生物分离工程复习

1、生物分离工程：回收生物产品分离过程的原理与方法，即从发酵液、酶反应液、动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。

预处理（加热、调ph、絮凝）→细胞分离（过滤、离心、膜分离）→细胞破壁（匀浆法、研磨法、酶解法）→碎片分离（离心、膜分离）→提取（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）→精制（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）→成品化（浓缩、干燥、无菌过滤）

2、细胞分离的主要技术手段：重力沉降、离心沉降、过滤。

3、离心分离的原理、方法和设备。

原理：离心沉降是在离心力的作用下发生的。方法：差速离心分级和区带离心。

设备：低速离心机、高速离心机、超速离心机（按离心力）；管式离心机和碟片式离心机（按工业应用）。

4、悬浮液预处理方法和目的。

方法：加热、调ph、凝聚、絮凝、惰性助滤剂。

目的：提高过滤速度和过滤质量。

5、包含体的解决方法：分离纯化；溶解；变性蛋白质复性和重新氧化；蛋白质一般的分离纯化。

6、沉淀概念与结晶区别。

沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低生成固体凝聚物的现象。

区别：沉淀为不定形的固体颗粒，构成成分复杂，纯度低；结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出。

7、蛋白质表面性质：表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成；水溶液呈胶体；周围存在与蛋白质分子结合的水化层，分子间有静电排斥力（防止蛋白质凝聚沉淀）。

8、影响盐析因素：无机盐、温度和ph。

渗透气化（蒸气压差）

以分离应用领域分类——微滤、超滤、反渗透、透析、电透析、亲和过滤、渗透气化

反渗透、超滤和微滤的差别和共同点:

反渗透传质推动力：压差1.0～10MPa 应用举例：盐、氨基酸、糖的浓缩

超滤传质推动力：压差0.1～1.0MPa 应用举例：蛋白质、多糖的回收和浓缩

微滤传质推动力：压差0.05～0.5MPa 应用举例：除菌，回收菌，分离病毒

微滤、超滤、纳滤、反渗透相同点：

①以膜两侧压力差为推动力；②按体积大小而分离③膜的制造方法、结构和操作方式都类似。微滤、超滤、反渗透区别：

膜孔径：微滤0.1-10μm > 超滤0.01-0.1μm > 反渗透小于0.001μm

分离粒子：微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、反渗透为分子级水平的分离；分理机理：微滤、超滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程：

压差：微滤、超滤压力差不需很大0.1-0.6 MPa

11、渗透气化的原理与用途:。

原理：疏水膜的一侧通入料液，另一侧抽真空，使膜两侧产生溶质分压差。在分压差的作用下，料液中的溶质溶于膜内，扩散通过膜，在透过侧发生气化，气化的溶质被膜装置外设置

的冷凝器冷凝回收。疏水性较大的溶质易溶于疏水膜，渗透速度高，在透过一侧得到浓缩。用途：利用溶质之间膜透过性的差别，特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。

12、不对称膜的结构：膜在厚度上的孔道结构不均匀，由起膜分离作用的表面活性层（0.2-0.5um）和起支撑作用的惰性层（500-100um）构成。

13、浓度极化和凝胶极化的概念。

浓度极化模型：膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高。这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化。

凝胶极化模型：当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。分离含有菌体、细胞和其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。这种现象称为凝胶极化。

14、截留相对分子量：一般截留率为90%的溶质分子量。

15、过滤速度与压力的关系。

1）当Δp较小时，无浓度极化层，Jv与Δp成正比，此时：

2）当Δp逐渐增大时，有浓差极化，Jv的增长速率减慢，此时：

3）当Δp继续增加时，形成凝胶层，且厚度随压力的增大而增大，所以Jv不再随Δp的增加。此时的Jv为此流速下的极限值(Jlim)，用方程：

4）Jlim随料液浓度升高而降低，随流速(搅拌速度) 升高而升高。

16、根据弱电解质的萃取理论分析青霉素萃取、反萃取条件的选择。

青霉素是有机酸，ph值对其分配系数有很大影响。选择适当的pH，有利于提高青霉素的收率, 还可根据共存杂质的性质和分配系数提高萃取的选择性。1）青霉素萃取：较低pH下有利于青霉素在有机相中的分配。2）青霉素反萃取：pH大于6.0时，青霉素几乎完全分配于水相中。

17、双水相系统是指某些高分子聚合物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。常见的双水相系统：PEG/磷酸钾、PEG/磷酸铵，PEG/Dx。

18、双水相系统蛋白质的分配平衡决定因素、影响因素：1）分配系数 m＝c2/c1 ；2）m贡献因子me、mh和ml分别为静电、疏水和亲和作用对溶质分配系数m的贡献；3）静电作用；4）疏水作用

19、液膜概念及液膜萃取的优点和乳状液膜的膜溶液组成。

液膜是由水溶液或有机溶剂（油）构成的液体薄膜。

优点：同时实现萃取和反萃取，简化分离过程、提高分离速度、降低设备投资和操作成本。乳状液膜的膜溶液组成：膜溶剂、表面活性剂和添加剂。

20、液膜萃取的3种机理：

单纯迁移：达到平衡时，溶质迁移不再发生。这种萃取机理的液膜分离无溶质浓缩效应。反萃相化学反应促进迁移：与单纯迁移相比，溶质在反萃相可得到浓缩，萃取速率快。

膜相载体输送：目标产物通过萃取剂C的搬运从料液一侧转入到反萃相，而萃取剂C在浓差作用下从膜相的反萃液一侧扩散到料液相一侧，重复目标产物的跨膜输送过程。

21、为什么反胶团萃取可用于蛋白质类生物大分子的分离纯化？溶解的推动力有哪些？

因为反胶团内微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。因此反胶团萃取可用于氨基酸、多肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。

