ELISA的基本原理
ELISA的基本原理[1]
ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部分包括：（1）包被的抗原或抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或试管；（2）酶标记的抗体或抗原和（3）酶的反应底物等。抗原或抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标准，显色或产生荧光或发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。
二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3]
通常所提到的抗原与抗体的相互作用，一般指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。
（一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长
通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的区域内。也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或使用微颗粒来做到这一点。微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。
（二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定
此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分，这部分体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处于一级结合键的引力距离内，小于100?。液相中待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要经过扩散或质量转移。微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。因此，结合反应的效率更高。这也是全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重要原因之一。可参与结合反应的抗体或抗原的浓度取决于可参与结合的反应体积，无法精确计算这种反应体积，从而难以使用通常的质量作用定律图形来计算Keq。因此，固相上抗原与抗体反应的Keq值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性。
（三）固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低
固相免疫测定中固相表面上抗原和抗体间的相互作用，类似于细胞表面上蛋白与其受体间的结合。研究表明，细胞表面上的蛋白与受体结合反应的离解速率较液相中的要低两个梯度，同样，固相免疫测定中，固相上抗原和抗体的离解速率亦同样缓慢，其基本原理相似，概述如下：（1）细胞表面上蛋白与其受体的相互作用涉及到细胞表面受体的聚集，由于多价复合物离解的减少，相应地亲合力增加。研究表明，被动吸附于固相的抗原和抗体也是成簇或聚集状的，因此，反应界面的抗原或抗体可能也是“成簇的”。（2）大多数抗原-抗体的离解所需的能量比防止其结合所需的能量要大，表明在初始结合键形成后，又形成了次级结合键。这提示在固相免疫测定和其它细胞表面反应中，形成了大量的次级结合键。（3）以成簇出现的和来自于限定的界面反应体积内的抗体或抗原，常以很高的浓度存在，这种情况下，即使抗原和抗体有离解发生，离解的抗原的重新结合也较液相系统更为快速。这可以解释为何固相免疫测定与液相测定相比时，其抗体的Keq较高。正是这种极缓慢的离解速率，使得ELISA和固相免疫测定技术具有很好的适用性，即使是测定的反复洗涤步骤，也可使受体配体的相互作用仍保持处于结合状态。
（四）微孔内特异抗体免疫测定的亲和力依赖性
使用固相包被的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫测定，与液相测定相比，有明显的亲和力依赖性，固相受体-配体相互作用的稳定性，似乎与微孔内特异抗体的免疫测定亲和力依赖性和极低比例的所捕获的总抗体相矛盾，这可能是因为：（1）在所吸附于固相的复杂抗原中，能与液体中特异抗体结合的抗原浓度极低。这可能是由于所吸附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧失的结果。（2）抗原表位由于固相吸附发生改变，使得特异抗体与其结合的亲和力较低。当抗原以1~5 g/ml浓度被动吸附于固相时，大多数蛋白抗原的60-80%至少会以一个单层而稳定的吸附于固相，这样在固相上的总的抗原就不会缺乏。如果500-800μng抗原稳定的吸附于微孔板孔，对含500 g/ml抗体的血清的1：10,000稀释可提供大于10倍过量的抗原，考虑到抗原和抗体间相互作用的合理的Keq，只是从吸附抗原的量的有限性，不能解释固相上抗原与抗体结合的低亲和力，而更可能是由于空间位阻或吸附引起的变性所致的抗原表位的丧失所致。μ
（五）固相的抗体或抗原与液相中的抗体或抗原在构型上不一样
固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体或抗原所展示的构型不一样，对抗体或抗原由于固相化尤其是被动吸附或其它吸附方式所致的构型改变已有众多的文献报道。本书的另一章节将有专门介绍。
三、临床ELISA测定的常用模式
ELISA依其测定抗原和抗体的不同，测定模式有很多，如直接法、间接法、双抗体夹心法（直接、间接）、竞争抑制法（直接、夹心等）、捕获法等[4]。在临床实验室，常用的ELISA测定模式有双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等。在抗原的测定上，蛋白大分子抗原测定用的最多的模式
