整合素αvβ3抑制剂西仑吉肽在大鼠急性脑缺血中的作用机制重点
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０３７６－２４９１．２０１６．０７．０１５作者单位：５１８０３６深圳，北京大学深圳医院神经内科通信作者：易黎，Ｅｍａｉｌ：ｙｉｌｉｔｊ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ?基础研究?
整合素αｖβ３抑制剂西仑吉肽在大鼠急性
脑缺血中的作用机制
陆林清方婷周达童晓欣吴军易黎
【摘要】 目的探讨整合素αｖβ３抑制剂西仑吉肽在大鼠急性脑缺血中对血脑屏障通透性、脑水肿、细胞凋亡的影响及其与血管内皮生长因子ＶＥＧＦ变化的关系。方法采用右侧大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型ＭＣＡＯ，造模成功大鼠根据随机数字表法分为（１）治疗组Ａ，尾静脉注射西仑吉肽１００μｇ／ｋｇ（ｎ＝３０）；（２）治疗组Ｂ，尾静脉注射西仑吉肽２００μｇ／ｋｇ（ｎ＝２８）；（３）假手术组，不置入线栓，尾静脉注射生理盐水（ｎ＝３１）；（４）对照组，尾静脉注射生理盐水（ｎ＝２７）。各组均在梗死后１ｈ后治疗，２ｈ再灌注及２４ｈ后处死。检测脑含水量、血脑屏障通透性、梗死面积、细胞凋亡、ＶＥＧＦ、Ｐ－Ｆｌｋ及Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３等指标。结果治疗组Ａ、治疗组Ｂ的脑含水量较对照组降低［（８０．８±１．１）％比（８４．８±１．４）％、（８１．０±１．４）％比（８４．８±１．４）％，Ｐ＜０．０５］；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的ＥＢ含量较对照组降低［（９．２±１．１）μｇ／ｇ比（１２．２±０．８）μｇ／ｇ、（８．６±０．６）μｇ／ｇ比（１２．２±０．８）μｇ／ｇ，Ｐ＜０．０５］；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的ＴＵＮＥＬ阳性细胞数较对照组减少［（３６±４）个比（６９±６）个、（３５±３）个比（６９±６）个，Ｐ＜０．０５］；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的梗死面积较对照组降低［（３１．９±４．９）ｍｍ３比（４３．０±２．２）ｍｍ３、（２９．２±３．５）ｍｍ３比（４３．０±２．２）ｍｍ３，Ｐ＜０．０５］；与对照组比较，治疗组Ａ、治疗组Ｂ的ＶＥＧＦ、Ｐ－Ｆｌｋ、Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３等蛋白表达降低（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ、治疗组Ｂ与假手术组比较，脑含水量、血脑屏障通透性、梗死面积及ＶＥＧＦ、Ｐ－Ｆｌｋ、Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达及凋亡细胞数降低（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ与治疗组Ｂ比较，脑含水量、血脑屏障通透性、梗死面积及ＶＥＧＦ、Ｐ－Ｆｌｋ、Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达及凋亡细胞数差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论整合素αｖβ３靶向抑制剂西仑吉肽可降低ＭＣＡＯ模型血脑屏障通透性，减轻脑水肿及抑制细胞凋亡，其作用机制可能与抑制ＶＥＧＦ介导的生物效应有关，梗死后１ｈ后给予西仑吉肽１００μｇ／ｋｇ及２００μｇ／ｋｇ两个浓度治疗２３ｈ的效应未见剂量依赖关系。
【关键词】 脑梗死； 整合素αｖβ３； 血管内皮细胞生长因子； 脑水肿
基金项目：深圳市科技创新计划资助项目（ＪＣＹＪ２０１４０４１５１６２５４３０３３）
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｉｎｔｅｇｒｉｎαｖβ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｉｎａｃｕｔｅｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓＬｕＬｉｎｑｉｎｇ，ＦａｎｇＴｉｎｇ，ＺｈｏｕＤａ，ＴｏｎｇＸｉａｏｘｉｎ，ＷｕＪｕｎ，ＹｉＬｉ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｈｅｎｚｈｅｎＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０３６，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹｉＬｉ，Ｅｍａｉｌ：ｙｉｌｉｔｊ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｉｎｔｅｇｒｉｎαｖβ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｏｎｔｈｅｂｌｏｏｄｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ）ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ｂｒａｉｎｅｄｅｍａ，ｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｃｕｔｅｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒａｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｒａｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ．Ｒａｔｓｗｉｔｈｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｒａｎｄｏｍｎｕｍｂｅｒｔａｂｌｅ，ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ：（１）ｔｈｅｒａｔｓｉｎＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｇｒｏｕｐＡ（ｎ＝３０）ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅａｔａｄｏｓｅｏｆ１００μｇ／ｋｇ；（２）ｔｈｅｒａｔｓｉｎＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｇｒｏｕｐＢ（ｎ＝２８）ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅａｔａｄｏｓｅｏｆ２００μｇ／ｋｇ；（３）ｔｈｅｒａｔｓｉｎｓｈａｍｇｒｏｕｐ（ｎ＝３１），ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｓｅｒｔｉｎｇｔｈｒｅａｄｉｎｔｏｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙ，ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ；（４）ｔｈｅｒａｔｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｎ＝２７）ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ．ＡｌｌｒａｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｏｒｓａｌｉｎｅ１ｈｏｕｒａｆｔｅｒｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ｇｉｖｅｎｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ２ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｉｎｆａｒｃｔｉｏｎａｎｄｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ２２ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｈｅｂｒａｉｎ－ｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｄｒｙ／ｗｅｔｗｅｉｇｈｔｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＢＢＢｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇＥｖａｎｓＢｌｕｅ．Ｔｈｅｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ２，３，５－ｔｒｉｐｈｅｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）ｓｔａｉｎｉｎｇ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＶＥＧＦ，Ｐ－Ｆｌｋ，Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ
ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）．ＲｅｓｕｌｔｓＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅａｔｔｈｅｄｏｓｅｏｆ１００μｇ／ｋｇａｎｄ２００μｇ／ｋｇｒｅｄｕｃｅｄｂｒａｉｎ－ｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ［（８０．８±１．１）％ｖｓ（８４．８±１．４）％，（８１．０±１．４）％ｖｓ（８４．８±１．４）％，Ｐ＜０．０５］，ｒｅｄｕｃｅｄｅｘｕｄａｔｉｏｎｏｆＥｖａｎｓｂｌｕｅ［（９．２±１．１）μｇ／ｇｖｓ（１２．２±０．８）μｇ／ｇ，（８．６±０．６）μｇ／ｇｖｓ（１２．２±０．８）ｇ／ｇ，Ｐ＜０．０５］，ｒｅｄｕｃｅｄｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ［（３１．９±４．９）ｍｍ３ｖｓ（４３．０±２．２）ｍｍ３，（２９．２±３．５）ｍｍ３ｖｓ（４３．０±２．２）ｍｍ３，Ｐ＜０．０５］，ｒｅｄｕｃｅｄｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ［（３６±４）ｖｓ（６９±６）、（３５±３）ｖｓ（６９±６），Ｐ＜０．０５］．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｈａｍｇｒｏｕｐ，ＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｇｒｏｕｐＡａｎｄＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｇｒｏｕｐＢｈａｄｌｏｗｅｒｂｒａｉｎ－ｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ，ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＢＢＢ，ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＶＥＧＦ，Ｐ－Ｆｌｋ，Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｐ＜０．０５）．ＷｈｅｎＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｇｒｏｕｐＡｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｇｒｏｕｐＢ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｂｒａｉｎ－ｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ，ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＢＢＢ，ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＶＥＧＦ，Ｐ－Ｆｌｋ，Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｐ＞０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｎｔｅｇｒｉｎαｖβ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｏｕｔｃｏｍｅｓｉｎｔｈｅＭＣＡＯｍｏｄｅｌｂｙｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｔｈｅｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ，ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇｂｒａｉｎｅｄｅｍａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｗｈｉｃｈｍａｙｏｃｃｕｒｉｎａＶＥＧＦ－ａｎｄＶＥＧＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ，ｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｅｆｆｉｃａｃｙｂｅｔｗｅｅｎＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ１００μｇ／ｋｇａｎｄ２００μｇ／ｋｇａｆｔｅｒ２３ｈｏｕｒｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｂｒａｉｎｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ； Ｉｎｔｅｇｒｉｎαｖβ３； Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ； ＢｒａｉｎｅｄｅｍａＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＧｒａｎｔｓｆｒｏｍＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＳｈｅｎｚｈｅｎ（ＪＣＹＪ２０１４０４１５１６２５４３０３３）
