贵州地区羊口疮病毒B2L基因克隆及原核表达载体构建

向智龙1,卓建华3,程振涛1,2,欧德渊1,2,鲜思美1,2,尹传宝1,黄璐1,禾彩红1

(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省动物疫病研究所,贵州贵阳 550025;

3.京山县畜牧兽医局,湖北京山 431800)

摘要:用H2L基因特异性引物对羊口疮临床疑似病料进行鉴定,采用P CR扩增出阳性样品羊口疮病毒结构蛋白B2L基因,回收纯化PCR产物,克隆至pM D18 T,测序结果表明插入的片段为目的基因,全长1137bp。将目的基因定向克隆至pET 32a构建了B2L基因原核表达载体pET 32a B2L,经PCR鉴定、酶切及进一步测序证明表达载体构建成功,为下一步的表达及基因工程疫苗的研究奠定了良好基础。

关键词:羊口疮病毒;克隆;原核表达载体

中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2011)07 0076 04

羊口疮病毒(orf virus,ORFV)属于痘病毒科(Po xviridae)、副痘病毒属(Parap ox v ir us),同属还有假牛痘病毒(PCPV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)、新西兰红鹿副痘病毒(PVNZ)(Becher等, 2002;N ettleto n等,1995;Robinso n等,1995)。羊口疮是由羊口疮病毒引起的山羊、绵羊的接触性、嗜上皮性传染病(殷震等,1997),以在口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和痂皮为临床特征(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,1998)。本病为一种人兽共患病,通过直接接触传染,其中绵羊、山羊易感,羔羊最为敏感,常引起群体发病,尤其是密集的羊群(殷震等,1997;中国农业科学院哈尔滨

收稿日期:2010 11 30

作者简介:向智龙(1983-),男,湖北人,硕士,从事动物病理学及分子生物学研究。

通信作者:程振涛(1979-),男,副教授,博士,从事预防兽医学研究。E mail:ch engzh entao@https://www.360docs.net/doc/1e42981.html,

基金项目:贵州省科学技术基金项目贵州省羊口疮的病原学与检测技术研究 (黔科合J字[2010]2260);贵州大学

引进人才科研项目贵州省羊口疮的诊断与防控技术

研究 (贵大人基合字[2009]024号);贵州大学2010

年研究生创新基金项目贵州省羊口疮的分子诊断技

术及B2L基因表达研究 (校研农[2011]024);贵州大

学2010年 SRT 项目羊传染性脓疱病毒贵州株的

PCR鉴定及分子特征分析 [贵大SRT字(2010)021]。兽医研究所,1998;丁再隶等,1992)。另外,麝牛、鹿、人也可感染。对自由放牧鹿不会产生严重的损伤,仅在口腔黏膜出现增生性损害(Buller等, 1991)。绵羊发病率可达30%~60%,羔羊病死率可达20%,给养羊业带来巨大的经济损失。ORFV 核酸为双股DNA,基因组大小为130~150kb(Gas sm ann等,1985),G+C含量约为64%(Robinson 等,1987);目前公认含有16个开放阅读框(ORF),由130个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。在ORFV全基因组中,Bam H 酶切片段的B2L 基因(靠近G和E片段,距基因末端约10kb处,长约1137bp)是一个完整的阅读框,编码蛋白质大小为42ku;该蛋白是病毒囊膜的成分之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应,并刺激淋巴细胞释放(黄引贤等,1986),是ORFV的保护性抗原之一(Sullivan 等,1994)。本试验应用PCR技术对ORFV贵州分离株的B2L基因进行了扩增、序列测定并克隆到pET 32a载体上,成功构建表达载体pET 32a B2L,为羊口疮病毒B2L基因的原核表达及基因工程疫苗的研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料疑似病料采集自贵州省翁安地区羊养殖场发病羊的皮肤,由贵州省动物疫病研究所低温

T he GS K3 g ene w as physically mapped at por cine chro mosome13q41 46and closely linked to mar ker SW1876.T he r esults o f phy log enet ic analy sis among different species indicated that the po rcine GS K3 gene w as mor e homo log ous to human GSK3 gene than ot her s.A cco rding to the results of tissue expressio n pattern,the ex pressive levels o f GSK3 g ene w ere differ ent in 10po rcine tissues.It expressed with the hig hest abundance in liv er and lung,follow ing them w ere adipo se,kidney,spleen, cer ebr um and cer ebellum,but it w as lit tle present in hear t,sto mach and muscle.

