Chelex-100法提取生物检材中的DNA

一、原理

当检材较少时或者基因分型只需要少量的DNA时，可以用Chelex-100提取方法提取DNA。Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力．能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合

金属离子，防止DNA降解。

二、实验目的

掌握各种法医学生物检材DNA提取方法。

三、仪器设备

干热器、恒温水浴箱、高速离心机、离心管

四、试剂

Chelex-100法提取生物检材所需试剂的配制

1． 5％ Chelex-100 （w/v）

称取5克Chelex-100，加100ml灭菌纯水，放4℃保存。

2． 10％ SDS

称取10克优级纯的SDS，加纯水到100ml溶解，室温保存。

3． 5mg/ml PK酶（蛋白酶K）

称取5mg PK酶，溶于1ml灭菌纯水中，－20℃保存。

4． 1M DTT (二硫苏糖醇)

称取154.3mg DTT加1ml灭菌纯水溶解，－20℃保存。

五、实验方法---Chelex-100法

1.全血

1) 取3～10μl全血加到0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，室温

下放置15分钟。

2) 13,000rpm离心3分钟，去上清，收集沉淀。（必要时可用蒸馏水反复洗沉

淀物，直至无色或血色素很少）。

3) 沉淀中加入200μl 5％ Chelex-100溶液（5％ Chelex-100为悬浊液，使用前要充分振摇，使Chelex-100颗粒悬浮），在振荡器上反复振荡，放入56℃保温30分

钟以上。

4) 取出后振荡，100℃保温8分钟，振荡后，13,000rpm离心3分钟，上清用

于PCR扩增，或放4℃保存备用。

2．血斑

1) 剪取约0.5cm2的血斑，加到0.5ml的离心管中，加入500μl纯水，剧烈振荡，室温放置15分钟。13,000离心3分钟，去上清。（可用纯水反复洗至无色，载体不需

去除，始终留在离心管中。）

2) 以下步骤同全血的提取方法。

3．混合斑

1) 取适量含有混合斑的检测，剪碎后放入5ml小烧杯中，加入3ml纯水、300μl 10% SDS及150μl 5mg/ml 的PK酶，用牙签搅拌后，放入37℃水浴6小时以上（最好过夜）。

2) 将水浴好的检材移入1.5ml离心管（检材载体用一次性注射器挤压后去除），13,000rpm 离心3分钟，去上清，每管加1.4ml 纯水，振荡，13000rpm 离心3分钟。

洗三次后，移入0.5ml离心管中，13000rpm离心3分钟，弃上清。

3) 向沉淀物的离心管中加入200μl 5％的Chelex-100（可根据检材量的多少进行调节），4μl 5mg/ml 的PK酶及8μl 1M的DTT（PK酶及DTT的终浓度分别为100μg/ml 和0.039M），振荡后56℃保温过夜。次日取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm 离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

4．含有唾液斑的检材

1) 唾液斑：处理方法与血斑的处理方法相同。

2) 烟头：用镊子夹住烟头，剪刀剪下烟头外圈的纸，剪碎后放入0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，13000rpm离心3分钟，弃上清，加入100μl 5％的Chelex-100，放入56℃保温30分钟以上。取出振荡，100℃保温8分钟，13000rpm离心3

分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

3) 口香糖：将口香糖剪碎后放入0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，13000rpm离心3分钟，弃上清，加入100μl 5％的Chelex-100，放入56℃保温30分钟以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增

或放4℃保存备用。

5．毛根

用镊子夹住毛发的根部，剪去其余部分，将毛根放入0.5ml离心管中（处理毛发时很容易遗失，应小心操作，最好在桌面上铺一张白纸。），加人纯水洗一次，然后加入30μl 5％的Chelex-100和2μl 5mg/ml 的PK酶，放入56℃保温6小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

6．肌肉与脑组织取小米粒大小的肌肉或脑组织，放入0.5ml离心管中，加人纯水洗一次，然后加入200μl 5％的Chelex-100和 5μl 5mg/ml 的PK酶，放入56℃保温

3小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩

增或

放4℃保存备用。

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较学号

学校代码学号分类号密级本科毕业论文学院、系环境与资源学院专业名称环境科学年级2010级学生姓名指导教师 2014年5月

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较摘要环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化

Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification

常见生物检材的提取

常见生物检材的提取（一）血液及血痕的提取 1.各种纺织物品上的遗留血痕，小件上的可以整件提取。如不便整件提取或血痕附在较大件的纺织物品上，可以将血痕剪下送检，并记录其所在部位。 2.树叶、草叶、禾杆等小件载体上附着的血痕均可以整件提取送检。较大的木质类载体上的血痕，可根据载体的情况采取切削薄片状部分或锯掉端、角处等方法提取有血部位的检材。 3.光滑水泥地面、铁木器具、漆面上、玻璃上、陶瓷、塑料、光洁的金属物品等质地致密的载体上的血痕检材，除附在较小、易于提取的物品上可以整件包装送检，否则均需要擦拭或刮取。擦拭方法是根据血量的多少，准备适量的纱线或棉签，用蒸馏水浸润(不要留多余水分)后仔细擦拭血痕，将血痕全部转移，阴凉处晾干。记录提取部位后包装送检。 4.质地松软的载体如沙灰墙、泥土中的血痕的提取：将血痕尽量全部提取并尽可能少混带载体物质。如果沙灰墙上的血痕只能刮下送检，刮下的时候应尽量将全部血痕刮下不混或少混沙灰。泥土上血痕尽量挖出带血的完整土块，勿使土块破碎，包装勿挤压冲撞。 5.较小凶器上血痕应整件送检或分段提取，较大凶器上血痕可按在较硬载体上的血痕提取法提取血痕，分段提取，并记录提取部位。 6.身体上附着血痕的提取：在皮肤表面的血痕可以用纱线转移提取；在指甲缝中的血痕、组织提取送检时，可将指甲小心剪下，分别包装送检。 7.有关人员的对照血样的提取：可从耳垂、指尖或静脉取血，直接涂于干净纱布、滤纸或其它认可采血材料上，阴凉处晾干，做好标签后送检。 8.在尸检时提取尸体血样，未腐败尸体取心腔血，腐败尸体取末梢静脉血，涂在纱布上制成血斑。 9.通过血液检验鉴定亲子关系，取未稍血制成血斑即可。 10.在发生案件现场留有尚未干固的血迹，用纱布直接提取，阴干。（二）精斑的提取 1.衣物、被褥等各种织物及卫生纸上遗留的可疑精斑提取的方法与相同载体上血痕的提取相一致，注意做好记录。 2.被害人阴道内、外的精斑的提取一般用纱布块、棉球擦取。纱布块不要太大，提取时需注意先外后内，分段提取。检材提取后于阴凉处晾干，做好记录后送检。 3.野外强奸现场的精斑常遗留在树枝、草、禾杆等植物或土地上。在植物上的取整件或取精斑遗留处的枝段送检，遗留在土地上的按遗留在土地上的血痕的提取方法提取。 4.遗留在较硬载体上的精斑提取法与血痕提取法相同。 5.涉嫌强奸的案件在送检精斑时需提取被害人、嫌疑人及有关人员(丈夫)等的血斑一并送检。 6.可疑口交或鸡奸案件的活体和尸体均用纱布块擦拭口腔或直肠提取，阴凉处晾干，装入标准的物证袋内。 7.对强奸案的犯罪嫌疑人可以用湿润纱布或棉拭子擦拭阴茎或提取犯罪嫌疑人的内裤等。 8.留有精斑的衣物已浸泡在水中，尚未清洗的，亦应提取晾干送检。（三）唾液斑提取 1.新鲜唾液的提取：让提供唾液者清水漱口后目视酸性果品，待唾液自然流出1～2mL，收集在洁净的试管或小烧杯内，置冰冻保存，做好标记。 2.唾液斑提取：或按前述方法将提取的唾液用纱布吸敷后自然晾干，或唾液供者清水漱口后取5×5平方厘米纱布块放入口中，待其浸湿后取出晾干，装入物证袋。

磁珠法土壤基因DNA提取试剂盒

磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit ［目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C；【保存条件】磁珠分散液2~8 C；蛋白酶K -20 C；其它组分室温保存; 【试剂盒组成】【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，以免磁珠受到损害，使用前务必充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀，如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至液体澄清； 3. 蛋白酶K长期不使用，请置于-20 C保存，融化后4C保存，并尽快使用；【产品简介】本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液