卒中已成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病，给患者家庭乃至全社会造成了沉重的经济负担。研究发现在急性脑缺血２ｈ内，血脑屏障的通透性增高，引起炎症细胞、细胞因子和氧自由基增多外渗，并促进血管源性水肿形成，从而加重缺血性损伤［１］。溶栓被认为是治疗急性缺血性脑卒中的最有效措施，而纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）是临床上最常用的溶栓药物，溶栓治疗只能使血栓溶解，达到血管再通的目的，使受阻的血管灌流区域的脑组织重新获得血氧供应，从而挽救缺血半暗带。但是，
ｔＰＡ无法改善由于血脑屏障的破坏所导致的继发性脑损伤，而且ｔＰＡ适用者有限，还会引起溶栓后出血及可能加重缺氧／缺血对高碳酸血症和低血压引起的生理性血管舒张的损害，甚至导致血管收缩等缺陷，限制了其在临床上的使用［２］。因此开发新的药物或者改善ｔＰＡ的应用迫在眉睫。研究证实，血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）在脑缺血的超早期参与血脑屏障的破坏［３］，而整合素αｖβ３不但在缺血性脑卒中表达上调，且能够激活ＶＥＧＦ受体及上调ＶＥＧＦ表达，而整合素αｖβ３抑制剂可靶向抑制ＶＥＧＦ受体活化［４］。本研究旨在针对整合素αｖβ３靶点探讨其抑制剂西仑吉肽在急性脑缺血超早期中的神经保护作用。
材料与方法
一、材料
１．动物：无特定病原体（ＳＰＦ）级ＳＤ雄性大鼠１２４只，体质量为２３０～３００ｇ，均由广东省实验动物中心提供，动物许可证号：ＳＣＸＫ（粤）２０１３－０００２。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
２．主要试剂及材料：２，３，５－三苯基氯化四氮唑（ＴＴＣ）、伊文思蓝（ＥＢ）均购自上海生物工程技术服务有限公司，ＶＥＧＦ一抗、Ｐ－Ｆｌｋ一抗、Ｃｌｅａｖｅｄ－
Ｃａｓｐａｓｅ３一抗均购自美国Ａｂｃａｍ公司，辣根酶标记抗兔ＩｇＧ二抗购自福州迈新公司，Ｔｕｎｅｌ试剂盒购自德国罗氏公司，西仑吉肽（Ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ，化学式：Ｃ２７Ｈ４０Ｎ８Ｏ７，ＩＣ５０∶４．１ｎｍｏｌ／Ｌ）购自美国Ｓｅｌｌｅｃｋ公司。
二、方法
１．大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型的建立：将动物用１０％水合氯醛０．３３ｍｌ／１００ｇ体重进行腹腔注射麻醉。将头端直径为０．３６ｍｍ的线栓浸泡在肝素中备用。按照Ｌｏｎｇａ改良线栓法［５］建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞（ＭＣＡＯ）再灌注模型，并用Ｌｏｎｇａ法进行神经功能评分，将评分为１～３分的大鼠纳入ＭＣＡＯ实验组。
２．实验分组：将大鼠按体质量从轻到重依次编号，从随机数字表上获得随机序列，根据完全随机设计法划分假手术组及造模组，对造模成功ＭＣＡＯ模型用随机单位组设计分组法再分成治疗组Ａ、治疗组Ｂ及对照组，从而对纳入实验的大鼠共分成４组：（１）治疗组Ａ，尾静脉注射西仑吉肽１００μｇ／ｋｇ（ｎ＝３０）；（２）治疗组Ｂ，尾静脉注射西仑吉肽２００μｇ／ｋｇ（ｎ＝２８）；（３）假手术组，不置入线栓，其余造模步骤相同，尾静脉注射生理盐水（ｎ＝３１）；（４）对照组，尾静脉注射生理盐水（ｎ＝２７）。根据确定好的分组方案在相应药物包装上写上实验对象编号，编制一张分配序列表，表分３列，第１列为纳入
实验动物编号，第２列为随机数字，第３列为药物名称，并将序列表一式两份分别由确定随机序列、分组及统计数据的设计者及及管理药物的人保存。右侧大脑中动脉栓塞后１ｈ进行治疗干预，２ｈ开始缺血再灌注，并于梗死后２４ｈ处死大鼠。
３．脑含水量测定：将大脑半球分为左右两侧称湿重，在１１０℃恒温烤箱中烤２４ｈ，然后测定干重，含水量百分比＝（１－干重／湿重）×１００％。
４．血脑屏障通透率计算：提前２ｈ从大鼠尾静脉注射２％ＥＢ（４ｍｌ／ｋｇ），在麻醉状态下用生理盐水从左心室进行心脏灌流，直至从右心房流出的液体为无色。断头取脑，将大脑半球分为左右两侧，称重，并置入５０％三氯乙酸溶液中，匀浆和离心（１００００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），取上清按１∶３的比例用乙醇稀释。用酶分光光度计（激发波长６２０ｎｍ，发射波长６８０ｎｍ）测定吸光度Ａ值。根据ＥＢ标准溶液绘出ＥＢ与Ａ值的线形标准曲线，计算脑组织中ＥＢ的含量，以每克湿重脑组织内所含ＥＢ的量（μｇ／ｇ）表示。
５．组织学梗死面积的测量：每只大鼠断头取全脑，－２０℃冰箱冰冻２０ｍｉｎ后取出。用手术刀片以视交叉为中心，沿着脑组织冠状位将脑组织以２ｍｍ的厚度切为脑片。避光盒中放入２％的ＴＴＣ液中，置３７℃恒温箱中孵育２０ｍｉｎ，正常组织染为红色，梗死组织呈白色。然后将脑片放入４％的多聚甲醛中固定观察。Ｉｍａｇｅ－ｐｒｏｐｌｕｓＶｅｒｓｉｏｎ６．０彩色图像分析系统计算梗死面积。