Key words:pig;GSK3 gene;g ene clo ning;chr omosomal mapping;tissue expressio n pattern

保存。DNA提取试剂盒、PCR试剂(T aq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP)、限制性内切酶H in d 和B am H 、DNA Marker、pET 32a载体、pM D18 T载体均购于大连宝生物公司。

1.2 引物参考GenBank中ORFV的B2L基因的全基因序列(登录号:Gu320351),设计了1对带酶切位点(下划线部分)的引物:ORFV(F):5 CGG GAT CCAT GTGGCCGTT CTCCTCCAT C 3 ,OR FV(U):5 CCCAAGCTT TT AAT TT ATT GGCT T GCAGAACT 3 ,预期目的片段为1137bp。引物由大连宝生物公司合成。

1.3 病毒DNA的抽提按DNA提取试剂盒说明书进行。

1.4 H2L基因PCR扩增按贵州省动物疫病研究所建立的方法对疑似样品进行H2L基因的扩增(向智龙等,2010),鉴定为阳性的样品用于B2L基因的扩增。

1.5 B2L基因PCR扩增 PCR反应体系如下: ddH2O33 L,10 Buffer5 L,dN TPs(各10mmo l/L)1 L,M gCl2(25m mol/L)3 L,上、下游引物(10pmol/ L)各

2.5 L,模板2 L,Taq DNA聚合酶(2.5U/ L)1 L,总体积为50 L。PCR反应条件为:94 预变性5m in;94 变性1m in,55 退火45s,72 延伸1min,35个循环;

72 延伸10min。取扩增产物10 L,于含有25 L/L Gold View的1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.6 PCR产物回收、连接、转化参照宝生物胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。连接体系共10 L:回收的PCR产物4 L,pMD18 T载体1 L, Solution 5 L,16 连接过夜;取5 L连接产物加入100 L DH5 感受态细胞悬液中,冰浴30 min,42 90s,冰浴5m in后加入LB液体培养基700 L,37 振荡培养1h;5000r/min离心10 min,弃上清液留约100 L,重悬沉淀,涂布于含Amp及X gal、IPTG的LB平板上,37 培养15h,挑取白色菌落小量培养,提取重组质粒。

1.7 克隆质粒的鉴定及测序以重组质粒为模板,进行PCR扩增鉴定,并用Bam H 和H in d 酶切(37 酶切3h)鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。取鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。

1.8 原核表达载体的构建取序列测定正确的克隆质粒用B am H 和H in d 双酶切,与同样双酶切的pET 32a载体在T4连接酶作用下16 连接16h,构建原核表达载体,转化至BL21感受态细胞中,涂布平板,37 过夜培养;挑选单菌落培养,并进行质粒的抽提,Bam H 和H in d 双酶切鉴定和PCR检测,筛选阳性克隆。取经酶切鉴定为阳性的质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果采用贵州省动物疫病研究所建立的方法(向智龙等,2010),对临床疑似病料以H2L基因特异性引物扩增,得到与预期相符的507 bp条带(图1),鉴定为ORFV阳性;对羊口疮病毒阳性样品用B2L基因特异性引物进行扩增,得到与预期相符的1137bp片段(图2)

。

2.2 克隆质粒的鉴定采用设计的特异性引物对克隆质粒进行PCR扩增,得到1137bp的片段,与预期结果一致(图3)。采用限制性内切酶H in d 和Bam H 对克隆质粒进行酶切,37 3h后,电泳分析酶切结果,结果显示约2700和1200bp两条带(图4),与预期结果相符。初步证明将B2L基因克隆至pM D18 T载体中。

2.3 重组表达质粒的鉴定结果采用设计的特异性引物对重组表达质粒进行PCR 扩增,得到1137bp 大小的片段,与预期结果一致(图5)。将重组表达质粒pET 32a B2L 用B am H 和H in d 进行双酶切鉴定,取酶切产物10 L 进行1%琼脂糖凝胶电泳,酶切结果与预期相符(图6)

。

2.4 序列测定结果将初步鉴定为阳性的质粒pM D18 T B2L 、pET 32a B2L 送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定,测序结果相同,均为1137bp(图7),该序列与Gu320351同源性为99.1%,说明成功克隆羊口疮病毒B 2L 基因,并成功构建原核

表达载体。

图7 贵州分离株羊口疮病毒B 2L 基因序列测定结果

3 讨论

本研究通过贵州省动物疫病研究所建立的方法(向智龙等,2010),对疑似病料提取DNA 进行PCR 检测,鉴定为阳性后用B 2L 基因特异性引物进行扩增、克隆及序列测定,构建原核表达载体,重组质粒

酶切和序列测定结果表明,羊口疮病毒B 2L 基因被

成功克隆到pMD18 T 载体上,并构建了ORFV

B 2L 基因原核表达载体。本研究为在大肠杆菌中表达42ku 蛋白作了充分的准备,为进一步研究羊口疮病毒B 2L 基因的理化和生物学特性,以及深入研究ORFV 的致病机理打下了良好的基础。

本研究对疑似病料针对ORFV的H2L基因进行PCR检测鉴定,是因为多次试验发现H2L基因明显敏感于B2L基因,这可能是由于ORFV的B2L基因扩增目的片段相对较大,或是两个基因在ORFV全基因序列的位置不同,或是B2L基因两条引物G+C含量不平衡(姜军平等,1996),从而造成ORFV的B2L基因PCR扩增的敏感性降低,对羊口疮病毒含量要求较高。

目前,羊口疮已广泛分布于世界各地,常呈群发性流行,对养羊业造成严重威胁,然而目前尚不清楚该病的发病机制;国内学者进行了大量羊口疮疫苗的研究(薛双虎等,1982;郭志宏等,1996)。已知囊膜蛋白与免疫有关,左玉婷等(1998)报道研制出羊口疮疱囊膜亚单位疫苗,用囊膜亚单位制剂免疫羊能有效地刺激机体产生抗全病毒抗体,免疫14d 后,血清抗体效价增高,而且还能诱导部分羊发生细胞免疫反应。因此,对B2L基因的研究将有助于对ORFV致病机理的探讨,进而为研制羊口疮基因工程疫苗奠定基础。

参考文献

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Cloning and Construction of Prokaryotic Expression Vector

of B2L Gene of O rf Virus in Guizhou

XIANG Zhi lo ng1,ZH UO Jian hua3,CH ENG Zhen tao1,2,OU De yuan1,2,

XIAN Si mei1,2,YIN Chuan bao1,H UANG Lu1,H E Cai hong1

(1.Colleg e o f A nimal Science,Guizho u U niversit y,G uiyang550025,China;

2.I nsitute of Animal Disease of Guizhou Pr ovince,G uiyang550025,China;

3.T he Bureau of L ivesto ck and V eter inar y o f Jing shan Country,Jingshan431800,China)

Abstract:T o identify suspected g oats or f case and construction o f pro kar yo tic ex pr ession vecto r o f B2L gene of or f virus (O RFV),clinical and suspect samples of o rf could be amplified by a pair of specific primer s,then the structural pro tein B2L gene of o rf virus w as amplified by P CR method using specific pr imers.T he B2L g ene w as lig ated w ith pM D18 T v ecto r and the sequencing r esult s show ed that the full length o f the inserted gene fr agment w as1137kb.Cut ting the targ et fr ag ment,w hich was clo ned into pET 32a vecto r and constructio n o f pr okary otic ex pression vecto r pET 32a B2L,the recombinant plasimid w as identif ied by restrict ion enzyme and PCR,sequence analy sis indicated that to be successful construction of pET 32a B2L expres sio n v ect or and it has laid a g ood foundation for t he ex pr ession and genetic engineer ing vaccine research.

