina）、蚊子和双翅目的迁移类蝗虫等［22－25］。昆虫漆酶蛋白的主要功能是控制表皮的骨化作用［8］。
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1．4漆酶同工酶
同工酶（isozyme，或isoenzyme）是指催化相同的生物化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。最早是在电泳分离乳酸脱氢酶时发现［26］。同工酶不仅存在于同一个体的不同组织中，甚至同一组织同一细胞的不同亚细胞结构中。有研究者认为，漆酶同工酶是对漆酶来源的补充，也是促进漆酶研究深入发展的一个方向［8］，同工酶的研究可以有助于发现一些新类型的酶，例如白漆酶和黄漆酶正是通过同工酶的研究而提出来的［27－28］。各种漆酶同工酶的差异可能主要体现在糖链部分，它的研究已经成为细胞分化及形态遗传学的重要内容［29］。
1．5漆酶的异源表达
尽管漆酶的应用价值广，但是植物、动物、昆虫等天然来源的漆酶产量低、价格昂贵，而真菌大多在恶劣环境下才会启动漆酶的表达系统。依赖野生天然来源的漆酶生产，难以满足工业需求，漆酶的产业化因此推广受到限制。随着分子生物学的发展，漆酶的异源表达系统的构建和利用为漆酶工业化大规模生产提供了一条新的可发展途径，目前已有多种蛋白通过异源表达的方法投入工业生产，比如青霉素、蔗糖酶、几种生长激素等，证明了该方法具有一定的可行性。
漆酶的异源表达是指将漆酶的基因克隆获得后，导入合适的载体中进行大量表达的分子技术。它首先需要获得漆酶基因［30］。1988年Frohman等首次利用快速扩增cDNA技术，从白腐菌P．ostreatus 中克隆到漆酶poxI基因。后来的学者有的用RT－PCR来获得漆酶基因，有的先建立菌种的cDNA文库，然后用已知的漆酶基因做探针进行筛选，还有的利用漆酶铜原子结合位点的保守性，设计引物克隆漆酶基因［31］。
首次将克隆基因导入表达载体是在1991年，Markku Saloheimo等将编码白腐菌Phlebia radiata漆酶基因克隆于软腐菌Trichoderma reesei表达系统中，用纤维素酶的启动子来启动该酶基因的表达，表达量达到20mg/L。此外，也有其他表达系统的成功构建［32］，但是离真正实现漆酶的高表达还有一定的距离。
目前，酵母表达系统是研究较为透彻的表达系统。因其易于进行分子遗传操作，能够对重组蛋白进行翻译后的加工修饰和分泌表达，具备完善的发酵方法、重组蛋白表达量高、自身满足安全需要等特征。利用酵母表达系统已成功生产了多种重组蛋白。酵母也成为重组漆酶的主要表达宿主。Trametes sanguinea、Trametes versicolor、Melanocarpus Albomyces、M．thermophila、Pleurotus ostreatus、Trametes Versicolor 等产漆酶的菌株的重组基因均被报道在酵母S．cere-visiae中表达。
除了酵母表达系统，丝状真菌表达系统是另一种用于生产重组蛋白质产品的工具，其优势在于其具有分泌大量胞外蛋白质的能力。目前，真菌漆酶已在黑曲霉（A．niger）、构巢曲霉（A．nidulans）、米曲霉（A．oryzae）、里氏木霉（T．reesei）中进行了异源表达的研究，最高表达量可达7000U/L。但与酵母表达系统相比，其生成的漆酶活性相对较低，相关研究者也进行了一系列改进来优化表达质量［33］。
2漆酶的分离纯化
漆酶作为蛋白质类生物质，常常与其它生物产物以复杂的混合物形式存在，因此其应用以分离和纯化为基础。值得一提的是，大多数漆酶都是胞外酶，使得漆酶的分离纯化相比胞内酶而言稍显容易，而且在胞外的稳定性也较好［7］，适宜于各种工业应用。
2．1植物漆酶的分离纯化
植物漆酶的分离提纯，主要是指生漆中漆酶的分离纯化。漆树漆酶的分离纯化方法已经被研究了一个多世纪［34］，各种方法得到的酶制剂的特性各不相同［35］，但是研究摸索从未停止：1934年，P．Fleurg 创立了漆酶的饱和硫酸铵沉淀法；1970年Reinham-mar［36］发表了一种从生漆丙酮粉末中分离大量漆树漆酶的办法，后来被各研究人员广为引用［37－40］；随着技术创新，杜予民使用高效液相色谱（High Per-formance Liquid Chromatography，HPLC）达到了漆树漆酶的简单、快速分离的目的［41］。也有报道称等电聚焦（Iso Electrofocusing，IEF）被用于漆酶分离［42］，但是IEF很难获得用于进一步研究的漆酶产品活性部分［43］，更多的是被用来测定漆酶的等电点。
目前，植物漆酶的粗提取主要是依据漆酶溶解度特性，利用有机溶剂或无机盐沉淀蛋白质获得最
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初始的漆酶制品，然后通过透析、层析、电泳等生物化学技术进行纯化获得较纯的漆酶。在纯化中，也可得生漆的其他制品，例如漆酚、生漆多糖等。