溶解推动力：1）静电作用 2）空间相互作用 3）疏水性相互作用

22、超临界流体、超临界流体萃取的概念、优点、用途

超临界流体对脂肪酸、植物碱、醚类、酮类、甘油酯等具有特殊的溶解作用，可用于这类物质的萃取分离。利用超临界流体为萃取剂的萃取操作称为超临界流体萃取。萃取速度高于液体萃取，特别适合于固态物质的分离提取。

优点：操作条件接近常温，能耗低，适于热敏性物质和易氧化物质的分离、传热速率快，温度易于控制、适于非挥发性物质的分离。

用途：提取固体内有用成。

23、超临界流体萃取设备通常由溶质萃取槽和萃取溶质的分离回收槽构成，操作方法分等温法、等压法和吸附法。

24、物理吸附、化学吸附、离子交换3种吸附作用力的原理及脱附方法。

物理吸附：基于吸附剂与溶质之间的分子间力。溶质在吸附剂上吸附与否或吸附量的多少取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性，可通过改变温度、pH值和盐浓度等物理条件脱附。

化学吸附：吸附剂表面活性点与溶质之间发生化学键合、产生电子转移现象，吸附稳定，不易脱附。采用破坏化学键合的化学试剂洗脱剂脱附。应用很少。

离子交换：所用吸附剂称为离子交换剂，表面键合离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。一般通过提高离子强度或调节pH值的方法洗脱。

25、离子交换剂的分类

阳离子交换剂：对阳离子具有交换能力，活性基团为酸性，分为强酸性和弱酸性阳离子交换剂。

阴离子交换剂：对阴离子具有交换能力，活性基团为碱性，分为强碱性和弱碱性阴离子交换剂。

按离子交换剂适用的生物分子大小分类：

小分子类交换剂：苯乙烯-二乙烯苯型、丙烯酸-二乙烯苯型、酚醛型等，用于无机离子交换和有机酸、氨基酸、抗生素等生物小分子的回收、提取。

高分子类交换剂：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素和亲水性聚乙烯等，用于蛋白质分离纯化。

26、固定床单柱吸附操作过程

吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。从吸附柱入口开始，吸附剂的溶质吸附浓度不断上升，达到饱和吸附浓度q0（与入口料液浓度c0相平衡的吸附浓度）。当吸附柱内全部吸附剂的溶质吸附接近饱和时，溶质开始从柱中流出，出口浓度逐渐上升，最后达到入口料液的溶质浓度，即吸附达到完全饱和。

27、膨胀床吸附技术的用途：膨胀床吸附技术可以直接从含颗粒的料液中提取生物大分子物质，将固液分离和吸附过程结合起来，例如从IgG-酵母匀浆系统和大肠杆菌匀浆液中，分别提取目标产物。

28、、色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动达到分离的方法。

29、按应用目的分：分析性色谱和制备性色谱；按流动相的相态分：气相色谱、液相色谱和超临界流体色谱；按固定相形状分：柱层析、纸层析和薄层层析；按压力分：低压色谱、中压色谱和高压色谱；按流动方式分：轴向流色谱和径向流色谱；按展开方式分：洗脱色谱、迎头分析法和置换色谱；按分离机理分：凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、疏水性相互作用色谱和亲和色谱。

30、、分配系数是组分在固定相和流动相中的浓度之比。保留时间是试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。保留体积是指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。

31、排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。溶胀率是指溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数。床体积是指1g干燥凝胶溶胀后的体积。

32、反向色谱利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。流通色谱利用含有大穿透孔的介质为固定相的液相色谱法。

33、亲和作用均指生物分子间的特异性结合作用。

34、、亲和色谱原理：利用亲和吸附作用分离纯化生物物质。操作：进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生。

35、亲和色谱填料的制备过程：载体的选择、载体的活化和配基的连接。

36、特异性洗脱和非特异性洗脱的比较：

特异性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。

非特异性洗脱：通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。

37、等电点聚焦概念：等电点聚焦利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。

凝胶色谱和凝胶电泳蛋白质分子量与速度的关系，原理区别： Lgu=lgu0-KTg

原理：凝胶电泳是区带电泳分离方法，主要利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。

38、什么是不连续凝胶电泳？简述其分离的原理。

凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成：上层凝胶浓度较低（2-3％），为大孔径的浓缩胶，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶浓度较高（5-25％），为小孔径的分离胶，各个组分根据迁移率的差别分离。当蛋白质的pI小于8-9.5时，一般电极缓冲液采用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

39、双向电泳概念：双向电泳同时利用分子尺寸和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通凝胶电泳和等电点聚焦相结合，使溶质在二维平面上得到分离。原理：在凝胶电泳槽的y方向上凝胶具有逐渐增大的浓度分布， x方向上具有pH梯度。首先在x方向上电泳，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当pH值的缓冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及相对分子质量的影响，相互之间得到进一步的分离。