体系，在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合，经过清洗和洗脱等步骤之后，可去除土壤中的杂质与腐植酸，获得高质量基因组DNA产物，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。【试剂盒说明】【自备仪器、耗材和试剂】手动普通版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管（2.0mL ）、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0）。手动高通量版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 ）。【手动普通版】本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中，依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K，涡旋振荡1~3min，将土壤样本分散均匀，58 C温浴10min，期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。注：1）如需去除RNA，请额外加入5 RNase A溶液；2）干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒，有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液室温、12000rpm将EP管离心5min，然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2，颠倒混匀，再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合转移全部上清液至另一只2.0mLEP管，依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液（提前摇晃均匀），涡旋振荡5min。 4. 磁性分离将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全，如EP管内盖有残留磁珠，可保持EP管

dna粗提取的实验步骤

实验步骤——以洋葱为实验材料： 1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L 的氯化钠溶液，充分研磨。洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。 2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。 3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。实例: 用鸡血细胞液粗提取DNA 并鉴定步骤 1、提取鸡血细将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好) 5~10mL，注入到50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL 的烧杯中，取其滤液。图示胞的细胞核物质 2、溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液40 mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA 在溶液中呈溶解状态。 3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 5、将DNA 的粘稠物再溶解取一个50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中)。 7、提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95% 的酒精溶液50 mL(加入时动作要慢)，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/ L 的NaCl 溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

土壤DNA提取

1 试验材料吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、 SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h，每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶1），混匀后12000r/min 离心10min，取上清→加入2 倍体积的无水乙醇，静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min，收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。

实验 __DNA的粗提取与鉴定

实验 DNA 的粗提取与鉴定教学目的 1．初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2．观察提取出来的DNA 物质。实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使DNA 充分溶解而使杂质沉淀或DNA 沉淀而杂质溶解。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA 对蛋白酶、高温和洗涤剂（可以溶解细胞的细胞膜，除去脂质和蛋白质，而对DNA 没有影响）都具有较好的耐性。 4． DNA ＋二苯胺?? →?沸水浴蓝色（用于DNA 的鉴定）实验材料：鸡血细胞液（5-10ml ），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml 的柠檬酸钠溶液(抗凝剂)，物质的量浓度分别为2mol/l 和0.015mol/l 的氯化钠溶液，二苯胺试剂实验步骤 1．材料制备 0.1g/ml 柠檬酸钠100ml 置于500ml 烧杯内→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清液→即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀）活鸡血180ml

[思考]为什么要除去血液中的上清液？ 2．方法步骤取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质（1）提取鸡血细胞的细胞核物质原理：血细胞吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L）（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上（5）DNA粘稠物再溶解：在50ml的烧杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，缓慢搅拌3 min 使上述粘稠物尽量多的溶解在溶液中。（6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋冷却的95%的酒精50ml，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。（8）DNA鉴定：

现场法医物证检材的发现和提取心得体会

现场法医物证检材的发现和提取心得体会主任法医师为我们带来了《现场法医物证检材的发现和提取》的精彩讲座，使我受益良多。法医物证检材是指来源于案（事）件现场，并可进行法医物证、DNA检验，从而能为侦查提供线索、为法庭提供证据的生物样本，或含有、承载可进行法医物证、DNA检验的生物样品的物品。物证检验的基本过程包括从发现检材到检验、做出鉴定结论的全过程，主要分为两个阶段。第一阶段主要在案件勘查或案件调查过程中完成，通过对案件发生现场，犯罪嫌疑人住所、活动场所、衣物、用品等进行勘查，对发现的检材进行观察、记录、拍照、录像并制定恰当的采集、保存方案。第二阶段为实验室检验鉴定，这一阶段是对现场收集的可疑样品及举证需要的参考样品进行检验，重点解决个体识别，即判断现场采集的法医物证检材来自何人。法医物证检材包括人体各种体液与组织，具有容易变性、变质、降解和腐败的特点。在物证鉴定中，处理各类陈旧、腐败检材，解决检材本身的不确定性是鉴定成功的关键。因此，在检材送达实验室检验鉴定之前，办案人员应该尽量保存好法医物证检材，尽量缩短送检时间。一、检材发现 1.现场勘查过程中，全面仔细搜寻检材非常重要 2.发现检材，第一时间原位拍照或拍摄录像资料，结合测量、绘图等手段详细记录现场原始状态 3.在进行详细记录后，方可移动和提取检材 4.应力求做到全面、充分和仔细 5.要注意改善照明条件，仔细观察拐角、缝隙等隐蔽部位（一）血痕薄层血痕，为褐色斑痕，局部量大的血痕形成暗褐色血痂。血痕常可见于现场地面、墙面、墙角、家具、衣服、鞋袜、被褥、蚊帐、凶器、石块、砖头、泥土、木棒、工具、窗台、窗玻璃、门把手、水龙头开关、植物叶茎表面、头发、指甲缝等处。作案人处理过的现场，特别注意观察家具脚、缝隙，家具下的地面，家具挡住的墙角，木板缝隙，垃圾桶内外壁、桶底，照明不好的地面，墙面等地方。仔细观察现场和嫌疑人住所找到的各种刀具、工具的凹槽、缝隙，鞋底和鞋面缝隙。对交通肇事逃逸的车辆，仔细观察轮胎、车底盘、挡泥板、撞击变形处附近等隐蔽部位。现场勘查过程中应配备便携式照明工具。黑暗现场的血痕，可用鲁米诺（luminol）喷雾寻找，血痕发荧光。（二）精斑性犯罪案件必须常规提取受害人阴道拭子。现场的精斑可出现在于受害人衣裤、卫生巾、被褥、手帕、卫生纸、草席，及受害人腹壁、大腿、阴毛等处。精斑的形状不规则，颜色因附着物不同而有所差异，在白色的衣裤或床褥等布类物品和卫生纸上，呈淡黄色不规则型，周边颜色稍深，触之较无斑痕处更硬。浓稠的精斑呈灰白色糨糊状痂块。深色布上的精斑不易发现，在质料松软的深色布料上的精斑，触感发硬明显。精斑在紫外线灯光下呈银白色带淡紫晕的荧光。受害人对案件发生过程的描述对发现精斑有非常重要的意义。根据受害人提供的情况可对重

