亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识
亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专
一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一
种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特
异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如
抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的
这种特异亲和能力又叫亲和力。
亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为
配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认
为是激素的配体。
其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
二、固相载体的选择
对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。
三、配体的选择
亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。常用的配位体如下：
（1）三嗪染色剂，用于蛋白质的纯化；
（2）酶的底物或偶联因子，用于特定酶的纯化；
（3）抗体，用于相应的抗原；
（4）蛋白质A，用于IgG抗体的纯化；
（5）单链寡核苷酸，用于互补的核酸如mRNA，或特定的单链DNA序列；
（6）凝集素，用于特定的单糖亚基。
正确地选择合适的配体以及合适的结合方式，对获得具有优良分离效果和较大容量的载体同样具有重要作用。能与分离物质牢固、特异和可逆结合的物质都可以作为配体。选择配体有两个条件：第一是生物大分子与配体间具有合适的亲和力，亲和力太强，洗脱条件剧烈，易造成生物大分子失活，亲和力太小，解离容易，结合率不高。第二是配体要具有双重功能，既有可牢固与载体结合的基团，结合后又不影响生物大分子与配体间的亲和力。
亲和色谱要取得成功，配体结合在载体上并不是唯一的因素。具有同等重要的是要完全地从载体上除去非共价结合的配体。因此，应当十分认真地清洗并检查清洗的情况。
与载体共价偶联酶的功能团包括：
(1)氨基：赖氨酸的ε—氨基和多肽键N末端的α－NH2。
(2)羧基：天门冬氨酸的β－羧基，谷氨酸的α—羧基和末端的α—羧基。
(3)酚基：酪氨酸的酚环。
(4)羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基。．
(5)巯基：半胱氨酸的巯基。
(6)咪唑基：组氨酸的咪唑基。
(7)吲哚基：色氨酸的吲哚基。
四、配体与载体之间的偶联
琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和色谱的优良载体。琼脂糖凝胶结构开放，通过性好，酸碱处理时相当稳定，物理性能也好。琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐，并能在温和的条件下与氨基等基团作用而引入配体，亲和色谱中最为常用的琼脂糖凝胶的型号是Sepharose–4B。
在琼脂糖与溴化氰活化后，再与生物大分子结合形成亲和色谱填料是亲和色谱中最为常
用的一种。
金属螯合层析介质
金属螯合层析介质（征求意见稿） 编制说明 《金属螯合层析介质》 国家标准起草工作小组 二〇一九年一月
《金属螯合层析介质》国家标准 编制说明 （征求意见稿） 一、任务来源 本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》，项目编号“2016YFF0202304”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。 二、目的和意义 金属螯合层析是近40年来出现的一种亲和层析技术，也称固定化金属离子亲和层析。它于1975年首先被Porath和他的合作者们成功用于分离纯化人血清蛋白，并在此后的三十年里迅速发展。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质分离。高流速琼脂糖金属螯合层析介质是将亚氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等配基键合在高流速琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+（或其它金属离子）而形成的一种亲和层析介质[1]（图1）。该类层析介质具有吸附容量大、选择性好、分辨率高、易于再生以及成本较低等优点，在标签蛋白等生物大分子纯化领域具有极为广泛的应用。 图1 金属螯合层析介质（IDA）结构示意图（X可以是H2O、缓冲液中离子以及蛋白配体等） 目前国内外已有多家企业进行金属螯合层析介质的生产，由于缺乏相应的国家标准，金属螯合层析介质的性能要求没有统一标准，从而对其应用造成很大困
扰，严重阻碍该类介质和层析技术的应用发展水平，对我国生物产业产生不利影响。以金属螯合层析介质的载量测定方法为例，一种方法是将介质装柱并连在层析仪上，平衡后经含有His-乳酸脱氢酶的样品上样，上样结束后，依次经淋洗和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液中蛋白含量计算洗脱载量；另一种方法是用纯His-乳酸脱氢酶上样，依次经平衡和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液蛋白含量计算洗脱载量。这两种方法测定同一介质样品得到的结果具有明显差异。类似问题也出现在其他的参数测定上。因此建立关于金属螯合层析介质的国家标准具有重要意义。在此基础上，通过标准化工作提高介质及相关技术发展水平，促使我国相关产业在国际贸易方面取得话语权，推动我国层析介质及相关产业在国际上占有一席之地。 