小麦RIL群体SSR标记偏分离的遗传分析
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(5):828~833
*基金项目： 国家重点基础研究发展规划项目 （973） 项目 （No.2001CB1088和 No.2007CB1090） 资助。 **同为第一作者。
***通讯作者。Author for correspondence.副教授， 主要从事小麦遗传育种研究。Email:
2007-03-05 接受日期：
2007-04-02 ·研究论文
· 小麦 RIL 群体 SSR 标记偏分离的遗传分析 *
刘 刚 1 **,许盛宝 1 **,倪中福 2 ,李 晶 2 ,秦丹丹 2 ,窦秉德 3
,彭惠茹 2 ***,孙其信 2 （1.新疆农业大学农学院， 乌鲁木齐830052； 2.中国农业大学植物遗传育种系， 北京 100094；
3.淮阴师范学院植物生物技术研究所，
淮安 223300） 摘要：
以普通小麦( )3338 与斯卑尔脱小麦(
)Altgold 杂交得到的 F 6 重组近交系群体为材料，
筛选 出334个 （271 个 SSR 和 63个 EST-SSR 标记） 多态性标记， 以此为基础构建了一个包含 287个分子标记的遗传图谱。对这些 多态性标记进行偏分离分析， 发现 82个表现为偏分离 （ ＜0.05）， 其中 70个可以定位到遗传连锁图谱中。这些偏分离标记中 有33个标记位点偏向母本 3338，
占 40.2%， 49个标记位点偏向父本 Altgold ， 占 59.8%。这些偏分离标记在图谱上的分布有两 种： 成簇分布和孤立位点的偏分离。在 5条不同染色体上发现6个偏分离热点区域， 这些偏分离热点区域的形成可能与配子体 选择有关。
关键词： 小麦； 偏分离； 分子标记； 重组近交系
中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2007)05-0828-06
Genetic Analysis of Segregation Distortion of Molecular
Markers in Wheat RIL Population
LIU Gang 1 **,XU Sheng-bao 1 **,NI Zhong-fu 2 ,LI Jing 2 ,QIN Dan-dan 2 ,DOU Bing-de 3
,
PENG Hui-ru 2 ***,SUN Qi-xin
2
Using a RIL population derived from a cross between a common wheat ( )3338and Spelt wheat (
)Altgold,a genetic linkage map was constructed comprising of 287out of totally 344polymorphic markers (271SSR and 63 EST-SSR markers).Among the 334polymorphic markers,82markers showed the significantly segregation distortion ( ＜0.05),fa- voring either the marker alleles of female parent 3338(33,40.2%)or male parent Altgold (49,59.8%).Segregation distortion marker distribution along the present molecular maps of wheat was far from uniform,with clusters of tightly linked loci and single marker.Six segregation distortion regions (clusters of 3～6markers)were detected on 5chromosomes,indicating that possible causes for segrega- tion deviation of molecular markers are gametic
selection.
wheat?segregation distortion?molecular marker?RIL
偏分离是指在一个分离群体中观察到的基因型
比例偏离预期的孟德尔分离规律的现象 (Lu , 2002)。偏分离广泛存在于生物体中， 是生物进化的 主要动力之一。几乎所有类型的杂交分离群体都能 发现偏分离现象(Xu
,1997)。偏分离的遗传基
础尚不清楚，配子体和合子选择 (Perfeectti and Pascual,1996)和染色体重排
（Tanksley ,1984）
可能是引起偏分离的主要原因。
近年来， 在水稻 (Xu
,1997； Matsushita ,2003?Zhao ,2006)、 玉米 (Lu ,2002? 严
建兵等，
2003)、大豆（张德水等， 1997；刘峰等， 2000）、 大麦 （Konishi
,1992） 以及燕麦 (Pawlowshi ,1998)等多种作物遗传图谱的构建 过程中均发现了大量分子标记异常分离现象，影响
第 5期 刘 刚等:小麦RIL群体 SSR标记偏分离的遗传分析
到图谱质量及有关基因的定位工作。 在小麦中， 分子 标记偏分离现象在种间及品种间杂交分离群体均有 报道（(Liu and Tsunewaki,1991?Blanco ,1998? Messmer ,1999； Paillard ,2003)，但不同群 体偏分离的特点不同，而且对小麦偏分离热点区域 报道较少。
本研究以普通小麦 ( )3338和 斯卑尔脱小麦 ( )Altgold为亲本构建的包含 188个株系的重组近交系群体为材料，筛选出 334个 （271个 SSR和 63个 EST-SSR标记） 在亲本间存 在多态性的分子标记， 构建了遗传连锁图谱， 并对这 些 SSR及 EST-SSR分子标记进行偏分离分析， 以 期为小麦偏分离规律的研究提供有益资料。
1材料和方法
1.1 材料
供试材料为中国农业大学小麦组构建的重组自 交系群体。其构建过程为：以普通小麦(
)3338为母本，斯卑尔脱小麦 ( ) Altgold为父本配制杂交组合， 种植 F1， 从 F2开始， 采用单籽粒传法 （single seed descent） 进行繁殖， 获 得 188个稳定株系。用 CATB法提取提取亲本及 F
6
RIL群体 DNA (方宣钧等， 1999)进行 SSR和 EST-SSR标记分析。
1.2 分子标记遗传连锁图谱构建
所用 SSR引物来自 https://www.360docs.net/doc/10518815.html,， 以及中国农业大学小麦组开发的小麦 EST-SSR引 物 （Xcau系列）。通过亲本多态性检测， 共获得 334个多态性标记（271个 SSR和 63个 EST-SSR标 记）。采用 Mapmaker version3.0构建了一张覆盖小 麦 21条染色体的遗传连锁图谱（图距用 Kosambi 函数转化， ＞3），图谱总长 3859.5cM,标记间 平均图距 13.4cM。
1.3 偏分离分析
利用 SSR和 EST-SSR标记电泳带型划分 RIL 群体的基因型， 与母本相同带型记为 AA， 与父本相 同带型记为 BB， 缺失或模糊带型记为－。将父母本 带型观测结果按孟德尔分离的理论比率 （1颐 1） 进行 测验，推断被检测标记位点是否存在偏分离， 并 对照亲本基因型确定偏分离的方向。
2结果和分析
