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动物转基因技术的研究现状与应用
课程：基因工程姓名：迪丽努尔·尼扎木墩学号：2013081605
摘要转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导人动物染色体基
因组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。转基因技术的一般方法有原核期胚胎的显微注射法（Microjection）、逆转录病毒载体法、精子载体法、体
细胞核移植技术、胚胎干细胞介导的基因转移，这几种方法各有其公优缺点，在动物转基因上均有不同的应用，目前在动物抗病育种、建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、利用转基因动物生产药用蛋白质等方面应用越来越广泛。
关键词转基因技术方法研究现状
转基因动物（transgenicanimal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因（transgene），而整个技术则称为转基因技术（transgenictechnology或transgenesis）[1]。现代转基因动物（tx-ansgenicanimal）研究始于20世纪80年代以后,1980年，Gordon等首次获得转基因小鼠目前除转基因小鼠外，转基因兔、绵羊、猪、牛及转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成[2，3]。本文将从转基因动物的原理、
主要方法和应用等方面作一综述。
1转基因技术的一般方法
能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递，主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。迄今为止，能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几种[4]：
1.1原核期胚胎的显微注射法（Mi-crojection）
该法由美国人Gordon发明，其主要步骤包括：（1）分离、克隆和重组外源基因，构建载体；（2）将融合基因注入受精卵的原核（一般是雄原核）；（3）将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。Palmiter等（1982）将带有小鼠金属硫蛋白I基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵，获得“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单，整合率高，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机，整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。
1.2逆转录病毒载体法
1.2.1逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎：该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列（longtermi-nalrepeats，LTRs）区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点，将外源基因连接到LTRs下部，构建重组载体，直接感染受精卵或微注入囊胚腔中。达到外源基因在宿主染色体上的整合、表达。Salter和Haskell等分别用此方法作出了转基因鸡和牛[5]。
1.2.2逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞：Anthony等[6]（1998）对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短。细胞分裂完成后，核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期
（MⅡ）的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M期的细胞。这为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。研究者利用该方法生产出了4头转乙肝表面抗原基因牛，外源基因在宿主基因组中整合的成功率为100%。逆转录病毒载体法导入外源基因的感染率高，宿主范围广，而且最重要的是外源基因在宿主染色体上以单拷贝整合，有利于研究基因的结构、功能及表达调控。目前，这一特性已被广泛应用于基因定位整合等方面的研究中。
1.3精子载体法