漆树漆酶的有机溶剂沉淀是利用有机溶剂降低溶液的介电常数，增加偶极离子之间的静电引力，破坏蛋白质表面的水合层，使其溶解度降低而沉淀。常见的丙酮、乙醇均可被用来进行漆酶的沉淀，但是有些有机溶剂会影响漆酶的催化活性，因此一般多用丙酮［44］。漆酶提取时常用冰丙酮，冷冻的冰丙酮有助于漆酶的沉淀和活性保护。沉淀后，丙酮上清液包含了大约60% 65%的漆酚，20% 30%的水，剩下的不溶物被称为丙酮粉末，大约占有8% 12%［43］。
超滤（ultrafiltration）是利用压力或离心力强行使水和其他小分子通过半透膜而将蛋白质截留在膜上达到浓缩和脱盐的目的。丙酮沉淀获得的粉末需重新溶解于磷酸盐缓冲液后，离心去沉淀，再用合适的超滤膜截留漆酶。有研究者用过10KDa的超滤膜［43］。
漆树漆酶的盐析（salting out）法沉淀是基于盐离子和漆酶分子上电荷的相互作用。低浓度盐时，漆酶分子吸附盐离子后带电层互相排斥使漆酶的溶解度增加。一般在漆树漆酶丙酮粉末溶解于缓冲液时，添加少量的硫酸铵促进漆酶的溶解。随后在漆酶溶液中加入过量硫酸铵，使水的活度降低，原来大部分甚至全部的自由水变成了盐离子的水化水，漆酶表面与疏水基团相接触的水分子被用于溶剂化盐离子，导致漆酶表面疏水基团的暴露，最后漆酶因疏水作用沉淀。盐沉淀效果与漆酶溶液pH值有关，等电点附近沉淀效果最好［45］。
透析（dialysis）是利用漆酶蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使漆酶和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。在漆树漆酶提取过程中，需要用透析除去漆酶中的残余丙酮。操作时将混杂着丙酮的漆酶溶液加入半透膜制成的透析袋中，将透析袋浸入透析液（缓冲液），可磁力搅拌辅助，促进小分子的渗出。也可在操作过程中更换透析液直至杂质小分子降低到最少［46］。
层析（chromatography）又可称为色谱，是利用各组分理化性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。漆酶分离纯化常用到的层析技术，主要有凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC）、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC）、高压液相层析（High Performance Liquid Chro-matography，HPLC）等。GFC，又称为分子排阻层析或凝胶渗透层析。它利用凝胶的多空网状结构，分级分离不同相对分子质量的蛋白质混合物。一般是大分子先流出，小分子后流出。常用的凝胶有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio－gel P）、琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose或Bio－Gel A）等。漆酶分离纯化中GFC可用于去除漆酶溶液中的与其分子量差异大的蛋白质。IEC是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。常用的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。漆酶分离中效果较好的有阳离子交换CM－Sephadex C50（羧甲基葡聚糖C50）阴离子交换剂DEAE－Sephadex A50（二乙基氨基乙基葡聚糖A50）。HPLC是在传统色谱基础上使用颗粒更细的固定相支持剂，溶剂系统采取高压，同时配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统，因此洗脱速度快，分析更加准确便捷。
电泳（electrophoresis）是一种在外电场作用下利用分子携带的净电荷不同以分离蛋白质等生物分子的一项实验技术，种类很多，可用于少量制备。漆酶高分辨率的分离以及分子量的估算常常用到其中的SDS－PAGE（十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳）。
等电聚焦（Iso Electrofocusing，IEF）也是一种高分辨率的蛋白质分离技术，还可用于蛋白质等电点的测定。在外电场作用下，蛋白质移动并聚焦在其等电点的pH梯度处，形成一条狭窄的区带，因此该技术特别适用于同工酶（isoenzyme）的鉴定。只要同工酶的pI有0．02（甚至小于0．02）pH单位的差别，就能将其分开［47］。
以上超滤、透析、凝胶过滤层析、离子交换层析、电泳、等电聚焦等生化分离纯化技术可以根据对漆酶纯化程度的要求和硬件设施等条件有选择的使用。纯度越高，层析、电泳等高效分离技术用到越多，必要时多种技术可以共同使用，以便于结果的精准分析。
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漆树漆酶一般的分离纯化流程为：采集生漆→有机溶剂沉淀→收集不溶物→溶解于磷酸盐缓冲液→超滤→盐析、透析→层析→等电聚焦、电泳等。具体可参考步骤如下［43－45］：
1）制备丙酮粉末：
取生漆液按生漆液：丙酮=1：5（质量比）的比例混合，低温冰浴搅拌0．5 2小时至混合均匀；将混匀的生漆丙酮混合物用布氏漏斗过滤留沉淀，同时用预冷的丙酮重复冲洗棕黑色沉淀至肉眼视无色为止；将沉淀在5?风干即得到银灰或灰白色的丙酮粉末；