Key words:ORF V;clo ne;pr okary otic ex pression vecto r

羊口疮的防治措施

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/1e42981.html, 羊口疮的防治措施作者：连永前来源：《畜牧兽医科学》2018年第10期摘要：羊口疮就是羊传染性脓孢性口炎、羊传染性脓孢、羊传染性脓孢皮炎，病源是口疮病毒，主要的表现为羊口腔和嘴周围皮肤发生糜烂的现象，当羊发生感染之后，羊的正常生活就会受到影响，这种疾病不仅会在羊和羊之间进行传播，还会在人畜之间进行传播，文中主要研究了羊口疮的发病病因及预防控制的方法。关键词：羊口疮;防治;措施中图分类号：S826 文献标识码：B doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.10.084 0 引言羊口疮传播的途径是急性接触。羊口疮发病的特征是口腔、口唇等地方的皮肤和黏膜因为病毒的感染而生成丘疹、脓孢、溃疡和疣状厚痂等。患病的羊发病部位在它的口唇、舌头、鼻子等，敏感的羊群发病率常常几乎是100%，病死率也会达到1/4。 1 羊疾病常见的发病原因 1.1 由生物性原因导致的羊疾病生物性因素主要包括了细菌、病毒和一些寄生虫等因素。羊传染性疾病是由于病毒和细菌等微生物进入羊的体内，这些微生物的传播性非常强，传播速度也非常快，这就导致了羊群的患病概率增加，死亡率也非常高。羊口疮病的主要表现形式是寄生虫在入侵羊体之后，它们就会吸收羊身体内的营养，并分泌出很多有害物质来破坏羊的身体结构，最终使得羊因营养不良而丧失生命活力。 1.2 非生物因素导致的羊疾病在一般情况下，非生物因素导致的羊疾病是因为饲养员饲养方式不当，造成羊群的发育速度缓慢，羊的身体机能下降，最终被疾病感染。非生物因素导致的羊类疾病一般是外科和内科方面的疾病，比如营养代谢。当羊的饲料出现问题时就容易发生内科疾病，或者一旦羊的饲料中没有丰富的物质就会导致羊的肠胃发生疾病，饲料中的营养成分过于单一，就会导致吸收的营养成分太少或者太多[1]。

EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAd Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) was

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点：标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

羊病防治技术与常用药物

羊病防治一、建立经常性消毒制度圈舍要经常清扫，保持卫生清洁、通风良好。常用消毒药物：10-20%的生石灰乳、25%的火碱溶液、30%的福尔马林液或者百毒杀等市售消毒剂。消毒次数：羊舍冬季间隔1个月，春季间隔0.5个月，夏季10天消毒1次。此外，每年春、秋季各进行一次彻底消毒。转群或出栏后，要对整个羊舍和用具进行一次全面的消毒，方可进羊。贮粪场的羊粪中常含有大量的细菌和虫卵，应集中处理。可在其中掺入消毒液，也可采用堆积发酵法，杀灭病菌和虫卵。场门、生不场区入口处消毒池内的药液要经常更换，保持有效浓度。谢绝无关人员进场，静茹生产区的人员及车辆等都要严格消毒。二、建立完善的防疫制度每年定期进行免疫接种从外地引进羊只，要经严格检疫并确认没有传染病方可进场，不从疫区购买材料和畜禽。

饲养员不得相互使用其他羊舍的用具及设备，草车、粪车要分开。患结核和布氏杆菌的人不准入场喂羊；羊场内不养猫、狗、鸡、鸭等动物；羊舍内应消灭老鼠和蚊蝇。免疫接种每年春节和秋季各免疫注射一次。预防羊快疫、猝疽、羔羊痢疾和肠毒血症。在我省较多见的羊传染病还有羊痘、传染性胸膜肺炎、羊口疮等。各地应根据疫病流行情况，按疫苗说明进行预防注射。预防羊快疫、猝疽、羔羊痢疾和肠毒血症。注射三联四防苗一次，不论大小羊一律肌注或皮下注射1毫升，注射后14天产生免疫力，免疫期1年。预防羊痘用羊痘鸡胚化弱毒苗按说明稀释，不论大小羊一律于腋下或尾内侧或腹下，皮内注射0.5毫升，注射后4~6天产生免疫力，免疫期为1年，免疫后一般无不良反应，有些羊在注射后5~8天在注射部位有小的硬结肿块，不需处理，会逐渐消失

杆状病毒表达系统简介

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。杆状病毒基因组的结构和功能研究杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角

常见羊病及其防治方法

羊主要传染病及其防治方法１、口蹄疫它是由偶蹄兽共同晚染口蹄疫病毒引起的一种急性、烈性传染病。（１）流行情况：该病侵害多种动物（羊、牛、猪、骆驼等）和人。传染源是病畜和带毒动物，经消化道和呼吸侵入，也可随空气流动传播，无季节性。（２）症状：患羊发病后体温升高到４０、５－４１、５度。精神不振，口腔粘膜、蹄部皮肤形成水疱，疱破后形成溃疡和靡烂。病羊表现疼痛，流涎，涎水呈泡沫状。常见的部位唇内面、齿龈，舌面及颊部粘膜，有的在蹄叉，蹄冠，有的在乳房，水疱破裂后眼观形成痕。羔羊易发生心肌炎死亡。有时呈现出血性胃肠炎,临床与羊传染性脓疱病鉴别：羊传染性脓疱病发生于１周岁以下的幼龄羊，特征：口唇郏部水疱、脓疱及疣状痂，在齿龈，舌面、唇内也有脓、疣状厚痂的疱，但不流涎。初期体温变化不大。（３）防治方法（一）发病后要及时上报，划定疫区，由动物检疫部门的扑杀销毁疫点内的同群易感家畜；被污染圈舍、用具，环境严格彻底消毒；封锁疫区防止易感畜及其产品运输，把病源消灭在疫区内。 (二)对威胁区的易感家畜紧急接种疫苗防止疫病的扩散。（三）该病只能预防，无治疗药品，不准治疗。 2、羊快疫本病病原为腐败梭菌引起的，发生于绵羊的一种急性传染病。

