2003年博士生研究生入学考试

2003年博士生研究生入学考试

试题名称：分子病毒学

一名词解释（每个4分，共20分）

1 Virino ：朊病毒是只有蛋白质而没有核酸的病毒，是一种比病毒小、仅含有疏水的具有侵染性的蛋白质分子

2 apoptosis：细胞凋亡。指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡

3 PFU ：蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时，铺上低熔点胶，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位互换。用PFU计量病毒的方法叫作PFU法。

产生一个蚀斑的病毒量，称为一个蚀斑形成单位

4 基因工程抗体（ genetic engineering antibody）指利用基因工

程技术制备的抗体分子。是按人类设计所重新组装的新型

抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要的生物

学活性，去除和减少无关结构，从而克服单抗在临床应用

方面的缺陷。主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人

源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。

5 DNA的物理图谱： DNA限制性内切酶酶切图谱（Restriction EndonucleaseAnalysis）又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上

二将英文名词翻译成中文（每个1.5，共15分）

1 protein transduction:

蛋白转导(protein transduction)是指蛋白具有自主跨过细胞膜转运蛋白的功能，即蛋白自身及其与外源蛋白组成的融合蛋白均能在无任何辅助条件介导下(如脂质体、磷酸钙、电转化、病毒载体等)快速、高效、无障碍(甚至可突破血脑屏障)直接透过细胞膜进入细胞内，并可在周围细胞间传递，而且被转导入细胞内的外源蛋白保留其原有的生物学活性与功能。这种独特的蛋白转导功能对于基因治疗和高效新型疫苗及药物的开发具有重要意义。

2 “suicidal”DNA vaccine “自杀性” DNA 疫苗基于常规 DNA 疫苗和“自主复制型” RNA 疫苗( self-replicating RNAvaccine)基础上发展起来的一种新型疫苗 , 载体是以甲病毒复制子( replicon)为基础的复制型DNA 载体。不仅具有常规 DNA 疫苗易制备、运输、

保存等方面的优点 ,而且还有“自主复制型” RNA 疫苗的安全性与有效性.它以甲病毒复制子为基础能诱导转染细胞自主凋亡

3 DDRT—PCR mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA.

差异显示反转录聚合酶链式反应：

DDRT-PCR 技术是在逆转录反应、PCR反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳这3项技术的基础上发展起来的。它利用了大多数真核生物成熟mRNA的3'端有多聚腺嘌呤序列，即pol（yA）尾巴，用3'端含有poly（T）的引物锚定于来自两组或多组样品的mRNA poly（A）尾上，反转录成cDNA。用不同组合的锚定引物,可以将mRNA反转录形成若干个亚群的cDNA。以这些cDNA为模板，利用锚定引物及5'端随机引物组成的引物对进行扩增，理论上可以获得所有mRNA的特异扩增片段。将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳可以有效筛选、分离到差异表达的cDNA片段,对获得表达差异的基因片段进行回收、克隆、鉴定及分析4 CpG CpG岛(CpG island)：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛,在哺乳动物基因组中的1~2kb的DNA 片段，它富含非甲基化的CpG双倍体。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度超过200bp 。

表示DNA序列中这两个核苷酸是毗邻的，C位于G的5端在真核染色体的DNA序列的CG对中大约70%C是甲基化的，这种核苷酸排列结构特称为CPG 二核苷酸对

5 RNAi 转录后基因沉默，也称为RNA干扰，是指双链RNA分子阻断或者降低同源基因的表达的现象。

6 BAC/ Bacterial Artificial Chromosome：是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA , parB , 和parC ）。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

YAC人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。

7 single chain Fv 单链抗体是利用基因工程方法使抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过一段约5-25个aa的连接肽,首尾拼接而成的重组蛋白。

8 Lentivirus 慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组分和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。慢病毒感染: 又称长程感染，

是指潜伏期长，发病是慢性进行性且最后转归于死亡的一种病毒感染。其与慢性感染的不同点，在于疾病过程缓慢，但不断发展而且无例外地死亡。

慢病毒感染的病原体有两类，一类是常规病毒，如人和猴的免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒、绵羊的维斯纳－梅依迪病毒、山羊关节炎－脑炎病毒以及人的麻疹病毒等。