2）重新溶解与超滤：
将丙酮粉末重新溶解于0．01mol/L pH6．0的预冷磷酸盐缓冲液中，均化处理，冷水萃取过夜；5000?g离心15分钟弃沉淀或抽滤弃沉淀，得滤液为淡绿色；于25?加固体硫酸铵盐析使蛋白沉淀，重新溶解盐析蛋白利用10kD的超滤膜除去小分子物质（可选择性使用）；
3）阳离子交换层析：
选择CM－Sephadex C50层析柱（25cm?8cm）用磷酸盐缓冲液平衡后，将滤液加入，收集各组分。Reinhammar在收集级分18ml时在塔顶出现一条宽5cm的蓝色带，随后有黄色和混浊级分被洗脱。用0．05mol/L缓冲液淋洗层析柱直到洗脱液不再吸收250nm光波为止，得1 2L洗脱液，其中含有漆酶。换0．1mol/L缓冲液洗脱，蓝色带分开，一部分留于柱顶，一部分被洗脱下来。后期换0．15mol/L缓冲液以及0．2mol/L缓冲液会将蓝色带及它附近的黄色级分分别洗脱。一般黄色级分先行，有时也有少量浅绿级分先行。ERP谱表明，蓝色带代表蓝色蛋白，浅绿级分与蓝色带相同，均无漆酶活性。
4）阴离子交换层析：
将步骤3收集的洗脱液首先用0．01mol/L缓冲液透析，然后加到0．01mol/L缓冲液平衡的DEAE Sephadex A50（15cm?2．5cm）交换柱上。漆酶即可被顺利洗脱。用凝胶电泳检测漆酶纯化程度，不纯的样品重复步骤3，得到的洗脱液用0．01mol/L缓冲液平衡的CM－Sephadex C50层析柱浓缩得漆酶窄带后，用0．2mol/L缓冲液洗脱得漆酶浓溶液。
整个层析利用恒温水浴保证温度维持在4?。
5）透析、浓缩、冻干：
将得到的漆酶浓溶液用1kDa滤膜超滤除盐、浓缩。浓缩的漆酶利用真空冷冻干燥机冻干，存于干燥器皿中，备后续理化性质分析用。
万云祥、杜予民等［43］研究者曾经从漆树Rhus vernicifera的生漆液中提纯研究水溶性成分，成功纯化到漆酶以及漆酶的两个同工酶，其分离流程亦可以作为漆树漆酶分离纯化系统的参考
：
图3Rhus vernicifera中漆酶的分离纯化流程［43］
2．2微生物漆酶的分离纯化
微生物漆酶多源于真菌，而真菌中产漆酶活性较高、且分布广泛的主要是白腐真菌家族。真菌中的漆酶多为分泌糖蛋白，其表观分子量有很大差异，从59 390KDa不等。一部分菌株产生的漆酶由数种同工酶组成，皆为糖蛋白（含有10% 80%糖残基不等）与单体酶。酶分子中一般都含有4个铜原子，适宜反应温度较低，在酸性pH条件下催化效率较高［48］。真菌漆酶经常存在于真菌的发酵液中，因此免去了从菌体中抽提漆酶的环节，一般去除菌体即可。如果有真菌漆酶是胞内酶，则需额外进行细胞破碎后提取。
真菌漆酶的获得一般通过：菌种获得→菌种的培养→条件优化→发酵培养→发酵液离心分离留上清（弃菌体）→盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离→凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析→电泳、等电聚焦（必要时）→活性成分的收集。除了初始的微生物培养、发酵部分不相同，漆酶的后期精细纯化的原理和步骤与漆树漆酶类似。
2．3动物漆酶的分离纯化
动物漆酶的来源比较少，有些专家认为动物、昆
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虫来源的漆酶可能是某种多酚氧化酶，而不是严格意义上的漆酶，因此应小心使用［8］。动物漆酶分离纯化的原则与上述植物或微生物漆酶类似，都是先收集获得粗的漆酶制品，然后进一步通过层析、电泳等技术获得较纯的漆酶制品。
2．4漆酶同工酶的分离纯化
同工酶的分离一般根据其理化性质的不同选择分离纯化技术。漆酶同工酶的分离一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶等电聚焦。万云祥等用离子交换层析得到漆酶的两个同工酶L1和L2，分子量分别是12000和10300，pI分别是8．6和9．1，均有漆酶的活性，并且每分子都有4个铜原子［43］。韦建学、张飞龙等将粗漆酶经sephadex G－100柱层析（2．5cm?60cm）分离，得到漆酶同功酶I、Ⅱ，再将I、Ⅱ分别经sephadeX G－200柱层析（1．5cm?30cm）纯化，收集、透析后得漆酶同功酶贮备液。同功酶I分子量为131，000，呈深蓝色；同功酶Ⅱ分子量为114，000，呈浅蓝绿色［49］
参考文献
［1］Wan Y－Y，Du Y－M．Structure and catalytic mechanism of laccases［J］．Chemistry，2007，70（9）：662－670
［2］Han J－L，Guo L－Q，Lin J－F．The review of crystal struc-ture of laccases［J］．Chinese Journal of Bioprocess Engineer-ing，2006，4（4）：1－6