６．免疫印迹法测定Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３、ＶＥＧＦ及Ｐ－Ｆｌｋ：取缺血侧大脑半球梗死灶周围皮质新鲜脑组织块称重后放入１．５ｍｌ离心管内，加入１ｍｌ细胞裂解液，置冰浴中匀浆和离心（１００００ｒ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ）后取上清液，用ＢＣＡ法行总蛋白定量。取等量蛋白样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳，然后转印到ＰＶＤＦ膜上，用含５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ缓冲液封闭１ｈ，Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３或ＶＥＧＦ或Ｐ－Ｆｌｋ或β－
Ａｃｔｉｎ４℃孵育过夜，再用ＴＢＳＴ漂洗３次，加入辣根酶标记的二抗，室温作用２ｈ，用显色剂ＥＣＬ试剂盒显色，结果在Ｂｉｏ－Ｒａｄ的化学发光成像仪上显影，利用ＩｍａｇｅＪ１．４ｕ软件分析各组的灰度值，以β－ａｃｔｉｎ为内参计算各蛋白的变化。
７．脑组织石蜡切片免疫组织化学染色：以前囟为中心，冠状切取４μｍ厚石蜡切片，６８℃烤箱烤片过夜，分别做ＨＥ染色和免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用ＳＰ法，一抗为兔抗Ｃｌｅａｖｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３、ＶＥＧＦ、Ｐ－Ｆｌｋ抗体，二抗为过氧化物酶标记的抗兔ＩｇＧ。在４００倍光镜下随机观察每只动物梗死灶周围不重叠的１０个视野，显微图像分析系统采集图像。Ｉｍａｇｅ－ｐｒｏｐｌｕｓＶｅｒｓｉｏｎ６．０彩色图像分析系统计数每个视野平均光密度。
８．原位细胞凋亡检测：石蜡切片常规脱蜡至水合后根据罗氏公司ＴＵＮＥＬ试剂盒说明书操作，用１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００促通透，３％Ｈ２Ｏ２封闭内源性过氧化氢酶，３７℃恒温湿盒中与ＴｄＴ反应液孵育１ｈ，用ＰＢＳ漂洗后与荧光素抗体的辣根酶孵育３０ｍｉｎ，经ＰＢＳ漂洗后行ＤＡＢ显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在４００倍光镜下随机观察每只动物梗死灶周围不重叠的１０个视野，显微图像分析系统采集图像，并计算每个视野的阳性细胞数。
三、统计学处理
所有数据均利用ＳＰＳＳ２０．０统计软件进行统计和数据分析。服从正态分布的计量资料以-ｘ±ｓ表示；单因素组间比较采用Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ方差分析，方差齐时组间多重比较采用ＬＳＤ分析，方差不齐时组间多重比较釆用ＤｉｍｎｅｔＴ３分析；Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果
一、缺血侧大脑半球脑组织含水量
与对照组比较，治疗组Ａ、治疗组Ｂ、假手术组的脑组织含水量均降低（Ｐ＜０．０５）；但治疗组Ａ、治疗组Ｂ的脑组织含水量仍高于假手术组（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ的脑组织含水量与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（表１）。
表１梗死２４ｈ后各组梗死面积、脑组织含水量
及ＥＢ含量的比较（-ｘ±ｓ）
组别动物数
（只）
梗死体积
（ｍｍ３）
脑组织
含水量（％）
脑组织ＥＢ
含量（μｇ／ｇ）治疗组Ａ２０３１．９±４．９ａｂ８０．８±１．１ａｂ９．２０±１．１ａｂ治疗组Ｂ１９２９．２±３．５ａｂ８１．０±１．４ａｂ８．５８±０．６ａｂ假手术组２１０７８．２±０．５ｂ２．６６±０．５ｂ对照组１８４３．０±２．２ａ８４．８±１．４ａ１２．１９±０．８ａ
注：与假手术组比较，ａＰ＜０．０５；与对照组比较，ｂＰ＜０．０５
二、缺血侧大脑半球脑组织ＥＢ含量
与对照组比较，治疗组Ａ、治疗组Ｂ、假手术组的脑组织ＥＢ含量均降低（Ｐ＜０．０５）；但治疗组Ａ、治疗组Ｂ的脑组织ＥＢ含量仍高于与假手术组（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ的脑组织ＥＢ含量与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（表１）。
三、组织学梗死面积测定结果
与对照组比较，治疗组Ａ、治疗组Ｂ梗死面积均减少（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ的梗死面积与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（表１）。
四、ＶＥＧＦ检测结果