是双抗体夹心法，而对只有单个抗原表位的小分子，则使用竞争抑制法；抗体的测定通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等。
（一）抗原测定ELISA模式
1. 双抗体夹心法对于含多个抗原表位的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的测蛋白抗原的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。具体测定方法如下。
（1）首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中2~8℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
（2）加入含待测物的临床样本如血清（浆）等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体结合而吸附于固相上。
（3）加入酶标记的双抗体之二，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
(4) 加入酶底物，温育（通常为37℃下）显色测定（图1）。
在该测定模式中，有两步温育及板孔洗涤步骤，从而称为“两步法”，如果将上述测定步骤（2）和（3）合并为一步，即将待测样本和酶标抗体在步骤（2）中同时加入，这样就只有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。最初的双体抗夹心测抗原的ELISA试剂盒，均采用“两步法”。后来，为了缩短检测时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、甲胎蛋白（α-fetoprotein,
αFP）、前列腺特异抗原（PSA）、CA系列标志、hCG及激素等，基本上都采用一步法。一步法相比于两步法，虽然操作简单，但有其固有的缺陷，处理不好，双抗夹心免疫测定结果会因为钩状效应（Hook effect）的存在而出现假阴性或定量偏低的结果[5-14]。
，因此待测抗原浓度的逐步增加，导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，抗原浓度（横坐标）与比色测定得到的吸光度（纵坐标）之间的关系成S形变化曲线（图2）。]（2）式[在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原（Ag），当其浓度逐步增加时，将使固相抗体（Ab）与抗原的结合逐步达到饱和[（1）式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体（Ab*）后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关
Ab ? Ag （b复合物） (1)→ Ab ＋ Ag
Ab ? Ag→Ab ? Ag＋Ab* ? Ab* （a复合物） (2)
而一步法双抗体夹心ELISA的抗原浓度（横坐标）与比色测定得到的吸光度（纵坐标）之间的关系则为钟形曲线（图3）。也就是说测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加，在一开始其也是增加的，而当抗原浓度升高至一定程度后，测定吸光度即开始下降，而像一个倒立的鱼钩（图2-3中钟形曲线的实线部分），即所谓的“钩状效应”（其曲线像一个倒立的鱼钩），抗原进一步增加，甚至不出现任何显色（图3中钟形曲线的虚线部分），此时，强阳性标本会测定为阴性，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”（Zone phenomenon）。一步法的反应平衡式如（3）式。
Ab ? Ag ? Ab* ＋Ab ? Ag ＋Ag ? Ab*＋Ab* ?→Ab＋Ag＋Ab* Ag ? Ab* (3) a b c d
其中a为最后测定结果的显色之源，当待测标本中Ag 浓度增加时，无疑会使b、c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*，使Ab ? Ag ? Ab* 即a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟形，而且由于d 复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步法显色较两步法为浅。此外，b和c 复合物的增加亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。但如果固相单抗和标记单抗，采用针对抗原的不同且空间距离较远的表位的抗体，即包被使用一种单抗，
酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b、c和d复合物减少至最低程度，而大大减轻“钩状效应”。
我们曾使用本室能得到的含最高浓度（约2,000,000 ng/ml）HBsAg的血清样本，对国内较大的试剂生产厂家的“一步法” HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评价，尽管大部分试剂在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度（1:10稀释）显色要浅，在曲线上出现了“钩状”，但均未出现该份样本测定为阴性的情况。尽管如此，在临床实验室实际工作中，仍有可能遇到“钩状效应”较严重的HBsAg测定ELISA试剂盒，基层实验室同行也有这方面的反映。因此，还应该重视“一步法”试剂盒所致的假阴性问题，当发现测定结果明显与临床不符或与相关测定指标互有矛盾，如HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时，就应考虑HBsAg测定可能存在的“钩状效应”所致假阴性问题。