［3］Benfield G，Bocks SM，Bromley K，Brown BR．Studies of fun-gal and plant laccases［J］．Phytochemistry，1964，3：79－88［4］Wan Y－Y，Du Y－M，Yang F－X，et al．Purification and characterization of hydrosoluble components from the sap of Chinese lacquer tree Rhus vernicifera［J］．International Jour-nal of Biological Macromolecules2006；38（3－5）：232－240［5］Preface：Future and past of oriental lacquer in chemistry and technology［R］．30May；Fuzhou，China：1993
［6］张飞龙，关迺丽．漆酶研究史［J］．中国生漆．1991，1：20－27
［7］Baldrian P．Fungal laccases－occurrence and properties［J］．FEMS Microbiology Reviews2005，30（2）：215－242
［8］Wan Y－Y，Du Y－M．The Sources and Applications of Lac-cases［J］．Chemistry and Industry of Forest Products，2008，28（6）：100－108
［9］中国科学院植物研究所，南京地质古生物所．中国新生代植物［M］．北京：科学出版社，1958，116－117
［10］Wan Y－Y，Lu R，Du Y－M，Honda T，Miyakoshi T．Does
Donglan lacquer tree belong to Rhus vernicifera species ［J］．International Journal of Biological Macromolecules，2007，41（5）：497－503
［11］张飞龙．中国髹漆工艺与漆器保护［M］．北京．科学出版社．2010．204－205
［12］Bao W，O'Malley D M，Whetten R，et al．A laccase associat-ed with lignification in Loblolly Pine Xylem［J］．Science，1993，260（5108）：672－674
［13］Bertrand G．Preparation biochimique du sorbose［J］．C．R．Seances Acad．Sci．Paris．1896，122：900－903
［14］M．Smith，A．Shnyreva，t D．A．Wood and C．F．Thurston．Tandem organization and highly disparate expression of the
two laccase genes lcc1and lcc2in the cultivated mushroom
Agaricus bisporus．Microbiology［J］．1998，144：1063－1069［15］Claus H，Filip Z．The evidence of a laccase－like enzyme activity in a Bacillus sphaericus strain［J］．Microbiological
Research1997；152（2）：209－216
［16］Diamantidis G，Effosse A，Potier P，Bally R．Purification and characterization of the first bacterial laccase in the rhizos-pheric bacterium Azospirillum lipoferum［J］．Soil Biology
and Biochemistry2000，32（7）：919－927
［17］Solano F，Garcia E，De Egea EP，et al．Isolation and charac-terization of strain MMB－1（CECT4803），a novel melano-genic marine bacterium［J］．Applied and Environmental Mi-crobiology1997，63（9）：3499－3506
［18］Alexandre G，Zhulin IB．Laccases are widespread in bacteri-a［J］．Trends in Biotechnology2000，18（2）：41－42［19］Arastoo B．Dalfarda，KK．Isolation and biochemical charac-terization of laccase and tyrosinase activities in a novel mela-nogenic soil bacterium［J］．Enzyme and Microbial Technolo-gy．2006，39（7），1409－1416