免疫印迹结果显示治疗组Ａ、治疗组Ｂ，假手术组的ＶＥＧＦ蛋白表达量低于对照组（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的ＶＥＧＦ蛋白表达量仍高于假手术组（Ｐ＜０．０５）；而治疗组Ａ的ＶＥＧＦ蛋白表达量与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（图１，表２）。免疫组化结果显示：假手术组脑组织内ＶＥＧＦ内ＶＥＧＦ表达量很少或不表达；而对照组脑组织内ＶＥＧＦ表达强阳性，而治疗组Ａ、治疗组Ｂ阳性表达弱于ＭＣＡＯ＋生理盐水组，但强于假手术组＋生理盐水组（图２，表
３）。
注：Ａ为治疗组Ａ；Ｂ为治疗组Ｂ；Ｃ为假手术组；Ｄ对照组图１ ＶＥＧＦ的免疫印迹结果 图２ 免疫组化结果箭头所指为阳性细胞（光镜，×４００）。２Ａ为治疗组Ａ；２Ｂ为治疗组Ｂ；２Ｃ为假手术组；２Ｄ对照组
表２ 免疫印迹法比较各组的Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３、
ＶＥＧＦ及Ｐ－Ｆｌｋ的表达（-ｘ±ｓ）
组别动物数
（只）ＶＥＧＦ
Ｐ－Ｆｌｋ
Ｃ－Ｃａｓｐａｓｅ－３
治疗组Ａ５０．１１４±０．０１０ａｂ０．６０１±０．０５５ａｂ０．０６３±０．００９ａｂ治疗组Ｂ４０．１１３±０．０２３ａｂ０．５５６±０．０４０ａｂ０．０５３±０．００６ａｂ假手术组５０．０８５±０．００７ｂ０．１４０±０．０１９ｂ０．０１９±０．０３ｂ对照组
４
０．３０２±０．０３０ａ１．８９０±０．０１６ａ０．２４７±０．０３５ａ
注：表内数值以平均吸光度表示。与假手术组比较，ａＰ＜０．０５；与对照组比较，ｂＰ＜０．０５
五、Ｐ－Ｆｌｋ检测结果
免疫印迹结果显示治疗组Ａ、治疗组Ｂ、假手术组的Ｐ－Ｆｌｋ蛋白表达量高于对照组（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的Ｐ－ｆｌｋ蛋白表达量均高于假手术组（Ｐ＜０．０５）；而治疗组Ａ的Ｐ－Ｆｌｋ蛋白表达量与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（图３，表２）。免疫组化结果显示：Ｐ－Ｆｌｋ阳性表达主要见于血管内皮细胞及血管壁，假手术组血管内皮细胞及血管壁未见明显阳性表达，其他各组可见阳性表达，治疗组Ａ、治疗组Ｂ、假手术组及对照组的ＶＥＧＦ平均光密度结果分别为对照组阳性表达强于治疗组Ａ、治疗组Ｂ，治疗组Ａ与治疗组Ｂ比较，阳性强度差异无统计学意义（图４，表
３）。
注：Ａ为治疗组Ａ；Ｂ为治疗组Ｂ；Ｃ为假手术组；Ｄ对照组图３ Ｐ－Ｆｌｋ的免疫印迹结果 图４ 免疫组化结果箭头所指
为阳性细胞（光镜，×４００）。４Ａ为治疗组Ａ；４Ｂ为治疗组Ｂ；４Ｃ为假手术组；４Ｄ对照组
表３ 免疫组化技术比较各组的ＶＥＧＦ及Ｐ－Ｆｌｋ的
表达（-ｘ±ｓ）
组别动物数
（只）ＶＥＧＦＰ－Ｆｌｋ治疗组Ａ
５０．０１０２±０．００２８ａｂ０．００１４±０．０００６ａｂ治疗组Ｂ５０．０１００±０．００２９ａｂ０．００１２±０．０００７ａｂ假手术组５０．００４３±０．００１１ｂ０．０００２±０．０００１ｂ对照组
５
０．０１７９±０．００４１ａ
０．００２３±０．０００７ａ
注：表内数值以平均吸光度表示。与假手术组比较，ａＰ＜０．０５；与对照组比较，ｂＰ＜０．０５
六、Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ３检测结果
免疫印迹结果显示治疗组Ａ、治疗组Ｂ、假手术
组的Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３表达低于对照组（Ｐ＜
０．０５）；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３表达高于假手术组（Ｐ＜０．０５）；而治疗组Ａ的Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３表达与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（图５，表
２）。
注：Ａ为治疗组Ａ；Ｂ为治疗组Ｂ；Ｃ为假手术组；Ｄ对照组
图５ ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ－３
的免疫印迹结果
图６ 脑组织ＴＵＮＥＬ结果。Ａ为治疗组 Ａ；Ｂ为治疗组Ｂ；Ｃ为假手术组；Ｄ对照组。箭头所指为阳性细胞（光镜，×４００）七、脑组织原位细胞凋亡（ＴＵＮＥＬ）测定结果
治疗组Ａ、治疗组Ｂ、假手术组的ＴＵＮＥＬ阳性
细胞数分别为（３６±４）个、（３５±３）个和（１１±３）个，
分别与对照组（６９±６）个比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ、治疗组Ｂ的ＴＵＮＥＬ阳性细胞数高于假手术组（Ｐ＜０．０５）；治疗组Ａ的ＴＵＮＥＬ阳性细胞数与治疗组Ｂ比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）（图６）。讨论
整合素αｖβ３是细胞表面黏附分子家族的重要成员之一，是一组由α和β两组亚基以非共价键形式结合而成的异二聚体跨膜糖蛋白受体［６－７］