2.1 群体标记基因型分布
在 RIL群体中， 统计了在亲本间存在多态性的 334个分子标记位点的基因型分布， 结果表明,每个 位点基因型来源于母本 3338的在 5.1%～71.6%之 间， 来源于父本 Altgold的在 28.4%～94.9%之间。 对 群体的所有株系在全部标记位点上双亲基因型的分 析结果为： 来源于母本 3338的占 49.1%， 来源于父 本 Altgold的占 50.9%， 亲本基因型在群体中的分离 比例为 1颐 1.04， 接近于 1颐 1的理论分离比例。
2.1 偏分离标记的分布频率
对这 334个多态性标记进行 测验分析， 发现 有 82个标记位点表现为偏分离 （ ＜0.05）， 占总标 记位点数的 24.6%， 在 ＜0.01水平上， 有 43个表 现为偏分离， 占总标记位点数的 12.9%（表 1）。 在 82个偏分离标记位点中有 33个标记位点偏向母本 3338， 占偏分离标记位点数的 40.2%， 剩余 49个标 记位点偏向父本 Altgold，占偏分离标记位点数的 59.8%。另外， 所构建的覆盖小麦 21条染色体的遗 传连锁图谱包含了 82个偏分离标记位点中的 70个， 分别有 30、 30和 10个分布在 A、 B和 D染色体 组上， 分别占遗传图谱中标记位点数的 10.5%、 10.5 %和 3.5%。 从全基因组来看， 除 3D、 4B、 5B和 6A等 4条染色体外，其它染色体上均发现偏分离标记的 存在，并且在 1B、 3B、 4A和 7B染色体上发现的偏 分离标记较多， 分别为 10、 7、 14和 8个。 这些偏分离 标记在图谱上的分布有两种：孤立位点的偏分离和 成簇分布 （图 1）。 另外有 12个偏分离标记未能连到 遗传图谱上。
表1 小麦 RIL群体偏分离标记的 测验
Table1Chi-square test for segregation distortion of markers in
RIL population
Xksm112
Xbarc8
Xgwm818
Xcfd44
Xcau101
Xgwm285
Xgwm566
Xgwm77
Xcau204
Xbarc77
Xcfd143
Xksm130
Xgwm610
Xgwm624
1A
1B
1B
2D
3B
3B
3B
3B
3B
3B
3B
4A
4A
4D
108
99
107
97
112
107
110
108
74
104
108
109
108
106
73
68
69
44
72
78
75
79
39
75
52
68
66
71
7
21
12
47
4
3
3
1
75
9
28
11
14
11
6.39*
5.39*
7.78**
19.18**
8.27**
4.24*
6.25*
4.19*
10.23**
4.38*
18.91**
9.04**
9.66**
6.53*
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
3338
标记 染色体 基因型 偏分离方向 Markers Chromosome Genotype in RIL Direction of
population skewed
A/A B/B缺失
Absence
829
农 业 生 物 技 术 学 报
2007 年
*， ＜0.05显著性水平；**， ＜0.01显著性水平；N ， 表示没定位到
遗传图谱上的标记。
*at 0.05significant level?**at 0.01significant level?N indicate
distorted markers which not found on the map.
2.3 偏分离热点区域
偏分离标记在连锁群上成簇分布而且偏分离方 向一致，所在的染色体区段被称为偏分离热点区域 (segregation distortion region,SDR)。这些区域往往 与偏分离相关的特定基因的存在有关。本研究以分 子标记连锁图谱上存在 3个以上连锁的偏分离标记 的染色体区段作为偏分离热点区域，共检测到 6 个 SDRs ， 分别位于染色体 1A 、
1B 、 3B 、 4A 和 7B 上， 命 名为 SDR-1、
SDR-2、 SDR-3、 SDR-4、 SDR-5 和 SDR-6 （图 1）。 这 6 个偏分离热点区域的偏分离标记 数分别为 3、
6、 4、 4、 3 和 3个，偏分离热点区域的总 标记位点数占图谱中偏分离标记位点总数的 32.9
%， 占所统计的全部 82 个偏分离标记位点数的 28.1
%。 值得注意的是，
SDR-2 区域的 6个标记位点在 测验中均达到极显著水平，
SDR-4 区域的 4 个标记 位点中有 3个达到极显著水平。并且在同一偏分离
热点区域中，每个标记位点的偏离方向相同，
SDR-1、 SDR-2 和 SDR-4 区域的所有偏分离标记位
Xgwm443 Xgdm116 Xgwm819 Xcau104 Xbarc134 Xgwm282 Xgwm332 Xcau130 Xbarc278 Xgwm297 Xgwm333 Xgwm537 Xgwm573 Xgwm344 Xwmc58 Xgwm350 TAGL-T2 Xpsp3151 Xwmc322 Xwmc44 Xksm72 Xcfd59
Xcau119 Xcau128 Xgwm374 Xwmc52 Xbarc55b Xksm179 Xgwm458 Xcfa2201 Xgwm312 Xgwm47 Xgwm547 Xwmc29 Xcau96 Xcfa2037 Xcau35
Xcau108 Xcau150 Xksm23
Xgwm160 Xgwm397 Xgwm681 Xgwn637 Xbarc78 Xbarc190 Xbarc236 Xksm216 5A 5D 5D 6B 6B 7A 7A 7B 7B 7B 7B 7B 7B 7B 7B 7D 1A 1A 1A 1A 1B 1B
1B 1B 1B 1B 1B 1B 1D 2A 2A 2A 2B 2B 2D 3A 4A
4A 4A 4A
4A 4A 4A 4A 4A 4A 4A 4A
85
108 108 131 124 115 120 99
112 105 106 93
107 108 117 117 7267687161667264657462627272736361446975589 76417078585869666167
37
747552607268696576726468737067111 100 113 106 120 113 111 123 123 106 123 122 109 99
110 116 113 112 99
109 120 168 108 135 106 109 120 120 97
118 105 114 666 5 5 4 1 0 20117 1031137 1 4
5 217 117 9 5 1 0 8 3 4 7 175 9 1432204 10114 12121 1010224 227
18.11** 5.98* 5.60*
33.25** 21.57** 9.43** 13.84** 5.01* 11.95** 4.33* 6.12* 4.99* 8.25** 6.39*
11.32** 13.05** 7.89** 6.13* 10.70** 6.53*
17.33** 11.82** 7.89**
17.99** 17.28** 5.34*
19.46** 18.92** 7.16** 3.95* 7.08**
15.11** 14.95** 28.78** 5.01* 5.92*
20.90** 141.04** 5.22* 49.14** 6.96** 4.81*