三、标准制定原则 （一）标准编制原则 金属螯合介质属于生物体系分离材料，重点围绕介质的主要性能要求，设定相应技术内容。在确保产品质量的基础上，充分体现产品的特点。 （二）标准制订主要依据 1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。 2、标准编写内容参考我国与化学品相关的法规、标准，包括GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备、GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备等等。 四、标准主要技术内容 （一）标准适用范围的说明 本标准规定了金属螯合层析介质的质量要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存的标准。 本标准适用于骨架为琼脂糖微球的金属螯合层析介质的生产与检测。 （二）内容提要 金属螯合层析介质的主要理化性质包括外观、粒径、流速、配基密度、动态载量、微生物污染和化学稳定性等。
高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率
2011年4 月Vo.l 29No .4 April 2011 Chi n ese Journal of Chromatography 358~361 研究论文 DOI :10.3724/SP .J .1123.2011.00358 *通讯联系人:张秀莉,副研究员,主要研究天然小分子和多肽的分离分析.Te :l (0411)84379521,E m ai:l zhangx i uli @dicp .ac .cn .基金项目:重大新药创制专项(N o .2009ZX 09313 003)和国家自然科学基金面上项目(No .30801513).收稿日期:2010 12 08 高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率 蔡晓明1 , 张 岩2 , 于 龙1 , 郭志谋1 , 张秀莉1* , 梁鑫淼 1 (1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析重点实验室,辽宁大连116023; 2.Un ivers ity of C alifon ia Irvi ne ,CA 92697 4625,USA ) 摘要:采用高效亲和色谱技术(HPAC )对中药成分与人血清白蛋白(HSA )的相互作用进行了研究。首先采用点击化学的方法制备了表面键合有HSA 蛋白的硅胶固定相并装填成亲和色谱柱,根据药物在该色谱柱上与空白硅胶 柱上的保留时间差计算得到药物与蛋白的结合率。利用该方法测得模型化合物华法令与H SA 的结合率与文献中采用超滤法测得的结果基本一致,表明该方法可用于测定药物与HSA 的结合率。在此基础上用该方法测定了葛根素和告依春两种中药成分与HSA 的相对结合率分别为10 26%和10 20%。同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率为14 25%。结果表明,HPAC 可以作为研究药物与蛋白相互作用的一种简便可行的方法,其测定结果与超滤方法一致。 关键词:高效亲和色谱法;人血清白蛋白;葛根素;告依春;结合率;超滤 中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2011)04 0358 04 Detection of drug hu m an seru m albu m in b ind i ng ratios of t wo Ch i nese m edici nal ingred ients by h igh perfor m ance affinity chro matography CAI Xiao m i n g 1 ,Z HANG Yan 2 ,YU Long 1 ,GUO Zhi m ou 1 ,ZHANG X iuli 1* ,LI ANG X in m iao 1 (1.CAS K ey L abora tory of Sepa ra tion Sc ien ce for An a ly tica l Che m istry ,D a lian In stitu te o f Che m ica l Phy sics,Chin ese Acade m y o f Scie n ces,Da lian 116023,Ch i n a; 2.Un iver sity o f Ca lifon ia Ir vin e,CA 92697 4625,U SA ) A bstract :The i n teraction of t wo Chinese m edici n al i n gredi e nts and hum an seru m al b u m in (HSA )has been investigat ed by high perf or m ance affi n it y chro m atography (HPAC ).HSA bounded silica based stati o nary phase w as prepared based on t he click chem istry strategy ,and packed in a colu m n (nam ed as HSA col u m n).The drug HSA binding rati o was calculated fro m t he diff erence of t he drug s ret enti o n ti m es on the H SA colu m n and silica col u m n (blank col u m n).T he warfari n HSA bindi n g rati o det er m ined by t his m ethod was s i m ilar to t he refer ence reported value by ultrafiltration m et hod .The