综上所述，一步法ELISA试剂盒作为迎合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大的市场，其虽有潜在缺陷，易导致含高浓度待测物的标本检测为阴性（假阴性），但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。此外，建议生产HBsAg、αFP、前列腺特异抗原（PSA）、CA系列标志、hCG及激素等“一步法”免疫测定试剂盒的厂家，应对所产的试剂在出厂前对其“钩状效应”进行充分的研究，并提醒用户在使用时应注意之处。
双抗体夹心法测抗原另一个所需要注意的是类风湿因子（RF）和补体等的干扰。我们知道，RF是一种抗变性IgG的自身抗体，主要为19S的IgM类，也可见7S的IgG及IgA。这种自身抗体的特性是其是能多种动物的变性IgG的Fc部份结合。因此，如果血清标本中含有RF，在双抗夹心ELISA检测时，其即可作为固相抗体和酶标抗体（均为IgG）之间的桥接抗原，而产生假阳性反应。同样，抗体也有补体C1q的结合位点，同样会造成类似于RF的测定干扰。
2. 竞争法大分子抗原因其具有两个以上的抗原表位，而可用双抗体夹心法测定，小分子半抗原如地高辛、茶碱等药物以及T3、T4、睾酮等激素，因其
可能只有一个抗原表位，或因为分子太小，结合一个抗体后，因空间位阻，无法再结合另一个抗体，所以不能使用双抗体夹心方法测定，只能采用竞争抑制法。具体步骤如下。
（1）先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭。
（2）同时加入待测样本和酶标的小分子，温育一定时间后，洗板；此步中，待测样本中的小分子将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合。
（3）加入酶底物，温育，显色测定，显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比（图4）。
这种测定模式中，需要得到小分子与酶的结合物，而小分子酶结合物，一则在制备上不如抗体酶结合物简便，二则其纯化亦颇为困难，结合有小分子的酶与游离酶之间分子量区别小，使用一般的分子筛方法难于分离。因此，有人尝试在合成二或多聚体小分子的基础上，建立双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子，测定的灵敏度和特异性均有所提高（图5）。
（二）抗体测定模式
1.间接法测定机体针对感染性疾病病原体抗原所产生的抗体，在难以得到高纯度且特性明确的抗原以前，或抗原较为复杂的情况下，一般均使用间接法，其基本操作步骤如下。
（1）将特异抗原在碳酸盐缓冲液中2~8℃过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
（2）加入含待测抗体的临床样本如血清等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板。此时，待测抗体就会与固相上特异抗原反应而吸附于固相上。
（3）加入酶标记的抗人IgG抗体，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成固相抗原－待测抗体－酶标二抗复合物。
(4) 加入酶底物，温育显色测定（图6）。
现在临床常用的检验项目丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）的测定均为间接法模式，以前人免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）以及梅毒螺旋体抗体等的测定也曾使用过间接法。从上述的测定模式可见，间接法测抗体，严格地讲，所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是由酶标二抗体所决定的。当然，如果酶标二抗为羊抗人IgM或IgA，则也可以采用间接法测定特异的IgM和IgA类抗体，目前有些特异的IgM类抗体检测试剂盒即是采用间接法模式。
影响间接法测定抗体的一个较大的因素是包被抗原的纯度。以前使用从细胞培养得到的病毒裂解后，纯化得到的抗原，由于抗原较为复杂，且难于完全除去培养细胞所含的主要组织相容性抗原，以此种抗原建立的间接法测定特异抗体，有可能存在较高假阳性。现在间接法测抗体中所使用的抗原一般均为基因工程重组抗原，如HCV的NS3、NS4、NS5，HIV的gp41、gp120和gp160，以及梅毒螺旋体TpN15、TpN17、TpN47等。基因工程抗原在纯化时，应尽量去除用来表达的细菌如大肠杆菌的抗原，以免由于机体存在对这种细菌的抗原的抗体，而引起假阳性反应。此外，由于机体的IgG类抗体浓度较高，其中绝大部份为机体接触外界环境刺激所产生的非特异IgG，因此，为避免这些高浓度非特异IgG对固相的吸附所致的假阳性反应，通常需对待测样本作一定程度的稀释，但由于临床实际工作中，如有标本稀释步骤，实验操作者会觉得太麻烦，故通常试剂厂家采取在板孔
中先加稀释液，再加入标本的稀释策略。此时，标本的加入量较通常的双抗原夹心法要少很多，如10 μl。
在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。
2.双抗原夹心法前面提到，间接法测抗体依所使用的二抗的种类，实际上测定的可能只有IgG或IgM或IgA类。而双抗原夹心法所测定的抗体，则包括所有各类特异抗体，且不受非特异IgG的干扰，因此，双抗原夹心法测抗体的灵敏度和特异性要高于间接法。目前，为提高抗体测定的灵敏度，国内的间接法ELISA 试剂盒，除抗HCV因其抗原较为复杂外，已基本采用双抗原夹心法检测模式。
双抗原夹心法测抗体的模式类似于双抗体夹心法测抗原（图7），其操作步骤亦基本相同，也可采用类似于双抗体夹心法测抗原模式的“一步法”，如果在急性感染状态下，机体产生抗体IgG的滴度通常不高，不会出现明显的“钩状效应”，但如果为慢性感染，在抗体滴度很高的情况下，也会存在“钩状效应”，如抗-HIV 和梅毒抗体测定的“一步法”双抗原夹心ELISA试剂盒，就可能出现上述“钩状效应”，造成漏检。此外，为了保证测定的灵敏度和特异性，酶标用抗原应仔细加以选择。