该方法由Brackett最早提出，其要点是精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，受精后能发育成转基因动物[7]。该方法简单，但其整合率低，已采用脂质体包埋法对其进行了改进。其改进方法是将外源DNA在与精子共同孵育之前用脂质体包埋，脂质体与DNA相互作用形成脂质体-DNA复合体。这种复合体借静电作用吸附于精子表面，与细胞膜融合，将外源基因导入细胞并获得表达[8]。这二种方法都是通过人工授精将外源DNA导入卵母细胞，产生转基因动物。Anthony等[9]尝试了一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1min，然后将精子的头部显微注入MⅡ期的小鼠卵母细胞，在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20%以上。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜，更有益于转基因动物的获得。
1.4体细胞核移植技术
世界首例体细胞核移植哺乳动物克隆羊Dolly的诞生，是转基因动物研究史上的又一重大突破。1997年英国PPI公司与罗丝林研究所的科学家联手通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊[10]。研究者们用人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因共同转导绵羊胎儿成纤维细胞，然后用G4l8筛选和DNA杂交的方法鉴定其中同时整合了上述两个基因的细胞，以同时整合了两个基因的绵羊胎儿成纤
维细胞作核供体，获得了3只转基因绵羊。Alexan-der等[11]用非转基因母羊与
转基因公羊精子人工授精后怀孕40d的胎儿成纤维细胞作核供体，获得了3只转人抗胰蛋白酶基因的奶山羊。毫无疑问体细胞核移植技术可以实现转基因的目动物转基因技术的研究现状与应用2010年10月畜禽业总258期育种繁殖的，并且出生的后代个体100%为转基因个体。这是因为用作核供体的细胞是确证整合了某一外源结构基因的细胞。一旦核移植成功，就意味着得到了转基因动物。
1.5胚胎干细胞介导的基因转移胚胎干细胞（EmbryonicStemCells，ES细胞）是动物早期胚胎（桑葚胚或囊胚）或原始生殖细胞（Primor-dialGermCells，PC-Cs）在体外经分化抑制培养并传代而筛选出来的具有发育全能性的细胞。ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的高度分化潜能，当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。将目的基因转移入ES细胞重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ES细胞进行克隆，可培育转基因个体。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。
2转基因技术的应用
转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基因组,并能遗传给后代的动物。目前,转基因动物的研究主要包括三个方面: (1)利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造具有生物活性的产物,包括器官移植和生物反应器。
(3)利用转基因动物确定研究手段,包括建立疾病模型和发育调控。
2.1在基础理论方面的应用
由于外源动物基因可在转基因动物细胞中整合、表达，并制约于受体基因背景
的调控，因此，可把转基因本身当作一个理想的功能标记，进而在理论实践方
面得到应用：可以对基因的结构和功能进行研究，可以进行组织表达特异性研究,还可以研究发育过程的特异性表达并进行了有意义的探讨。
2.2动物抗病育种
利用转基因技术有可能在较短时间内培育出常规方法不能或需长期培育才能育
成的品种或种群Rosengard等（1995）将人的补体抑制因子－衰退加速因子（hDAF）转移至猪胚中，有27头转基因猪表达hDAF。我国湖北畜牧所与同济
医科大学合作。已经获得表达外源hDAF的猪7头使用转基因技术不仅可以加
快动物改良进程，使选择效率提高[13]。1986年，中国科学家第一次把生长澈
素基因成功地转移到金鱼体内，以后又成功地把人类、小鼠和其他鱼类的基因
转移到多种鱼体内。美国科学家也成功地把某种生长基因转移到另一种鱼体内，转基因鱼生长速度加快了，体型也变大了，这就是人们称谓的了“兰色革命”。2.3促进动物生长
生长激素(GH)基因是转基因研究中最早运用的,至今已生产出转基因家禽、啮齿类、鱼类、昆虫等多种属性的动物。Hammer等[10](1985)利用显微注射法将人
生长激素基因转移到兔、绵羊和猪中均获得成功。国内外大量的转基因家畜GH 均能表达,但GH的表达水平在不同的转基因实验之间和同一转基因实验的不同