20.90** 20.90** 4.39*
14.14** 11.14** 11.69** 3338 3338 3338
3338 3338 3338 3338 3338 3338
3338 3338 3338 3338 3338
3338 3338 Altgold Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold
标记
染色体
基因型 偏分离方向 Markers Chromosome Genotype in RIL Direction of population skewed
A/A B/B 缺失
Absence
Xgwm415 Xgwm291 Xbarc151 Xwmc85 Xbarc320 PK11
Xcfd132 Xcfd213 Xgwm448 Xcfd29 Xcau92
Xcau192 Xgwm469 Xcau166 Xgwm768 Xpsp3094 Xpsp3113 Xbarc228 Xgwm311 Xcau211 5A 5A 5A 5A 5D 6B
6D 6D N N N
N N N N N N N N N
8075426759657368665376707464767873
106 110 91
108 109 86115 9497104 999779
107 105 106 95
107 106 100 717858
0 4 606
352611
2125565 138 295 4 15
110 39
3.88* 5.92*
14.45** 12.14** 7.56** 5.93* 5.08* 5.39* 5.52* 4.73* 4.92* 6.61* 5.34* 5.66* 4.92* 3.96* 3.91* 6.53* 5.11* 6.87**
Altgold Altgold
Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold Altgold 3338 3338 3338
标记 染色体 基因型 偏分离方向 Markers Chromosome Genotype in RIL
Direction of population skewed
A/A B/B 缺失
Absence
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第 5 期 刘 刚等: 小麦RIL 群体 SSR 标记偏分离的遗传分析
图1.偏分离热点区域在连锁图谱上的分布
Fig.1.Distributions of segregation distortion region in linkage map
*， 显著偏分离标记 （ ＜0.05）； **， 极显著偏分离标记 （ ＜0.01）。
*at 0.05significant level?**at 0.01significant
level.
831
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
点都偏向父本 Altgold， SDR-3、 SDR-5和 SDR-6区 域的所有偏分离标记位点都偏向母本 3338。
3 讨论
3.1 小麦不同群体偏分离比较
本研究以普通小麦 3338和斯卑尔脱小麦 Altgold杂交得到的重组近交系为材料， 在 334个多 态性标记中，有 82个标记表现偏分离，频率为 24.6%，低于 Messmer (1999)在普通小麦 Forno伊斯卑尔脱小麦 Oberkumer的 RIL群体中观 察到的 35%的比例， 但高于 Paillard (2003)在 两个普通小麦品种 Arina和 Forno杂交得到的 RIL 群体中检测到的频率 17%。从偏分离的方向来看， Messmer (1999)的群体中 31个位点偏向于母 本 Forno， 53个标记位点偏向于父本 Oberkumer， 这 与本研究的结果相似，都是偏向父本（斯卑尔脱小 麦） 的标记位点明显多于偏向母本 （普通小麦） 的标 记。在 Messmer (1999)所构建的遗传图谱中也 发现了偏分离标记位点成簇分布的现象，分布在染 色体 3A、 5B和 7A上的 SDRs都偏向于普通小麦 Forno，分布在染的体 1B、 3B、 3D、 4A、 4B、 7A和 7B 上的 SDRs都偏向于斯卑尔脱小麦 Oberkumer。本 研究的结果中也发现在染色体 1A、 1B和 4A上的 偏分离热点区域都偏向于斯卑尔脱小麦 Altgold， 而 在染色体 3B和 7B上的都偏向于普通小麦 3338。 而 Paillard (2003)在以两个普通小麦品种为亲 本杂交的到的重组近交系为材料构建的遗传图谱中 发现，偏分离热点区域分布在染色体 1A、 1D、 2B、 3A、 5A和 5B上。通过对这 3个遗传图谱的偏分离 情况的比较发现，两个以普通小麦和斯卑尔脱小麦 杂交为基础构建的遗传图谱上的偏分离情况相似， 偏分离热点区域的位置近似，而与另一个以普通小 麦品种间杂交为基础构建的遗传图谱上的偏分离情 况差异较大 （尽管 Forno这个亲本相同）， 这说明偏 分离与群体类型和杂交组合的亲缘关系远近有较大 关系。
3.2 偏分离产生的原因
成簇分布的偏分离 （偏分离热点区域） 往往是由 偏分离位点（segregation distortion loci,SDL）引起 的。如果一个 SDL在一个群体中发生分离， 与其连
锁的相邻标记就会表现一定的偏分离 (宋宪亮等， 2006)。在玉米， 水稻等作物中发现的偏分离热点区 域与已经定位的配子体基因的位置有较好的对应关 系 （Xu ,1997?Lu 2002）， 推测配子体基因 型选择是导致偏分离的主要原因。目前在水稻中已 经鉴定出 13个配子体基因(Cheng ,1996)， 玉米 中也定位了 5个配子体基因(Coe ,1995)。在小 麦中，偏分离现象与来源于近缘属种的配子体致死 基因 (gametocidal gene, )及偏分离因子 （segregation distortion factor,Sd） 有很大关系(Marais ,2001? Shuhei ,1998)。Faris (1998)以 两个 D组山羊草 （ ） 杂交的 F2群体 为材料进行了基于连锁图谱的偏分离分析，结果在 1D、 3D、 4D、 5D和 7D检测到 7个偏分离热点区域， 导致偏分离的主要原因是雄配子体选择。 Mizuwa
.(1999)以 5个四倍体小麦品种间的杂交组合为材 料，通过 RAPD标记进行偏分离分析，在 20个 RAPD个标记中，检测到 5个标记表现为显著偏分 离， 并分别被定位到染色体 1B、 2B、 3A和 5B上， 偏 分离是由于雌配子体选择引起。本研究发现的 6个 偏分离热点区域中 3个偏向母本 3338， 3个偏向父 本 Altgold， 推测这些偏分离热点区域可能存在配子 体基因。但由于本研究用的是 RIL群体， 经过多代 重组和选择， 偏分离发生在什么时间？ 是否全部由配 子体选择造成？ 是否存在合子基因型选择、 染色体重 排以及基因间互作等复杂遗传机制？还有待于进一 步深入研究。
至于孤立位点的偏分离显然无法用偏分离位点 基因来解释， 应该还有其它方面的原因：（1） 亲本间 的亲缘关系也可能是产生偏分离的原因。Messmer (1999)与本实验都是用普通小麦与斯卑尔脱小 麦的种间杂交构建 RIL群体， 检测到的偏分离频率 分别为 24.6%和 35%， 明显高于 Paillard (2003)在两个普通小麦品种杂交得到的 RIL群体中检测 到的频率 17%；（2）重组自交系群体构建过程中多 代自然选择和人为抽样造成的偏差；（3） F6 RIL中部 分基因位点尚未完全纯合易引起偏分离；（4） 一些引 物在 RIL群体中扩增缺失， 导致某个亲本类型缺失 较多而产生偏分离。