results i n dicat ed that the new HSA colu m n and t he HPAC m et hod can be used for t he detection of binding ratio of drug and HSA .T he bi n di n g ratios of puerari n and goitri n deter m i n ed by the HPAC m ethod were 10 26%and 10 20%,respecti v e l y .And the binding rati o of puerarin deter m i n ed by ultrafiltrati o n was 14 25%.A ll t hese results showed t hat HPAC is a usef ul m et hod t o i n vestigate the interacti o n bet ween drugs and protein . K ey words :high perf or m ance affinity chro m atography (HPAC);hu m an seru m albu m i n ;puer ari n ;goitrin ;binding ratio ;ultrafiltration 人血清白蛋白(hu m an seru m albu m in ,HSA)是由585个氨基酸残基组成的一条单肽链,相对分子质量约为66500,是血浆中含量最丰富的重要载 体蛋白[1] 。H SA 上有多个药物结合位点,药物进入 血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被输送到身体的各个部位产生药效。药物进入体内后的许多重
A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体
摘要：世界首个单克隆抗体（monoclonal antibody，简称单抗）于1986 年，获得美国食品与药品监督管理局的上市批准，拉开了单抗药物发展的序幕，成为生物医药领域中最耀眼的明珠。单克隆抗体纯化过程中a蛋白（protein a）层析介质的选择尤为重要，可以影响抗体的纯度。本文主要阐述单抗纯化过程中a蛋白亲和层析的相关内容。 关键词：a蛋白；耐碱性；动态载量 全球医药行业走向趋势是精准医疗时代，单抗是其中较为成熟的领域，引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单抗药物主要是由中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary cell，简称 cho 细胞）表达产生，由 cho 细胞分泌的外源蛋白分子，通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化，其产量已达5-10g/l，同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化，单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。 根据终产品纯度、杂质含量的严格要求，单抗目前采用三步纯化策略：粗纯（样品捕获）、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的 50%-80%。用a蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤，一步纯化可使蛋白纯度达 95%以上。但a蛋白树脂价格昂贵，在大规模生产中，a蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的 35%以上。因此，蛋白 a 纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。 1 a蛋白的性质金黄色葡萄球菌 a蛋白（staphylococal protein a，spa）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是igg）的fc区域结合。天然的a蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为 a275nm %=1.65，等电点为ph5.1。spa十分稳定，用4mol/l尿素、硫氰盐酸、6mol/l的盐酸胍和ph2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的spa 54kd，去掉与细胞壁结合部分的spa 42kd。spa与igg结合的亚类主要是igg1、igg2和igg4。近几年来基因工程的spa出现，解决了天然a蛋白的耐碱性问题，mabselect sure是基因工程的spa，去掉了天然spa的dace 区域，对于b区域进行了修饰，将不耐受naoh的氨基酸去掉。使修饰后的spa可以耐受0.1-0.5m的naoh；这就很好的解决了层析介质cip的问题，同时修饰后的spa也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对spa的作用，使洗脱收集液中spa的脱落更低。 2 结合单抗的a蛋白层析介质的选择 在a蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是hcp和基因组dna；由于a蛋白层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱ph，加入添加剂等；在此捕获步骤中会有a蛋白（配基）的脱落。在a蛋白捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基a蛋白，以及a蛋白与介质骨架的偶联方式，这些都是protein a的脱落原因，所以选择a蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。 2.1 a蛋白层析介质相关指标 耐碱性：药物gmp生产最基本的要求是无菌、无热源。naoh 是最好的除菌、出热源的试剂。同时naoh也是公认的cip试剂，使用naoh 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；?郧?naoh的成本低。naoh是公认的cip试剂，实验表明，naoh的清洗效果高于其他试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（cpg）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。cpg填料在高ph下不稳定，不适合用naoh 清洗。传统的a蛋白的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，?郧以谂渲檬