特征是发病菌突然病和被子短，真胃出血，炎性损害。（1）流行特点：腐败梭菌常以芽胞形式分布于低洼草地，耕地及沼泽之中。羊采食被污染的饲料和饮水，芽胞进入羊消化道，多数不发病。在气候骤变，阴雨连绵、秋、冬寒冷季节，引起羊感冒或机体抗病能力下降，腐败梭菌大量繁殖，产生外毒素引起发病死亡。（2）临床症状：发病突然，不见症状在放牧或早晨死亡。急性病羊表现为愿行走，运动失调，腹围膨大，有腹痛，腹泻，磨牙，抽搐，最后衰弱昏迷，口流带血泡沫。多在数分钟至几小时死亡，病程极为短促。（3）防治措施（一）该病以预防为主。用羊三联苗搞预防注射。湿苗每年春秋两次，子苗每年一次。（二）羊以舍饲为好，防止放牧时误食被病菌污染饲料和饮水。（三）注意舍内的保暖通风，饲料更换时要逐渐完成，不要突然改变。（四）治疗：可肌注青毒素每次80-160万单位，首次剂量加倍，每天3次，边用3-4天。或内服磺胺脒0。2克/公斤体重，第二天减半，连用3-4天。 3、羊肠毒血症该病由魏氏梭菌，又称产产所黄膜杆菌引起的一种急性毒血症。死后肾组织易于软化，又称软肾病。

常见羊病防治-最新

常见羊病的诊断与治疗大严备村农民实用技术资料

我县常见羊病的诊断及治疗常见羊病防治羊在生长发育过程中，可以发生各种各样的疾病。在性质上可以分为传染病、寄生虫病和普通病三大类。传染病是由于各种致病性病原微生物侵入羊体内生长、繁殖并产生毒素而导致的。寄生虫病是各种体内外寄生虫侵害羊体，通过虫体对羊的器官、组织的机械性损害，夺取羊体营养并产生有害毒素而导致的。普通病包括内科疾病、外科疾病和产科疾病，多因饲养管理不当，营养代谢失调，误食毒物，机械性损伤，异物的刺激以及外界环境变化而引起。为防止各种疾病的发生，必须坚持以预防为主的方针，加强饲养管理，严格执行各种卫生防疫制度，落实各种综合性防治措施，将饲养管理和疫病防治工作紧密结合起来，以取得防病灭病的综合效果，保证肉羊生产健康顺利的发展。防治基本技术1.判断：羊是否患病饲养管理人员平时应注意观察个别羊只甚至整个羊群的行为变化，整体上一般观察羊的肥瘦、步态、姿势，从羊的个体上主要观察被毛、皮肤、粘膜、结膜、食欲、粪尿、呼吸、体温的变化等，以确定羊是否有病，并及时诊治。肥瘦：慢性消耗性疾病，由于病原的长期作用，病羊的身体瘦弱。