9 PRRSV 猪繁殖与呼吸综合征病毒。

10 cytokine 细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。

三问答题（共65分）

1什么是单克隆抗体？简述其制备原理与基本操作步骤。（12分杨汉春动物免疫55页）

单克隆抗体：是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。

单克隆抗体制备的基本原理与过程

原理：

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具

有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。

过程

1）免疫脾细胞的制备：制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c 小鼠。一般免疫2-3次间隔2-4周

2）骨髓瘤细胞的制备：一般用SP2/0细胞。

3）饲养细胞的制备：常用的饲养细胞有小鼠胸腺细胞、小鼠腹腔巨噬细胞。

4）选择培养基: 一般用HAT选择培养基

5）细胞融合：常用的融合剂为50%聚乙二醇（PEG4000）。关键：

1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

6）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

7）杂交瘤细胞克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群

体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。

(8）细胞的冻存与复苏：原始克隆和克隆化后的杂交瘤细胞可加入二甲基亚砜，分装于小安培瓶内保存于液氮中。

9）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。

应用：1血清学方面：制成诊断试剂盒提高了特异性，稳定性重复性敏感性。用于传染病的诊及病原的分型。

2 免疫学基础研究方面单抗的均质性用于对抗体结构和氨基酸序列的分析，促进了对抗体结构的进一步探讨。

3肿瘤免疫治疗方面：单抗与药物或毒素连接制成生物导弹。

4 抗原纯化方面

5 制备抗独特型抗体疫苗。

在病毒研究中的应用：

3.1 单克隆抗体对病毒抗原结构与抗原表位的研究

抗原表位是免疫原引起免疫应答以及与抗体产生特异性反应的基本结构单位是由一段氨基酸残基形成的单个氨基酸的置换就会引起抗原位点的改变从而导致抗原性质发生变化鉴于单克隆抗体高度的特异性和敏感性可以将单克隆抗体技术与氨基酸定位基因定位基因重组技术结合起来把抗原定位到基因水平可利用它更全面更细微地分析抗原结构特别是分析细胞表面的小分子抗原对分析体内免疫反应机制判断机体免疫水平和免疫调节平衡状态方面具有重要的实际意义

3.2 单克隆抗体在畜禽病毒性传染病诊断中的应用

单克隆抗体的诞生是免疫学上的一个里程碑因其具有高度的同质性和特异性等常规免疫血清无可比拟的优点所以能用做免疫荧光酶联反应和放射免疫测定的第二抗体以及作为检测病毒抗原和抗体的

最佳生物探针除此之外单克隆抗体重复性好操作简便易行可批量生产且易于标准化使其在病毒血清学鉴定及诊断方面得到了广泛3.3 单克隆抗体在抗病毒感染方面的应用

单克隆抗体的抗病毒作用主要体现在其对病毒有中和作用能够识别并结合病毒外衣壳蛋白

从而阻止病毒的感染Russell[20]报道具有溶血抑制功能的单克隆抗体与中和能力密切相关可部分阻止病毒穿入细胞膜的过程徐建生等[21]用制备的两株高中和性效价的抗 IBDV 单克隆抗体对 13 655 只雏鹅进行了防治试验结果存活率达 90.5 ~98.2%

无论是传统的放射免疫诊断、酶联免疫诊断 ,还是正在兴起的单克隆抗体快速诊断试纸、蛋白质芯片等高新技术 ,都是建立于大量应用单克隆抗体的基础之上的 ,单克隆抗体已成为临床检测中不可缺少的一大类生物活性物质。治疗与预防上的巨大潜力也日益凸显:以单克隆抗体作为导向载体 ,可荷载同位素、药物或毒素蛋白对癌症、心血管等疾病进行导向治疗(即生物导弹) ;以特异的单克隆抗体攻击、消灭疾病靶细胞 ,可起到直接治疗作用;用单克隆抗体可制成避孕药及传染病的预防药物;应用抗 T细胞、抗 IL - 2R (白介素 2 受体) 的单克隆抗体 ,能防治器官移植排斥反应等。特别是由单克隆抗