参 考 文 献
Blanco A,Bellomo M P,Cenci A,De Giovanni C,D′ Ovidio R,Iacono E,Laddomada B,Pagnotta M A,Porceddu E,
Sciancalepore A,Simeone R and Tanzarella O A.A genetic linkage map of durum wheat(J).
,1998,97:721～728
Cheng R,Saito A,Takano Y and Ukai Y.Estimation of the
832
第 5期 刘 刚等:小麦RIL群体 SSR标记偏分离的遗传分析
position and effect of a lethal factor locus on a molecular marker linkage map(J). , 1996,93:494～502
Coe E H and Polacco M.Gene list and working maps(J).
,1995,694:157～191 Fang X J(方宣钧)， Huang Y M(黄育民)and Chen Q F(陈启锋).
Genetic analysis of some elite rice cultivars and hybrid rice combinations by using allozyme and RAPD markers(J).
(中国农业科学),1999,32(2): 1～8(in Chinese with English abstract)
Faris J D,Laddomada B and Gill B S.Molecular mapping of segregation distortion loci in (J). , 1998,149:319～327
Konishi T,Yano Y and Abe K.Geographic distribution of alleles at the Ga2locus for segregation distortion in barley (J). ,1992,85:419～422 Liu F(刘峰),Wu X L(吴晓雷)and Chen S Y(陈受益).Analysis of segregation distortion of molecular markers in RIL population of soybean(J). (遗传学报), 2000,27(10):883～887(in Chinese with English abstract) Liu Y G and Tsunewaki K.Restriction fragment length polymorphism analysis of wheat域.Linkage maps of the RFLP sites in common wheat(J).
,1991,66:617～633
Lu H,Romero-Severson J and Bernardo R.Chromosomal regions associated with segregation distortion in maize(J).
,2002,105:622～628 Marais G F,Marais A S and Groenwald J Z.Evaluation and reduction of Lr19-149,a recombined form of the Lr19 translocation of wheat(J). ,2001,121:289～295 Matsushita S,Iseki T,Fukuta Y,Araki E,Kobayashi S,Osaki M and Yamagishi M.Characterization of segregation distortion on chromosome3induced in wide hybridization between and type rice varieties(J). ,2003, 134:27～32
Messmer M M,Keller M,Zanetti S and Keller B.Genetic linkage map of a wheat伊 spelt cross(J).
,1999,98:1163～1170
Mizuwa M,Tomoko I,Masao K,Shigeo T,Naoki M,Ichiro O and Chiharu N.Segregation distortion through female gametophytes in interspecific hybrids of tetraploid wheat as revealed by RAPD analysis(J). ,1999,131:47～53 Paillard S,Schnurbusch T,Winzeler M,Messmer M,Sourdille
P,Abderhalden O,Keller B and Schachermayr C.An integrative genetic linkage map of winter wheat(
L.)(J). ,2003, 107:1235～1242
Pawlowshi W P,Torbert K A,Rines H W and Somers D A.
Irregular patterns of transgene silencing in allohexaploid oat (J). ,1998,38:597～607 Perfeectti F and Pascual L.Segregation distortion of isozyme loci in cherimoya( Mill)(J).
,1996,93:440～446
Shuhei Nasuda,Bernd Friebe and Bikram S G.Gametocidal genes induce chromosome breakage in the interphase prior to the first mitotic cell division of the male gametophyte in wheat(J). ,1998,149:1115～1124
Song X L(宋宪亮),Sun X Z(孙学振)and Zhang T Z(张天真).
Segregation distortion and its effect on genetic mapping in plants(J).（农业生物 技术学报),2006,14(2):286～292(in Chinese with English abstract)
Tanksley S D.Linkage relationships and chromosomal locations of enzyme-coding genes in pepper(J).
,1984,89:352～360
Xu Y,Zhu L,Xiao J,Huang N and McCouch S R.
Chromosomal regions associated with segregation distortion of molecular markers in F2 ,backcross,doubled haploid,and recombinant inbred populations in rice( L.)(J).