姿势：观察羊只的举动是否与平时一样，如果不同，就可能是有病的表现。步态：健康羊步态活泼而稳定，病羊则行动不稳，或不愿行走。被毛：健康羊的被毛平整且不易脱落，富有光泽；而在患病状态下，被毛粗乱蓬松，失去光泽，容易脱落。皮肤：健康羊的皮肤富有弹性。观察羊只皮肤的颜色及有无被毛脱落、皮肤变厚变硬、水肿、发炎、外伤等。粘膜：健康羊的钻膜呈光滑的粉红色。如果可视粘膜发红.则可能体温升高，体内有发炎的地方；如果粘膜发红并带有红点、血丝或呈紫色，可能是由中毒或传染病引起的。食欲：羊吃草或饮水量突然增多或减少，以及喜欢舔泥土、吃草根，也是有病的表现，可能是慢性营养不良，如维生素或微量元素缺乏等。如果反色减少、无力或停止，则表示羊的前胃有病。有时羊不进食可能是由口腔疾病引起的，如喉炎、咽炎、口腔溃疡、舌有损伤等。粪便：如果羊粪有特殊臭味，则见于各种肠炎，若粪便内有大量粘液，则表示肠道有卡他性炎症；若粪内有完整的谷粒或纤维很粗，则表示消化不良；若混有寄生虫或寄生虫节片，则表示体内有寄生虫。呼吸：正常羊每分钟呼吸12?20次，呼吸次数增多见于热性病、呼吸系统疾病、心脏衰弱、贫血、腹内压升高等，呼吸次数减少，主要见于某些中毒、代谢障碍、昏迷等疾病。体温：用手摸耳朵或把

腺病毒重组系统

腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目录第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则5 4.2.2 共转化方法5 4.2.3 预期结果5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常用技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10 5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14

5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表达26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对 BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 Hr Hour 小时 ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobases 千碱基对 KDa KiloDaltons 千道尔顿

杆状病毒表达系统00000001

昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 ●杆状病毒表达系统介绍 ●杆状病毒蛋白表达系统的优势 ●杆状病毒表达载体系统（BEVS） ●杆状病毒表达宿主细胞 ●表达优化条件 ●翻译后修饰对蛋白表达的影响 ●高通量表达 ●总结

杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期 ●早期（0‐6h PI） ?核衣壳迁移到细胞核 ?病毒DNA释放 ?开始早期基因表达 ●晚期（6‐24h PI） ?更多DNA复制 ?新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 ?的过程中得到囊膜蛋白 ?产生新的出芽病毒 ●极晚期 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia ?出芽病毒减少 ?核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs ?MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。

克隆载体与表达载体教程文件

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan）克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。

羊口疮有效的防治措施 ,和治疗方案

羊群在冬天以及春秋季总是会出现这样那样的疾病，羊口疮是养羊户比较熟悉的羊群疾病之一，具体的防治措施是什么？这是今天小编要为大家介绍的，相信很多的养羊户对它是非常有兴趣！羊口疮多发生于春秋季节，多感染3-6个月龄的羔羊，成年羊也会感染，呈散发性流行。幼羊首先发病，一周内迅速传给全群。羊群一旦感染即常年发病，可在羊群中连续危害多年，十分烦人。病羊和带毒羊是主要的传染源。主要通过受污染圈舍以及草地、用具或者皮肤擦伤来进行传播，哺乳母羊的乳房也可能同样患病，主要是由于小羊咬而感染！为了避免整个羊群的感染，我们要严格执行检疫制度 1、在饲养过程中要严格执行自繁自育的原则，如果要从异地引种，禁止从发生过羊口疮病的地区引种，对于新引进的种羊应该进行全面而细致的检查，将其至少隔离观察一个月之后，确定健康之后再混入羊群中，并做好羊蹄的消毒工作。如何防治：治疗时每吨饲料中添加羊全清2000g，连用5-7天，病发症状基本消失预防时每吨饲料中添加羊全清1000g，连用3-5天，也可长期添加。备注：本品不含任何违禁成分，绿色、环保、安全、健康，可长期添加使用。2、严格执行消毒制度在羊饲养过程中，要每天对羊舍清扫一遍，对于羊粪便、垫草应该及时的清理出去，并对这些东西做好发酵处理，同时，还要做好圈舍的消毒工作，应该每隔两天用生石灰或者其他消毒剂对羊舍进行全面的消毒，尤其是要做好圈舍、饲养器材的消毒处理工作，防止羊的饮用水被污染。 3、加强饲养管理在饲养过程中，应该防止羊的皮肤和粘膜受到损害，在羊运输过程中，应该避免羊因为拥挤而产生擦伤，异地引种的羊群当达到目的地之后，应该及时的引用清洁的饮用水。在饲养防治过程中应该尽量避免在雨天放牧，避免带有尖刺的异物混入到垫草和草料中。羊舍的修建应该全面和牢固，饲喂应该科学合理，饲料应该不变质，切实提高羊的抵抗能力。同时在饲养过程中，应该做好羊口疮病的疫苗接种工作。羊群发生口疮是非常麻烦的事情，为了减少羊群损失，更好的养羊，养羊户在养殖过程中一定要做好预防工作，尽量自繁自育，减少羊群染病的可能性。想要了解跟多的养羊知识，请关注我们。