重组蛋白和多肽的分离纯化
重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响，通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋
郑大远程教育《现代色谱分析》在线练习参考答案
郑大远程教育《现代色谱分析》在线练习参考答案 你当前正在学习《现代色谱分析》课程01版，本课程共4学分，分6个教学章。考试形式：撰写论文；考试级别：远程教育学院。 本课程你已通过考试，并取得了学分。成绩是：89 《现代色谱分析》第01章在线测试的得分为 20分 恭喜，交卷操作成功完成！你本次进行的《现代色谱分析》第01章在线测试的得分为20分（满分2 0分），本次成绩已入库。若对成绩不满意，可重新再测，取最高分。 测试结果如下： ? 1.1 [单选] [对] 气相色谱应归属的范畴是（A ） ? 1.2 [单选] [对] 毛细管电色谱所依靠的驱动力为（B ） ? 1.3 [单选] [对] GLC、LLC均应归属于（ B）、 ? 1.4 [单选] [对] 能将分离分析一次完成的方法是（D ） ? 1.5 [单选] [对] 1952年获诺贝尔化学奖的学者是（ B） ? 2.1 [多选] [对] 按流动相的状态分类，色谱法可分为（ ABC） ? 2.2 [多选] [对] 按操作形成分类，色谱法可分为（ABC ） ? 2.3 [多选] [对] 属分配色谱范畴的是（AB ） ? 2.4 [多选] [对] 属吸附色谱范畴的是（ CD） ? 2.5 [多选] [对] 制备型色谱仪主要用于（AB ） ? 3.1 [判断] [对] 薄层色谱属于液相色谱的范畴。（V ） ? 3.2 [判断] [对] 离子交换色谱和离子色谱的原理是一样的。（ X） ? 3.3 [判断] [对] 色谱法对分析对象的鉴别力是较强的。（X ） ? 3.4 [判断] [对] 亲和色谱用于分离纯化生化样品。（V ） ? 3.5 [判断] [对] 色谱法是用于分离有色物质的技术。（X ） 《现代色谱分析》第02章在线测试的得分为 20分 恭喜，交卷操作成功完成！你本次进行的《现代色谱分析》第02章在线测试的得分为20分（满分2 0分），因未超过库中记录的成绩18分，本次成绩未入库。若对成绩不满意，可重新再测，取最高分。 测试结果如下： ? 1.1 [单选] [对] 分离度增加一倍，柱长增加的倍数是（D ） ? 1.2 [单选] [对] 容量因子的表示式为 C ? 1.3 [单选] [对] 两组分的保留时间分别为8.0和10.0min，峰宽分别为2.8和3.2mm，记录纸速为5.0mm/min，则两峰的分离度为（B ） ? 1.4 [单选] [对] 描述组分在流动相与固定相间的“平衡”关系的参数是（ D） ? 1.5 [单选] [对] 色谱的定性参数有（ D） ? 2.1 [多选] [对] 描述色谱流出曲线的基线情况，可用的参数是（AB ） ? 2.2 [多选] [对] GC中纵向扩散项受影响的因素有（ABC ）
亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识 亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专 一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一 种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如 抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的 这种特异亲和能力又叫亲和力。 亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为 配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认 为是激素的配体。 其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 二、固相载体的选择 对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。 三、配体的选择 亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
蛋白质纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
重组蛋白纯化基本策略
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 二、性能参数： 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤： 1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min；
快速高效偶联亲和层析介质试剂盒试用装说明书
快速高效偶联亲和层析介质试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：CDI预活化琼脂糖凝胶4B试剂盒。 商品名称：快速高效偶联试剂盒。 【包装规格】 20mL活化柱+500mL缓冲液/盒，附送亲和层析用空柱一支。 【预期用途】 快速高效偶联试剂盒适用于亲和层析填料的快速制备以及固相吸附、固定化酶等用途。