,1997,253:535～545 Yan J B(严建兵),Tang H(汤华),Huang Y Q(黄益勤),Zheng Y L(郑用琏)and Li J S(李建生).Genetic analysis of segregation distortion of molecular markers in maize F
2 population(J). (遗传学报),2003,30(10): 913～918(in Chinese with English abstract)
Zhang D S(张德水),Chen S Y(陈受益),Hui D W(惠东威)and Zhuang B C(庄炳昌).Analysis and causes of segregation distortion of RFLP markers in cultivated soybean/semi-wild
soybean F
2
population(J). (遗传学报), 1997,24:62～367(in Chinese with English abstract)
Zhao B,Deng Q M,Zhang Q J,Li J Q,Ye S P,Liang Y S,Peng Y and Li P.Analysis of segregation distortion of molecular markers in F 2 population of rice(J). , 2006,33(5):449～457
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SSR分子标记在作物遗传育种中的应用_罗冉
基因组学与应用生物学，2010年，第29卷，第1期，第137－143页Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.1,137－143 评述与展望 Review and Progress SSR 分子标记在作物遗传育种中的应用 罗冉 吴委林 张旸 李玉花* 黑龙江哈尔滨东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040*通讯作者,lyhshen@https://www.360docs.net/doc/10518815.html, 摘 要 SSR (simple sequence repeat)是建立在PCR 技术上的一种广泛应用的分子标记，具有含量丰富、多 态性高、共显性等优点。本文简要介绍了SSR 分子标记技术的原理和特点，重点介绍了SSR 分子标记技术 在作物遗传育种中的应用，主要在作物遗传多样性、基因定位、分子辅助标记、遗传图谱构建、品种鉴定和纯度鉴定等方面进行阐述。 关键词SSR,分子标记,作物,遗传育种 SSR Marker and its Application to Crop Genetics and Breeding Luo Ran Wu Weilin Zhang Yang Li Yuhua * Heilongjiang Harbin College of Life Sciences of Northeast Forestry University,Harbin,150040*Corresponding author,lyhshen@https://www.360docs.net/doc/10518815.html, DOI:/10.3969/gab.029.000137 Abstract SSR (simple sequence repeat)is a classic technique for molecular marker based on PCR technique,which had many advantages,such as abundance,high polymorphism,co-dominance etc.This paper has clarified the concept and characteristics of SSR marker,then presents emphatically its application to plant genetics and breeding,and focus on genetic diversity,gene mapping,marker assistant selection,construction of genetic map,varietal identification,purity identification and so on. Keywords SSR (simple sequence repeat),Molecular markers,Crop,Genetics and breeding https://www.360docs.net/doc/10518815.html,/doi/10.3969/gab.029.000137 基金项目：本研究由国家科技部863项目(2008AA10Z156)和国家自然基金重点项目(30730078)共同资助 遗传标记(genetic marker)是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。它可追踪染色体、染色体的某一节段或某一个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。目前，应用较为广泛的遗传标 记主要有形态标记(morphological maker)、 细胞标记(cytological maker)、生化标记(biochemical maker)和分子标记(molecular maker)。前3类遗传标记都是对基因的间接表达，并且标记位点少，多态性差，容易受 到环境因素、 季节变化等影响，因此发展比较缓慢。分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它 以蛋白质、 核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构及其变异。分子标记技术从本质上讲都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。广义的分子标记是指可遗传的 并可检测的DNA 序列或蛋白质，狭义的分子标记 指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的 特异性DNA 片段。 目前广泛应用的DNA 分子标记有三代，分别为第一代的限制性片段长度多态性(RFLP)，随机扩增多态性DNA (RAPD)，第二代的扩增酶切片段长度多态性(AFLP)，简单序列重复长度多态性(SSR)，第三代的单核苷酸多态性(SNP)等。本文主要对SSR 分子标记技术的原理、特点以及在作物遗传育种中的应用进行概述。 1SSR 分子标记技术的原理和特点 SSR 也称为微卫星DNA (microsatellite DNA)、短串联重复(tendom-repeats)或简单序列长度多态性(simple sequence length porlymorphism)，它通常是指以2~5个核甘酸为单位多次串联重复的DNA 序列，
遗传标记的发展及其类型
遗传标记的发展及其类型 1形态标记 19世纪60年代，Mendel以豌豆为材料，详细研究了豌豆的7对相对性状的遗传规律。由于这些性状都具有典型的外部形态，很容易识别，从而构成了最早的遗传标记，即形态学标记，由此奠定了近代遗传学的基础。形态标记是利用植物外部形态多态性进行的标记技术。自然界中的生物存在着许多非常明显的形态标记，如果形、花色、矮杆、卷叶等。形态标记简单直观且经济方便，但大多数植物中的形态标记数量有限，多态性较差，表型易受环境影响，且形态标记的获得周期长，不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析，故形态标记在作物遗传育种中的作用有限。 2细胞学标记 细胞学标记是利用植物细胞染色体的变异的标记技术。植物细胞染色体的变异包括染色体核型和带型的变异。细胞学标记虽然能进行一些重要基因的染色体定位，但标记材料的培育需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，难以获得标记材料，从而限制了细胞学标记在遗传育种上的应用。 3生化标记 生化标记主要指同工酶标记，是依据植物体内有效成分的化学分析进行标记的技术。同工酶是同种功能的酶的不同形式，由一个以上基因座位编码，其可通过电泳和组织化学染色法分离成肉眼可见的酶谱带型。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记表现近中性，对植物经济性状无大的不良影响，且是基因产物差异的直接反映，受环境影响较小。但由于在植物群体研究中能表现出位点多态性的同工酶种类较少，使其应用也受到限制而不能成为较理想的遗传标记。 4分子标记 分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记主要是指DNA分子标记。DNA分子标记能反映植物个体或种群的基因组DNA 间的差异，如由于碱基易位、倒位、缺失、插入、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列而产生的差异。起步于20世纪70年代的分子标记在近40年间发展迅速，目前已出现了几十种分子标记方法。与前3种标记(形态、细胞学和生化标记)技术相比，分子标记具有巨大的优越性: ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，受季节、环境限制，不存在表达
EST-SSSR分子标记的建立