春季常见羊病及防治技术

春季常见羊病及防治技术羊痘是一种由痘病毒引起的热性接触性传染羊病。病羊皮肤和黏膜上发生特异的痘疹，个别羊发病后很快蔓延全群。该病主要通过呼吸道感染或由损伤的皮肤黏膜侵入，多在冬春季节流行，饲养管理不好可促使发病。羊病预防加强饲养管理，抓好膘情，冬春季节适当补饲，注意防寒保暖。每年定期预防注射羊痘鸡胚化弱毒疫苗（山羊痘）。对发病羊进行隔离，对未发病羊紧急注射疫苗，病死羊尸体深埋，防止扩散病毒。羊病治疗大羊用鱼腥草注射液10毫升、地塞米松注射液5毫升，小羊用鱼腥草注射液5毫升、地塞米松注射液2毫克，混合一次肌肉注射，每天注射两次，连用1～3天。寄生虫病羔羊的体外寄生虫主要有疥癣、虱蝇，体内寄生虫主要有线虫、绦虫等。防治寄生虫病的基本原则：外界环境杀虫，消灭外界环境中的寄生虫病原，防止感染羊群；消灭传播者蜱和其他中间宿主，切断寄生虫传播途径；对病羊及时治疗，消灭体内外病原，做好隔离工作，防止感染周围健康羊；对健康羊进行化学药品预防。根据寄生虫普遍存在的特点，每年定期驱虫。通常每年4～5月及10～1 1月各驱虫1次。还可用辛硫磷（浓度为0.25%～0.5%）、林丹乳油（浓度为0. 025%）、倍特（50～80PPm）5%的溴氰菊酯水剂对羊进行药浴。一、体内寄生虫的驱除计划：（一）绦虫。每年春、夏、秋三季各驱虫1次，用硫双二氯酚（别丁）按每公斤体重80～100毫升配成混悬剂灌服。（二）线虫。每年春、秋两次或每个季度1次驱虫。常用药物：左旋咪唑，按每公斤体重8～10毫升溶水灌服。阿维菌素注射液，按每公斤体重0.2毫克肌肉注射。丙硫苯咪唑，按每公斤体重5～10毫克灌服。二、驱除体外寄生虫，可在每年春、秋两季，用阿维菌素注射液按每公斤体重0.2毫克皮下注射，或用阿维菌素预混剂，按每1000公斤饲料中混用2克，连用7天。三、羊病使用驱虫药物注意事项：（一）丙硫苯咪唑对线虫、吸虫和绦虫都有驱杀作用，但对疥螨等体外寄生虫无效。用于驱杀吸虫、绦虫时比驱杀线虫时用量应大一些。有报道，丙硫苯咪唑对胚胎有致畸作用。所以，对妊娠母羊使用该药时要特别慎重，母羊最好在配种前驱虫。（二）有些驱虫药物，如果长期单一使用或用药不合理，寄生虫对药产生了抗药性，有时会造成驱虫效果不好。抗药性的预防可以通过减少用药次数，合理用药，交叉用药得到解决。（三）目前阿维菌素的剂型有片剂、散剂、针剂等。有些制品是用菌丝体甚至用药物残渣制成，有的注射液不是缓释制剂，药效不是28天，隔5～6天需要再注射1次。

常见羊病及其防治方法

常见羊病及其防治方法文档编制序号：[KKIDT-LLE0828-LLETD298-POI08]

2、羊快疫本病病原为腐败梭菌引起的，发生于绵羊的一种急性传染病。特征是发病菌突然病和被子短，真胃出血，炎性损害。（1）流行特点：腐败梭菌常以芽胞形式分布于低洼草地，耕地及沼泽之中。羊采食被污染的饲料和饮水，芽胞进入羊消化道，多数不发病。在气候骤变，阴雨连绵、秋、冬寒冷季节，引起羊感冒或机体抗病能力下降，腐败梭菌大量繁殖，产生外毒素引起发病死亡。（2）临床症状：发病突然，不见症状在放牧或早晨死亡。急性病羊表现为愿行走，运动失调，腹围膨大，有腹痛，腹泻，磨牙，抽搐，最后衰弱昏迷，口流带血泡沫。多在数分钟至几小时死亡，病程极为短促。（3）防治措施（一）该病以预防为主。用羊三联苗搞预防注射。湿苗每年春秋两次，子苗每年一次。（二）羊以舍饲为好，防止放牧时误食被病菌污染饲料和饮水。（三）注意舍内的保暖通风，饲料更换时要逐渐完成，不要突然改变。（四）治疗：可肌注青毒素每次80-160万单位，首次剂量加倍，每天3次，边用3-4天。或内服磺胺脒0。2克/公斤体重，第二天减半，连用3-4天。