3.竞争法抗体的测定一般不使用竞争法。当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种模式测定抗体，最典型的例子是乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的测定。由于e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸，e抗原很容易转变为核心抗原，因此，HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法。但其测定具体模式有区别。抗原的固相化在HBcAb的测定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb测定，则先将特异抗e抗原的抗体包被于固相上，在测定时，再将e抗原通过相应特异抗体而间
接固相化。
HBcAb和HBeAb ELISA测定具体操作步骤分述如下。
HBcAb的竞争法测定：
（1）先将HBcAg在碳酸盐缓冲液中2~8℃过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤，去除未结合的部分及杂质。
（2）同时加入待测样本和酶标的特异抗体，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板。此步中，待测样本中的抗体将与酶标抗体竞争与固相上特异抗原结合。（3）加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比（图2-8）。
HBeAb的竞争法测定：
（1）先将HBeAb在碳酸盐缓冲液中2~8℃过夜包被，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
（2）同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，温育（通常为37℃下）一定时间后洗板；此步中，待测样本中的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原结合HBeAg，待测样本中HBeAb浓度越高，则与固相HBeAb结合的HBeAg越少，反之亦然。（3）加入酶标的特异抗体，温育一定时间后洗板；此步中，酶标抗体将与结合于固相抗体上的特异抗原结合；
（4）加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比（图2-9）。
现试剂盒通常将第（2）和第（3）步并为一步，先后加入样本、酶标抗体和HBeAg，此时，固相抗体、酶标抗体和样本中的特异抗体将一起竞争与加入的HBeAg结合。这样更能体现竞争测定的实质。
HBeAb之所以要采用此种模式测定，主要是HBeAg的不稳定所致，如在固相
直接包被HBeAg，则会因为HBeAg向HBcAg的易转变性，而导致测定误差。
抗体的竞争法测定不同于只有单个抗原表位的小分子抗原的竞争法测定，其测定的可靠性，在很大程度上，受竞争抗体的特异性和亲和力大小的影响，竞争抗体与待测抗体在结合的特异性及亲和力越接近一致，则测定的可靠性越强，但竞争用抗体均为相应抗原免疫动物所得，与机体感染病毒后所产生的抗体肯定会有所差异，因而在目前HBeAb和HBcAb的临床检测中，常有难以解释的测定结果出现，这与其在方法学上的固有缺陷是分不开的。
4.固相捕获法在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗-HAV IgM、急性HBV感染的血清抗-HBc IgM和TORCH 项目的系列IgM检测等。目前，最为常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体（抗人μ链）作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体（特异的和非特异的）即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，当其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下。
（1）首先将抗人IgM μ链抗体于碳酸盐缓冲液中2~8℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部份及杂质。
（2）加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗μ链抗体反应而吸附于固相上。
（3）加入特异的抗原如甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）抗原、HBcAg 等，温育一定时间后，洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。
（4）加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物；
(5) 加入酶底物，温育显色测定（图10）。
采用上述模式要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）由于其能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）
反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。样本稀释后，上述产生干扰作用的非特异IgM
含量减少，而特异IgM由于处于相应病原体的急性感染期，滴度很高，一定稀释后，不会有明显影响，况且，在某些病原体如HBV的慢性感染阶段，IgM类特异抗体也能持续存在，只不过滴度要低很多。因此，如不对血清样本稀释，就直接检测，即使是没有非特异IgM的干扰，阳性测定结果也没有急性感染的诊断价值。现在，有些试剂生产厂家，由于临床实验室减轻劳动强度、简便操作的要求，生产了不需对样本进行稀释的抗-HAV IgM和抗-HBc IgM ELISA试剂盒，但用其检测临床标本得到的结果，很难具有急性感染诊断的价值。因此，我们建议临床实验室在做抗-HAV IgM和抗-HBc IgM等类检测时，应使用对样本进行稀释的试剂盒，以保证检测的临床价值。