课程名称： 分子育种学 指导老师： 海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型 分工： 奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析 一、实验目的和要求 1、了解SSR 标记的开发策略； 2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理； 3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。 二、实验容和原理 1、实验容 通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA 真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。 微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。 重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略 SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列的SSR ，不包括含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。 建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性； （4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。 近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。
染色体遗传标记
染色体遗传标记 一：基因位点的标记： ?基因所在的染色体。第一个数字表明基因所在的染色体。性染色体用X或Y表示。 ?所在染色体的臂。P是短臂，q是长臂。 ?基因在p或q臂上的位置。基因的位置基于染色体某种特定染色下的亮带和暗带的标准形式。通常用两位数命名（代表区和带），有时后面跟着一个小数点和一个或多个小数（代表亮带或暗带内的亚带）。数字的大小表示离着丝粒的距离。 ?有时，缩写“cen”或“ter”也用于描述基因的位置。“Cen”指基因离着丝粒非常近。“Ter” 代表端粒，表明基因非常靠近p或q臂的末端。 二：染色体和染色体异常的标记 46,XX ：正常女性核型 46,XY：正常男性核型 46,XX,del(14)(q23) ：有46条染色体，女性，14号染色体长臂2区3带缺失。 46,XY,dup(14)(q22q25) ：有46条染色体，男性，14号染色体长臂重复累及2区2带至5带。 46,XX,r(7)(p22q36) ：有46条染色体，女性，7号染色体环。短臂末端（p22）与长臂末端（q36）融合形成环。 47,XY,+21 ：有47条染色体，男性，额外染色体为21号。 不夸张的说，畸形的类型有几百万。以下是一些术语的代码： add =原因不明的额外物质 del = 缺失 de novo = 不是遗传的染色体畸形 der = 衍生染色体 dic ＝双着丝粒 dup = 重复 fra = 脆性位点
idic =具同形双着丝粒的染色体 ins = 插入 inv = 倒位 i or iso =等臂染色体 mar =标记染色体 mat = 母体起源 Minus sign (-) =减号(-),放在染色体号前面表示失去整条染色体,放在染色体号后面表示该染色体变短 mos = 镶嵌型 p = 染色体的短臂 pat = 父本 Plus sign (+) =加号(+),放在染色体号前面表示增加整条染色体,放在染色体号后面表示该染色体加长 q = 染色体长臂 r = 环状染色体 rcp = 互逆 rea = 重排 rec ＝重组染色体 rob =罗伯逊易位:是指D组与G组10个染色体之间的一种特殊类型的易位,过去又称为着丝粒融合 t = 异位 tel = 端粒 ter = 染色体的终点 upd =单亲二体一对染色体(均来自父或母) ? = 不明确
SSR分子标记遗传分析
SSR分子标记遗传分析 实验原理： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高 实验材料： 欧美山杨杂种幼嫩叶片 实验器具、药品： 模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统 SSR引物及退火温度 位点Loci 重复单元 Repeat unit 引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′) 退火温度 T(℃) PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R) 63℃ PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F) TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R) 49.4℃ PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F) A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R) 55.4℃ 实验步骤： 1.总DNA的提取 采用CTAB法提取植物总DNA （1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热； （2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末； （3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀； （4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清； （6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质； （7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA； （8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。 2.总DNA的检测
遗传标记技术在动物育种中的研究进展
2004年2月甘肃农业大学学报第39卷第1期92～96 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY 双月刊遗传标记技术在动物育种中的研究进展 马彬云，吴建平 （甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070） 摘要：随着生物科学的不断发展，遗传标记辅助选择（MAS）已经在动物改良中获得了较大的遗传进展，其中最关键的环节是识别有效的遗传标记，即这一标记应与控制这些数量性状的基因（QTL）处于连锁不平衡（linkage disequilibrium）状态。就目前遗传标记技术在动物遗传育种中的研究进展进行了综述，并展望了遗传标记技术在该领域的应用前景，以期引出这一技术可能存在的一些问题以供思考。 关键词：MAS；遗传标记；分子标记；动物育种；QTL 中图分类号：S 813.3 文献标识码：A 文章编号：1003-4315(2004)01-0092-05 Research progress of genetic maker technology in animal breeding MA Bin-yun，WU Jian-ping （College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Gansu, Lanzhou 730070, China） Abstract:With the development of Bio-science, Genetics Makers-assisted Selection (MAS) has already obtained prominent genetic progress in animal breeding, in which the key aspect is the identification of useful genetic markers that ought to be in linkage disequilibrium with the major gene which dominates Quantitative Trait Locus (QTL). The paper reviews the application perspective of the technology in the field of animal breeding. Key words：genetic marker；molecule marker；animal breeding；QTL 在动物遗传育种中应用遗传标记（genetic markers）为动物育种高效而精确地选择目标基因型开辟了新道路，也使传统的育种工作跨上了新台阶，从而使可望识别具有优良基因的种畜个体，提高选择强度，缩短世代间隔，以期获得最大的遗传进展已成现实。在家畜育种中尤其对于限性性状、低遗传力性状及难以测量的性状，应用标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS），其优越性就更为明显[1]，可显著地提高选择的有效性及遗传改进量。 1 遗传标记技术的研究进展 生物的系统分类，物种的起源和进化，种群遗传结构考察以及生物多样性分析等研究都涉及到遗传分析，遗传分析需要有效的遗传标记。对动物进行MAS亦必须找到恰当的遗传标记。 80年代以来，随着分子生物学的发展，分子克隆技术和DNA重组技术的日趋完善，特别是PCR技术和新的电泳技术的产生，使各种分子遗传标记应运而生，给动物遗传育种工作带来了新的生机和革命性的变化。 1.1 遗传标记辅助选择（MAS） 在动物的遗传育种中，标记辅助选择的出现是伴随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的发展而不断得到广泛的应用，并已经成为目前家畜选育和研究的热点。 标记辅助选择由于充分利用了表型、系谱和遗传标记的信息与只利用表型和系谱信息的常规选种方法相比，具有更大的信息量[2]。 目前，MAS在动物的选育中已取得了一些成功的事例，猪氟烷（halothane, HAL）基因和雌激素受作者简介：马彬云（1976－），硕士研究生，研究方向为动物遗传学和分子遗传学。