。整合素αｖβ３受体与细胞外基质中天然配体中相应的肽序列精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（ＲＧＤ）相互作用，控制内皮细胞的排列及血脑屏障的形成［８］
，而包含ＲＧＤ序列的小分子环肽（ＩＣ５０＝６．４１ｎｍｏｌ／Ｌ）能强烈抑制整合素αｖβ３［９］。研究表明，在缺血性脑脑损伤中整合素αｖβ３选择性在缺血区表达上调［１０］
，提示整合素αｖβ３参与缺血性脑卒中的病理生理过程。在缺血超早期，血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）及其受体Ｆｌｋ与整合素αｖβ３选择性在缺血区表达上调，且Ｆｌｋ与整合素αｖβ３中β３亚基可相互促进其磷酸化［１１］
。血管内皮生长因子是一种具有亲肝素活性的糖
基化分泌性多肽因子，因其对内皮生长的有丝分裂
原作用而被命名为血管内皮生长因子［１２］
。ＶＥＧＦ具有强烈的血管通透性，其效应比组织胺强５０００
倍，且不被抗组织胺药物所抑制［１３］
。缺氧是ＶＥＧＦ／
ＶＥＧＦＲ表达的最主要的调节因子［１４－１５］
。本实验中对照组的血脑屏障通透性、组织含水量及ＶＥＧＦ、Ｐ－Ｆｌｋ的含量均高于其他组，提示在急性脑缺血中ＶＥＧＦ及其受体表达上调，且ＶＥＧＦ在缺血超早期参与了血脑屏障的破坏，加重了脑水肿，与前人的研
究结果一致［１６］
。研究表明，ＶＥＧＦ可促进血小板黏附［１７］
、能够诱导缺血大脑的血流动力学盗血现象：即减少梗死区域的脑血流，增加大脑中动脉周围区
域的血液灌注［１８］。另外，脑缺血时，因ＶＥＧＦ增加
了血脑屏障（ＢＢＢ）的渗漏，可导致炎症细胞、血管收
缩因子、凝血因子及纤维蛋白原的外渗，诱发脑出
血，加重脑水肿及神经细胞的损伤［１，１５－１６］。而研究
证实了ＶＥＧＦ受体抑制剂在缺血超早期可改善
ＶＥＧＦ介导的缺血性脑损伤［１９］。西仑吉肽模拟多
肽ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆｖ）的结构，是可以抑制αｖβ３整联蛋
白的小分子化合物［２０］。本实验研究发现整合素
αｖβ３抑制剂西仑吉肽在短暂性ＭＣＡＯ模型中可降低血脑屏障通透性，减少脑水肿，且一系列的研究发
现脑缺血早期ＶＥＧＦ及其受体磷酸化的下降可以起到保护脑组织的作用，提示整合素αｖβ３抑制剂对
急性缺血性脑卒中有神经保护作用，与抑制ＶＥＧＦ介导的生物学效应有关。神经元死亡有两种方式，坏死和凋亡。神经元
坏死主要发生于缺血严重的核心区，而凋亡则多发
于缺血的周边区和脑中某些缺血易感部位，如海马
ＣＡ１区及皮质和纹状体尾壳核的散在神经元［２１］
。
研究表明，细胞状态从缺血核心区到周边阴影区呈坏死向凋亡转变。神经元缺血性坏死难于逆转，然而凋亡可以通过对其上游信号的调节进行干预，因此脑缺血治疗策略正是以这些坏死边缘和凋亡细胞为目标进行的。研究表明，Ｃａｓｐａｓｅ家族的某些成员
参与了凋亡的信号传递，具有重要的调控和效应作
用，其中Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３异常升高则是再灌注损伤启动缺血脑区受损神经元凋亡的
关键环节［２２］
。本研究中发现在缺血半暗带区中，治疗组Ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３的含量及凋亡细胞数较对照组降低，而组织学梗死面积测
定结果也显示梗死面积较对照组降低，提示整合素αｖβ３可抑制神经
元凋亡，这可能与抑制ＶＥＧＦ介导的缺血损伤有关外，还与改善缺血区的微循环、减轻局部炎症等因素有关。研究证实，在急性脑缺血中，纤维蛋白是整合素αｖβ３的配体之一［６］。Ｏｋａｄａ等［１０］在ＭＣＡＯ模型中发现整合素αｖβ３和纤维蛋白在缺血区微血管上表达上调。而纤维蛋白在微血管的沉积会阻碍血液灌注，且促进血小板活化，而阻断纤维蛋白原可抑制血小板在血管壁的黏附［２３］。因此整合素αｖβ３抑制剂可通过干扰纤维蛋白原与整合素之间的相互作用，改善微循环，从而抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用。
本研究设计了两个药物浓度１００μｇ／ｋｇ和２００μｇ／ｋｇ，初步探索西仑吉肽治疗急性脑缺血的剂量－效应关系，但研究结果表明两个不同浓度的各项指标检测并未见统计学差异，提示在梗死后２４ｈ内给予西仑吉肽１００μｇ／ｋｇ及２００μｇ／ｋｇ两个浓度治疗的效应未见剂量依赖关系。
综上所述，整合素αｖβ３抑制剂可降低血脑屏障的通透性，从而减少血管源性脑水肿及出血性转化的发生，其作用机制可能与西仑吉肽抑制ＶＥＧＦ介导的生物学效应有关。
然而由于脑缺血模型具有的一定的局限性，如大鼠是年轻健康的ＳＤ雄鼠，缺乏人脑缺血前就存在的各种复杂的危险因素和病理生理学过程，且ＳＤ大鼠的神经解剖和代谢与人类不完全相同，且缺乏大脑沟回［２４］，因此临床应用仍需要更多的研究进一步证实。
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（收稿日期：２０１５－０９－１４）
（本文编辑：朱瑶）