【主要组成成份】 ●预活化琼脂糖凝胶4B ●缓冲液 【原理】 本试剂盒系用优质琼脂糖凝胶4B活化后存放于保护液中和适合的偶联缓冲液制成，用活性咪唑碳酸酯基团偶联需要的配体。 使用时，保护液被洗去后就可使欲偶联的配体的氨基和活性咪唑碳酸酯反应，脱去咪唑基，使得配体的氨基通过共价键牢固的链接在基质上，即可方便得到高偶联效率的亲和层析填料。 【存储条件和有效期】 存储条件：原包装应储存于4-8 C。密封保存在阴凉干燥处切忌冷冻。有效期：一年。 【适用仪器】 本产品无需特殊仪器辅助使用，只需要在操作时使用抽滤装置帮助抽去洗涤液，以免洗涤时间过长造成偶联效果不理想。 附送的亲和层析空柱可安装适合的接口用于自动纯化仪。 【配体要求】 配体溶液的质量至关重要。配体需溶解于偶联缓冲液中并使得浓度大于15mg/mL，并且浓度越大，偶联效果越好，如已经溶解在其他缓冲液中，可用偶联缓冲液透析平衡。 【偶联方法】 方法一： 1、预先准备好溶解在偶联缓冲液中的配体（可用直接溶解或透析
方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。 2、将活化琼脂糖摇匀，倒入抽滤漏斗，加5倍体积的去离子水，抽气至快干时拔掉抽气管，注意不可抽干，此步速度宜快。 3、用配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），室温3小时或4摄氏度过夜，然后洗净即可。洗出来的配体可回收使用。 此方法适用于比较昂贵的配体。 方法二： 1、用干燥枪头吸去保护剂。制备配体在溶液B中的溶液（可用直接溶解或透析方法制备），浓度>15mg/ml或者更高，浓度越高偶联效果越好。 2、用5倍以上体积配体溶液悬浮抽滤漏斗里的琼脂糖固体，4度摇床缓慢振荡（不可使用磁力搅拌器），过夜后用适当缓冲液洗净即可。洗出来的配体可回收使用。 此方法适用于比较廉价的配体。 注意： 如果配体不耐高pH条件，可以用1M盐酸调节缓冲液至适合pH。 【装柱】 塑料层析柱 1、将层析柱固定，封闭层析柱下端出口，向柱内充入去离子水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。 2、先将介质混匀，打开层析柱下端出口，排出柱中去离子水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用导流棒沿内壁倒入介质或移液枪吸取介质，将介质加入到层析柱中；静置，待介质自
第十八章 高效液相色谱法
1、简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 2、什么是化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？ 化学键合相：化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相，简称键合相。 ①非极性键合相。例如十八烷基硅烷（ODS）。通常用于反相色谱。 ②弱极性键合固定相。常见的有醚基和二羟基键合相。这种键合相可作为正相或反相 色谱的固定相，视流动相的极性而定。这类固定相应用较少。 ③极性键合相。常用氨基、氰基键合相。一般都用作正相色谱的固定相，但有时也用 于反相色谱。氰基键合相与双键化合物可能发生选择性作用，因而对双键异构体或 含双键数不同的环状化合物有较好的分离能力。氨基键合相兼有氢键接受和给予两 种性能。对多功能基化合物有很好的分离选择性。氨基键合相上的氨基可与糖分子 中的羟基选择性作用，因此在糖的分离中广泛使用。在酸性介质中它还是一种弱阴 离子交换剂，能分离核苷酸。 3、什么是正相色谱？什么是反相色谱？各适用于分离哪些化合物/ 正相色谱：固定相极性大于流动相极性的色谱。主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。 反相色谱：固定相极性小于流动相极性的色谱。适合分离非极性至中等极性的组分，由它派生的离子抑制色谱法和反相离子对色谱法，还可以分离有机酸、碱及盐等离子型化合物。 4、简述反相键合相色谱法的分离机制。 387页。 原理：将离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法，称之为离子色谱法。 应用范围：一些在可见或近紫外光区没有吸收，难于用紫外—可见检测器进行检测的无机离子等。 原理：把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。分析酸类或者带负电荷的物质时，一般用季铵盐作离子对试剂，分析碱类或者带正电荷的物质时，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐作离子对试剂。 应用范围：适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。 原理：在反相色谱中，流动相的pH变化会改变溶质的离解程度，在其他条件不变时，溶质的离解程度越高，k值越小。因此常加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的疏水缔合作用，已达到分离目的。一般来说对于弱酸，降低流动相的pH，k增大，t R增大。对于弱碱，则需提高流动相的pH，才能使k增大，t R增大。 应用范围：适用于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。 6、亲和色谱的分离机制是什么？有何特点？ 亲和色谱法（AC）是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂试样中分离和分析能产生专一性亲合作用的物质的一种色谱方法。亲和色谱是基于试样中组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的。当含有亲何物的试样流经固定相时，亲和物
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分