大规模开发及特性分析十字花科SSR分子标记 及其数据库的构建
Botanical Research 植物学研究, 2017, 6(3), 86-95 Published Online May 2017 in Hans. https://www.360docs.net/doc/10518815.html,/journal/br https://https://www.360docs.net/doc/10518815.html,/10.12677/br.2017.63013 文章引用: 杨帅, 李慧, 侯欣, 张丽. 大规模开发及特性分析十字花科SSR 分子标记及其数据库的构建[J]. 植物学研究, Large-Scale Development and Character Analysis of SSR Markers and Database Build in Brassicaceae Shuai Yang 1,2*, Hui Li 2, Xin Hou 1, Li Zhang 1* 1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Taian Shandong 2 College of Life Sciences, Jinan University, Jinan Shandong Received: May 4th , 2017; accepted: May 21st , 2017; published: May 24th , 2017 Abstract Brassicaceae is an important family in the plant kingdom. The Simple Sequence Repeats (SSRs) play a vital role in the study of Brassicaceae. By using 13 known sequenced Brassicaceae species with bioinformatics and comparative genomics methods, a total of 1,786,619 SSR loci and 1,919,464 pair of primers have been developed. The results show that the SSRs are widely distributed in the Brassicaceae species’ genomes, 1 - 3 bases duplication have a high ratio among these genomes and gene sequences, AT/TA repeats units have a high numbers in all of the 2 base duplication. In addi-tion, 435,414 specific SSR primers could be used to analyze the correlation between the species of Brassicaceae. 11 pairs of universal primers’ developed shows that there exist some consistent base fragments and could be amplified across different species. In this study, we constructed the world’s first SSR molecular marker database platform (BSSRD, Brassicaceae Simple Sequence Re-peats Database https://www.360docs.net/doc/10518815.html,/BSSRD ) which will play an important role in the con-struction of genetic map, gene mapping and genetic breeding of Brassicaceae. Keywords Brassicaceae, SSR, Specific Primers, Universal Primers, Database 大规模开发及特性分析十字花科SSR 分子标记及其数据库的构建 杨 帅1,2*，李 慧2，侯 欣1，张 丽1* 1 山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 2 济南大学生命科学院，山东 济南 * 通讯作者。
遗传标记的发展和应用
遗传标记的发展和应用 1 遗传标记的种类 遗传标记是指在遗传分析中区分不同遗传背景的研究对象的可遗传的标记，根据研究水平的不同，可分为形态学标记、同工酶标记和DNA分子标记。Mendel 在经典的豌豆杂交实验中就使用了花色等可用肉眼识别的形态标记。虽然在早期的很长一段时间里，科学家们都在利用形态标记进行连锁分析和遗传作图（Sax, 1923），但由于形态标记数目较少,而且易受环境因素的影响，在界定过程中也易受人为因素影响，不是很准确，因此就限制了其应用和发展。同工酶是指具同一底物专一性的不同分子形态的酶。同工酶的概念虽然早就被提出，但由于技术限制，直到五十年代淀粉凝胶电泳酶谱技术的发明（Hunter and Market, 1957），同工酶技术才得以在遗传学研究中被广泛利用。同工酶标记是一种共显性标记，在不同组织、不同发育阶段和不同物种间可能具多态性，稳定而不受环境影响。但其数目和多态性对于迅猛发展的遗传学研究来说，依然是远远不够的。 随着分子生物学的快速发展，对遗传物质—DNA的认识和体外操作技术水平的不断提高，产生了新的基于DNA水平的分子标记。这类分子标记的多态性是由于DNA水平上的各种变异如：倒位、易位、缺失、插入和单个碱基突变造成的。在长期的自然选择过程中，基因组中积累了大量这种可遗传的变异，并且是均匀地分布于全基因组中的。因此DNA分子标记相对于同工酶标记和形态学标记具有数目丰富、多态性高、稳定不受环境影响等优点。根据DNA分子标记的工作原理可将其分为两类，一为以限制性酶切和分子杂交技术为基础的RFLP标记（Bastein, 1980）, RFLP标记最早是应用于人类基因组研究中，现已广泛地在动、植物的基因组研究中使用于遗传作图，基因定位等方面（Burr et al., 1988; Apuya et al., 1988; Mccouch et al., 1988; Tanksley et al., 1992）。而另一类则是以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）为基础的标记。随着PCR 技术的发明和广泛应用，一大批基于此技术的新型分子标记如RAPD（Williams et al., 1990）、AFLP（Zabeau and Vos, 1993）、SSR（Litt and Luty, 1989; Wu, 1993）等也迅速发展起来。RAPD是一种显性标记，以一段通常为10个碱基左右的随机寡核苷酸作为引物在基因组中进行扩增，由于引物的随机性，因此数量巨大，而且由于其主要是基于PCR技术，因此操作相对简便。AFLP标记是以两种限制性内切酶去酶切DNA，然后在两端分别加上两个接头，再进行两次选择性扩增，通常一次扩增可以得到相当多的带，在降低了错误扩增的几率后，AFLP是一种十分高效的标记，而且由于两种限制性内切酶可以任意组合，因此从理论上来说AFLP标记的数目几乎是无限的。AFLP标记可能为显性或共显性。SSR标记多为共显性标记，它是指在基因组中的一些有少数几个（2、3、4）核苷酸组成的简单重复序列，由于在生物的长期进化过程中这些重复序列所处的染色体位置
SSR分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中的应用
SSR分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中 的应用 摘要我国最早的引入分子标记技术是在20世纪的80年代，经过近几十年的不断发展，分子标记法也取得了较快进步，不仅应用领域在不断拓展，应用成果也非常显著。作为世界上最重要粮食作物之一的水稻，对于人类的生存与发展起到了十分关键性的作用，而如何更好的运用生物技术全面提高水稻亩产量，提升水稻品质已经成为了国际社会共同关注的焦点话题。经过多年的技术研究和发展，遗传标记在识别生物群体的多态性的过程中逐渐充当着重要的角色，通过形态标记可以对生物的形态差异进行比较，分子标记直接检测出生物DNA分子结构上的变化，进而更好的将好的品种和遗传特性保留下来。在这种情况下，对于SSR分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中的应用进行分析和研究具有重要的现实意义。 关键词 SSR分子标记；水稻；品种鉴定；遗传育种；应用 中图分类号：S336 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2014）17-0071-02 在水稻品种鉴定和遗传育种以及水稻的遗传作图中，