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白 Ξ 罗廷荣1　源宣之2　金城俊夫2(1　广西大学动物科技学院,南宁530005;2　日本岐阜大学农学部兽医公共卫生学研究室) 摘要　本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖(G )蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL 株G 蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9细胞中,分离出2个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA )从重组杆状病毒感染的Sf 9细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf 9细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL 株感染NA 细胞的G 蛋白的分子量一致。35个抗RC HL 株G 蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9细胞反应,表明表达的G 蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G 蛋白主要分布在Sf 9细胞的膜表面,形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL 株感染的NA 细胞的荧光相同。关键词　狂犬病病毒;糖蛋白;重组杆状病毒中图分类号　S 852165911;S 8521655 Expression of Glycoprote i n of Rab ies V irus Usi ng Baculov irus Vector L uo T ingrong 1　M inam o to N obuyuk i 2　K in jo To sh i o 2(1　Co llege of A n i m al Sciences and T echno logy ,Guangx i U n iv .,N ann ing 530005 2D ep artm en t of V eterinary Pub lic H ealth ,Facu lty of A gricu ltu re ,Gifu U n iversity ,Japan )Abstract In th is exp eri m en t w e have successfu lly exp ressed rab ies vivu s glycop ro tein (G p ro tein )u sing bacu loviru s vecto r .Tw o clones of recom b inan t bacu loviru s w ere iso lated from Sf 9cells ,in w h ich w as tran sfeted w ith DNA of w ild typ e bacu loviru s and bacu loviru s tran sfer vecto r in 2serted G p ro tein gene of RC HL strain u sed fo r p roducti on of an i m als rab ies vaccine in Japan .B y u s 2ing w estern b lo t and indirect i m m unofluo rescen t assay (IFA ),the G p ro tein of rab ies viru s w as detect 2ed from Sf 9cells w h ich w ere infected w ith recom b inan t bacu loviru s .T he G p ro tein in Sf 9cells ex 2p ressed by recom b inan t bacu loviru s show ed iden tical m o lecu lar w eigh t w ith that in NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies vru s .T h irty five m onoclonal an tibodies (M A b s )again st G p ro tein of RC HL strain reacted w ith G p ro tein on the Sf 9cells infected w ith recom b inan t bacu loviru s ,indi 2 cating that an tigen ic variati on of the exp ressed G p ro tein has no t been found .M ajo rity of the exp ressed G p ro tein ex ists on the su rface of Sf 9cells ,fluo rescence of the Sf 9cells fo r m ed a ring like w hen it infected w ith recom b inan t bacu loviru s and w as dyed by IFA .T h is k ind of fluo rescence on the Sf 9cells w as the sam e as that on NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies viru s u sing IFA . Key works rab ies viru s ;G p ro tein ;recom b inan t bacu loviru s 狂犬病毒的糖(G )蛋白有多种功能:刺激中和抗体的产生而诱导免疫保护、细胞融合性、与细胞表面受体结合、血球凝集和免疫溶解。近年来,根据不同的目的,狂犬病毒的G 蛋白基因已在不同的载体系统被表达,其中包括大肠杆菌系统、酵母系统、禽痘病毒和牛痘病毒载体系统。引人注目的是,第18卷　第4期V o l 118N o 14广西农业生物科学Journal of Guangxi A gric .and B i o l .Science 1999年12月　D ec .1999　 Ξ第一作者:男,1962年生,博士,副教授。收稿日期:19990402

杆状病毒表达系统及其应用进展

综述与专论生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第10期杆状病毒表达系统及其应用进展韦永龙李轶女张志芳沈桂芳 (中国农业科学院生物技术研究所,北京100081) 摘要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。关键词: 杆状病毒 BEVS 表达 Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng (B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081) Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e . K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on 收稿日期:2010 04 26 基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863?计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n 杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约 80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1] 。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V ) 和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2] 。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。 1 重组杆状病毒的构建和纯化最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的