［20］Said G，Ferid L，Nejib M．A New Stenotrophomonas malto-philia Strain Producing Laccase．Use in Decolorization of
Synthetics Dyes［J］．Applied Biochemistry and Biotechnolo-gy．2009，158，（2）：416－431
［21］Lei L．，Min Z．，Tian－Nv W．，Li－Yan Z．，Mei－Hui D．，Tai－Lun L．，De－Bin L．Characterization and dye decolori-zation ability of an alkaline resistant and organic solvents
tolerant laccase from Bacillus licheniformis LS04［J］．Biore-source Technology．2012，115，35－40
［22］Honghua Ge，Yun Wu，and Yazhong Xiao．Structure，cata-lytic mechanism and applications of laccases：a review［J］．
Chin J Biotech，2011，27（2）：156－163
［23］Hopkins TL，Kramer KJ．Insect cuticle sclerotization［J］．Annual Review of Entomology1992，37：273－302
31
2012年9月Journal of Chinese Lacquer Sep．2012
［24］Kramer KJ，kanost MR，Hopkins TL，et al．Oxidative conju-gation of catechols with proteins in insect skeletal systems ［J］．Tetrahedron2001，57（2）：385－392
［25］Sidjanski S，Mathews GV，Vanderberg JP．Electrophoretic separation and identification of phenoloxidases in hemo-lymph and midgut of adult Anopheles stephensi mosquitoes ［J］．Journal of Parasitology1997；83（4）：686－691［26］王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学（三版上册）［M］．北京．高等教育出版社．2002．428－429
［27］Davin LB，Wang H－B，Crowell AL，et al．Stereoselective bimolecular phenoxy radical coupling by an auxiliary（diri-gent）protein without an active center［J］．Science．1997，275：362－366
［28］Leontievsky A，Myasoedova N，Pozdnyakova N，Golovleva L．'Yellow'laccase of Panus tigrinus oxidizes non－phenolic
substrates without electron－transfer mediators［J］．FEBS
Letters1997，413（3）：446－448
［29］Shen T，Wang JY．Biochemistry［M］．2nd ed．Bei Jing：High Education Press of China，1990
［30］左斌，王海斌，葛俊．真菌漆酶基因研究进展［J］．微生物学免疫学进展，2009，37（1）：72－76
［31］Otterbein L，Record E，Longhi S，et al．Molecular cloning of the cDNA encoding laccase from Pycnoporus cinnabarinusl
－937and expression in Pichia pastoris［J］．Eur J Biochem．
2000，67（6）：1619－1625
［32］Jolivalt C，Madzak C，Brault A，et aI．Expression of laccase IIIb from the white－rot fungus TrameteB versicolor in the
yeast Yarrowia lipolytica for environmental applications［J］．
Appl Microbiol Biotechnol．2005，66（4）：450－456［33］刘志明，郭丽琼，林俊芳．真菌漆酶异源表达研究进展［J］．中国生物工程杂志，2009，29（6）：135－142［34］J－H．Gan，Chemistry of Lacquer［M］．Science Publisher，Beijing，1984；Yoshida，J．Chem．Soc．43（1883）127［35］K．T．Lim，C．Hu，D．D．Kitts．Antioxidant activity of a Rhus verniciflua Stokes ethanol extract［J］．Food Chem．Toxicol．