SSR分子标记一直都充当着重要的角色。以往的育种主要依赖的是植株的表现型进行品种的鉴定和选择的，这对于育种者的经验具有很高的要求，而且需要进行多次技术测定，不仅耗时而且费力，因此需要在此基础上去寻求更好更加准确的标记方式，以此来提高项目育种的质量和效率。而自从SSR 分子标记的出现和发展，对于水稻育种工作和品种的鉴定具有重要的促进作用。和普通的标记方法相比，SSR标记是不受到周围的环境条件以及相关的因素影响的，因此具有很好的发展前景。本文也将从SSR标记的基本原理出发，对于SSR 分子标记在水稻品种鉴定和遗传育种中的应用进行了分析和论述，希望给读者一定的启示。 1 SSR标记的基本原理分析 无论是水稻还是其他的生物作物都是由特定的基因组组成的，但是由于每一个SSR序列的存在单元存在一定的差异性，因此基因的座位也存在多态性。而SSR标记的关键环节就是要对于SSR座位两侧的核苷酸进行全面的了解和分析，并且对其基本结构序列形成特定的特异保护[1]。SSR标记主要包括以下几个过程：一是要建立专门的DNA文库和数据资源库；二是要进一步筛选鉴定微卫星DNA克隆；三是完成基本的序列测定和标记。总的说来，SSR的操作程序就是指DNA的提取、微卫星DNA的扩增以及电泳处理。在这个过程中，还可以通过在已有的DNA数据库中进行SSR序列的搜
EST-SSSR分子标记的建立
课程名称： 分子育种学 指导老师： 崔海瑞 成绩： 实验名称： EST-SSR 标记的开发 实验类型： 综合型 分工： 谢奕-EST 获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR 筛选+SSR 统计+结果分析 一、实验目的和要求 1、了解SSR 标记的开发策略； 2、明确EST-SSR 标记的特点和建立EST-SSR 标记的原理； 3、熟悉EST-SSR 标记的过程，掌握EST-SSR 标记的开发技术。 二、实验内容和原理 1、实验内容 通过从现有的EST 文库中获取序列，再用软件对其进行SSR 查找与引物设计。 2、实验原理 1）微卫星DNA 真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp ）、小卫星（6～70bp ）和微卫星DNA （1-6bp ）。 微卫星（Microsatellite, MS ）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeats , SSR ）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR ）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism ，SSLP ）。 重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。 2）SSR 标记的开发策略 SSR 包括基因组SSR （genomic SSR 或gSSR ）和表达区EST-SSR （genic-SSR 或EST-SSR ）。gSSR 是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST —SSR 则是存在于表达的基因序列内的SSR ，不包括内含子及非表达的调控区等之中的SSR ，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。 建立SSR 标记的前提是必需知道重复序列两列的DNA 序列。 与其他标记相比，SSR 标记具有如下特点： （1）数量较为丰富，覆盖整个染色体组； （2）具有多等位基因特性，信息含量高； （3）以孟德尔方式遗传，呈共显性； （4）易于利用PCR 技术分析，对DNA 数量和纯度要求不高，结果重复性好； （5）每个位点由引物序列决定，便于交换。 近年来，EST-SSR 标记的开发引起关注。数量迅速增加的ESTs 为开发新的SSR 标记提供了宝贵的资源，各种植物中约有5-10%的EST 含有可用于建立标记的SSR 。建立EST-SSR 标记要经济得多，而且EST-SSR 标记来源于DNA 的转录区域，比gSSR 标记具有更高的通用性，此外，标记-信息量高。
分子标记技术简介
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
分子标记的实验原理及操作流程
一 AFLP 分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多态性 (RAPD 和限制性片段长度多态性 (RFLP 技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术, 具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD 技术简便快捷的特点, 不需象 RFLP 分析一样必须制备探针, 且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。同其他以 PCR 为基础的标记技术相比, AFLP 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究, 种质资源鉴定方面的研究,构建遗传图谱等。 其基本原理是:以 PCR(聚合酶链式反应为基础, 结合了 RFLP 、 RAPD 的分子标记技术。把 DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行 PCR 扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“ 接头” , 用与接头互补的但 3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异 PCR 扩增, 只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 , 再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总 DNA 。 二、实验设备 1. 美国贝克曼库尔特 CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,
3. 美国 MJ 公司 PCR 仪, 4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。 DNA 提取试剂盒; EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒; Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer; 琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水(18.2M ? ·cm 2.其他实验需要物品 微量移液枪(一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。 四、实验流程 1、总 DNA 提取 使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的。 2、 EcoR1酶消化 (20ul 体系 /样品
分子标记技术原理、方法及应用
分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长 细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方
法和电泳技术有一定难度 分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。 (1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。 几种主要的ＤＮＡ分子标记
三代遗传标记
三代遗传标记 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。 1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
最新分子遗传标记及其应用
分子遗传标记及其应 用
分子遗传标记及其应用 摘要：分子遗传标记育种是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用。本文介绍了分子遗传标记的概念及应用。 关键字：分子遗传标记，标记辅组选择 Abstract：Served as an newly rising genetic marker technique,molecule genetic markers is being widely used on molecule biology,especially in molecule genetic researches. This article gives a brief introduction of the conception and utilization of molecule genetic markers. Keywords:marker assisted selection；molecule genetic markers 一．分子遗传标记技术 1．1分子遗传标记的定义 DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用，由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组的DNA序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定，最为可靠的。随着现代分子生物学技术的发展，使直接利用DNA序列中核甘酸的变异作为遗传标记成为了可能。 目前，对分子遗传标记较完整的描述，是指易于识别，遵循孟德尔遗传模式的，具有个体特异性或其分布规律具有种质特征的某一类表型特征或遗传物质；其范围包括： ①基因或遗传物质的产物的变异特征； ②作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异；