动物个体之间差异很大。国外生产的转基因猪中GH产物得到表达,血浆中GH
水平持续地提高,转基因猪的生长速度比较快,饲料利用率提高17%,胴体脂肪为
对照组的50%。20世纪80年代中后期,新疆畜牧科学院与北京农业大学合作,用
精子载体人工法获得了含有牛生长激素基因的转基因绵羊。结果表明,转基因绵
羊比普通绵羊生长速度快,周岁体重较高。有不少研究发现,在提高动物生长速度的同时也带来了一些副作用,如在转GH基因动物中,死胎和畸形率较高,得关节炎、
胃溃疡、肾病和繁殖力下降的转基因动物较多,这可能与转基因整合位点不当和GH表达水平失控有关。另外,对猪进行GH基因发现,较异原生长激素基因的猪
生长速度快。
2.4在医学领域中的应用
2.4.1建立诊断和治疗人类疾病的动物模型：在动物转基因技术问世以前，发现
自然突变体几乎是遗传学家获得遗传疾病模型的唯一途径。未来转基因技术在猪、牛、羊、兔等家畜中获得成功,并已得到初步应用,但目前还存在一系列问题
制约着转基因动物的生产规模,限制着转基因动物产品的研究与开发。存在的问
题有:成本高,效率低;转基因的表达不理想;目的基因与动物生产性状的多基因矛
盾突出;社会对转基因动物的可接受性还有待于进一步论证等。虽然转基因技术
还存在一定的局限性,但经过几十年的发展,转基因动物的研究取得了长足的进步,研究方法也日新月异,在各个领域展现出美好的前景。许多生物学家预言“21世纪
将是人类向生物技术要粮食、要奶、肉、蛋的世纪”,利用转基因动物造福人类
的前景无疑是光明而诱人的。目前，遗传学家可以通过精确地失活某些基因或
增强某些基因的表达来制作各种各样的研究人类疾病的动物模型，也可以为研
究诸如AIDS这样的疾病提供合适的动物模型。
2.4.2利用转基因动物生产药用蛋白质：利用动物反应器进行生产的研究是当前
转基因动物研究的热点。作为生物反应器的转基因动物，主要是将某些对人类
医药价值高的蛋白质编码导入动物机体，使这些转基因动物成为生物反应器，
从这些组织、血、尿中提取表达的产物（蛋白质），用它治疗人的疾病。比如说，将人凝血因子基因与牛奶蛋白基因结合，就能在牛乳中提取这种药用蛋白；类
似的还有在猪血中产生人的血红素，而通常产生这类蛋白仅限于人血，来源有限，成本昂贵。美国Genzymltransgenics公司，利用转基因小鼠、转基因牛、
转基因兔和转基因山羊来生产一些医用蛋白质药品已经商品化，其产率可高达10g/L乳汁，个别达35g/L，且成本低于细胞培养的产品。
2.4.3器官移植
器官移植按供体与受体遗体距离的远近可分为两种类型:相近种系和远离种系间异种器官移植。异种器官移植排异反应甚为迅速和剧烈,例如:异种移植的心脏在几分钟至几小时内即可被排斥而丧失功能。为了防止补体介导的异种移植后超
级排异反应,近年来,国外学者提出了两条途径:一条途径是通过对受体动物循环
血中的补体清除,使供体心脏不受补体的攻击。首先采用此法进行猪-猴心脏移植达到了延长心脏存活的目的。另一条途径是通过转基因技术,即通过克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中,使之在供体心血管内上皮表达,采用这种转基因动物心脏进行异种移植后,就可避免超级排异反应的发生,其效果类似于同种心脏移植。
3 存在问题及展望
未来转基因技术在猪、牛、羊、兔等家畜中获得成功,并已得到初步应用,但目前还存在一系列问题制约着转基因动物的生产规模,限制着转基因动物产品的研究与开发。存在的问题有:成本高,效率低;转基因的表达不理想;目的基因与动物生
产性状的多基因矛盾突出;社会对转基因动物的可接受性还有待于进一步论证等。虽然转基因技术还存在一定的局限性,但经过几十年的发展,转基因动物的研究取得了长足的进步,研究方法也日新月异,在各个领域展现出美好的前景。许多生物学家预言“21世纪将是人类向生物技术要粮食、要奶、肉、蛋的世纪”,利用转基因动物造福人类的前景无疑是光明而诱人的。
转基因技术它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔
的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。因此，在
以后的研究工作中应加强以下几方面的工作：（1）进一步加强基础性问题的研究，如在提高基因转移效率和定点整合的方法学方面，应予以优先研究，对一些已用于转移的基因，对其发育和组织特异性表达的基因开关和表达物水平控制的机制，应给予充分重视；（2）加强生物安全意识，对于转基因产物的生物安全应给予充分的重视；（3）进一步控制畜禽疾病，比如说仔猪腹泻和贫血对养猪业危害很大，已知病的发生与乳铁蛋白水平不足有关。如果用转基因技术提高其乳铁蛋白水平，将是一个较根本的防制手段。在广大牧区毒草常常引起家畜中毒，是否可以考虑通过转基因而消除或减少其毒害损失。
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