2001，39（3）：229－237
［36］B．Reihammar，．Purification and properties of lacease and stellacyanin from Rhus vernicifera［J］．Biochimica et Bio-physica Acta．1970，205：35－47
［37］S．K．Lee，S．D．George，W．E．Antholine，et al．Nature of the
intermediate formed in the reduction of O
2to H
2
O at the tri-
nuclear copper active site in native laccase［J］，J．Am．
Chem．Soc．124（2002）6180－6193
［38］T．E．Machonkin，L．Quintanar，A．E．Palmer，et al．Spec-troscopy and Reactivity of the Type1Copper Site in Fet3p
from Saccharomyces cerevisiae：Correlation of Structure with
Reactivity in the Multicopper Oxidases［J］．J．Am．Chem．
Soc．，2001，123（23）：5507－5517
［39］Y－Y Wan，Y－M Du，X－W Shi，et al．Immobilization and characterization of laccase from Chinese Rhus vernicifera on
modified chitosan［J］．Process Biochemistry．2006，41（6）：
1378－1382
［40］Shiba T，Xiao L，Miyakoshi T，Chen CL．Dept Wood＆Pa-per Sci，Raleigh，NC27695，USA．Oxidation of isoeugenol
and coniferyl alcohol catalyzed by laccases isolated from
Rhus vernicifera Stokes and Pycnoporus coccineus［J］．J
Mol Catal B Enzym．2000，10（6）：605－616
［41］Y－M．Du，Proceedings of the16th International Symposi-um on the Chemistry of Natural Products，Kyoto［R］，IU-PAC，1988
［42］C EggerT，U Temp，AND K－E．Eriksson．The Ligninolytic System of the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus：
Purification and Characterization of the Laccase［J］．Appl．
Environ．D Microbiol．1996，62（4）：1151－1158
［43］Wan Y－Y，Du Y－M，Yang F－X，et al．Purification and characterization of hydrosoluble components from the sap of
Chinese lacquer tree Rhus vernicifera［J］．International
Journal of Biological Macromolecules2006；38（3－5）：232
－240
［44］张飞龙．中国髹漆工艺与漆器保护［M］．北京：科学出版社，2010：262－263
［45］王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学（三版上册）［M］．北京：高等教育出社，2002：304－307
［46］王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学（三版上册）［M］．北京：高等教育出版社，2002：310
［47］钞亚鹏，钱世钧．真菌漆酶及其应用［J］．生物工程进展，2001：21（5）：23－27
［48］Takao S，Peng H，Katsuya K，et al．Purification and charac-terization of an extracellular laccase of a fungus（family
Chaetomiaceae）isolated from soil［J］．Enzyme and Microbi-al Technology2003，33：520－526
［49］韦建学，张飞龙，魏朔南．漆树漆酶同功酶研究［J］．中国生漆，2000，19（4）：9－12
41