土壤总DNA的几种提取方法

土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤：取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3）称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻

实验6 动物肝脏中DNA的提取

实验六：动物肝脏中DNA的提取及定量测定一、实验目的 1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 2、了解常见生化组分提取技术。 3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。二、实验原理核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA 主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS 或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl)，但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。 DNA(脱氧戊糖基) [H+]HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺蓝色化合物在DNA浓度为20~200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。三、实验器材猪肝，分光光度计（595nm），比色杯，匀浆器，量筒（50ml、10ml），离心机(5000r/min)，离心管，试管及试管架，移液管（1.0ml、2.0ml、5.0ml），恒温水浴锅四、实验试剂氯化钠，柠檬酸钠，95%乙醇，SDS，氯仿，异戊醇，二苯胺试剂，DNA标准溶液（200μg/m1），二苯胺试剂等。五、实验操作 1、配制溶液： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（2.925g氯化钠，20.85g柠檬酸钠，溶解于500mL 蒸馏水）。氯仿-异戊醇混合液：按照体积比20:1配制500mL。 5％SDS溶液：10g SDS溶于200ml水中。二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）5克溶于500ml 分析纯的冰醋酸中，再加入50ml过氯酸(A.R，60％以上)，混匀待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6％乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用)，贮于棕色瓶。 2、称取猪肝2g，用匀浆器磨碎(冰浴)，加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min，弃上清；沉淀中再加入6ml缓冲液，于4000r/min离心10min；取沉淀。

湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术

微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.360docs.net/doc/1c96168.html, 基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.360docs.net/doc/1c96168.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24 摘要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树

dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。（2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。（3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀（4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h；（4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。（4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。（6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。（7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。（8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。（11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。（12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。（13）-20℃保存备用。 1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增（1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

实验室土壤DNA提取方法

改良CTAB-SDS法 1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA； 0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。），在漩涡震荡仪上混匀。 2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。 3、加入20％ SDS缓冲液溶液100μl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min，取上清。 4、剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。 5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。 6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。 7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30μl ddH 2 O溶解。 8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光密度值。以OD 260/OD 280 （DNA/蛋白质），OD 260 /OD 230 （DNA/腐植酸）比值检测DNA纯度。 DNA浓度=OD 260 值×50μg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]

实验一 DNA提取

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明货号：D2600 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。试剂盒内容：D2600-50T D2600-100T 溶液A25ml50ml 溶液B3ml6ml 溶液C5ml10ml 溶液D10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个收集管50个100个 PCR增强剂500ul1ml 说明书1份1份注：试剂盒开封后溶液A、B、C、D需在2-8℃保存。PCR增强剂-20℃保存。产品简介: 本试剂盒适合于从褐土、淤泥、火山灰等各种极端土壤环境中提取微生物DNA。对土壤中各种细菌、真菌有很好裂解效果，最大限度的保留了微生

物DNA的多态性。本试剂盒采用我公司特有的腐殖质吸附材料，可高效专一的去除各种腐殖质成分而丝毫不会影响DNA的产率，纯度较酚、氯仿抽提法提高数倍。使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、称取土壤样本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入450ul溶液A震荡混匀。 *也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管)，加入450ul溶液A剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果最佳。 2、加入50ul溶液B充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，65℃水浴6min，每2min充分颠倒混匀一次。 3、加入100ul溶液C充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，12000rpm离心10min。 4、将上清转移到新的离心管，12000rpm离心2min。 5、在吸附柱中加入200ul溶液D，将离心后的上清加入到带有溶液D 的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000rpm离心1min。 6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须)，12000rpm离心1min。