体技术和基因工程技术结合所获得的全人源化抗体,大大降低了人体免疫反应的危险性 ,使单克隆抗体产业前景更加光明。

意义：

用于以下各种生命科学实验并具有医用价值

（1）沉淀反应：Precipitation reaction

（2）凝集实验：haemaglutination

（3）放射免疫学方法检测免疫复合物

（4）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。

（5）ELISA 等免疫学检测

（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的

亲和力。

(7) 免疫印记（western blotting)

（8）免疫沉淀：

（9）亲和层析：分离蛋白质

（10）磁珠分离细胞

（11）临床疾病的诊断和治疗

2 猪圆环病毒分子生物学研究进展（14分）（猪病会议70页也有）

PCV的分子生物学特征,认为PCV21和PCV22有一定亲缘关系,但也发

生了较大的变异。PCV基因组是以滚环模式进行复制,PCV21基因组的复制依赖于Rep 蛋白。叙述了PCV的分子免疫学特征,认为PCV22感染猪后可损伤猪体免疫系统、引起免疫抑制。从分子流行病学角度得出PCV22不同分离株的基因组通常比较稳定,但是不同地区的分离株在基因组序列上还是有所改变。对猪圆环病毒的研究提出了新的问题

一、概述

猪圆环病毒(P orcine Circovius ,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属成员,是迄今发现的最小的动物病毒。PCV是一种无囊膜的单股环状DNA 病毒,呈 20 面体对称,直径 17～20 nm, 对氯仿、碘酒、酒精、 pH3的酸性环境,56和70 ℃的高温有一定的抵抗力;对苯酚季

胺盐类化合物、氢氧化钠和氧化剂等较敏感。

根据 PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列,将 PCV分成 PCV1 和PCV 2 种基因型。PCV1无致病性, PCV2具有致病性,目前列入 PCV2 的有美洲、欧洲等地分离出的一些毒株。PCV2与近年来在世界各国普遍发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征PMWS)密切相关。该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征,已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。

1 分子病源学特征

1.1基因序列特征

1.2现已明确PCV 的基因组序列。PCV1基因组全长为 1 759

bp ,PCV2 基因组全长为 1 767 或 1 768bp。PCV序列中都含有类似为5′ -T AGT ATT AC -3′的茎- 环结构。这种茎- 环结构可能是病毒滚环复制的起点。

PCV2 和 PCV1 在抗原性上有较大差异。两者的核苷酸同源性低于80 %。

PCV1包含7个编码大于5 kDa产物的阅读框架(ORFs) ,其中,2个主要的阅读框ORF1和ORF2分别编码复制起始蛋白Rep、 Rep′以及结构蛋白Cap。

PCV2基因组含有11个编码产物在2～36 kDa 的ORFs ,即ORF1～ORF11 ,各阅读框大小相差悬殊。

Rep 蛋白与 PCV 基因组的滚环复制相关。由PCV 最大的开放阅读框ORF1 编码蛋白氨基酸序列同源性达86 % ,这也是 2 种血清型 PCV 产生抗原交叉性的主要原因所在。

PCV1Rep 蛋白仅有一个糖基化位点 , PCV2 Rep 蛋白则含有 3 个糖基化位点

Rep 蛋白具有与典型滚环复制(RCR)相关的 3 个保守基序Ⅰ( F TLNN) 、Ⅰ( HLQ G) 、Ⅱ( YCSK) 以及结合dN TPs的 P环(P2loop)结构(序列为 G 2GKS) ,这些结构对于维持 Rep 蛋白的功能至关重要 ,突变或缺失均会影响病毒的复制,这也进一步证明 PCVDNA 进行

滚环式。

Cap 蛋白为病毒的主要结构蛋白 ,构成病毒的核衣壳 ,由开放阅读框 ORF2 编码 ,病毒感染细胞后在宿主各种酶的参与下产生。PCV1 与 PCV2的 Cap 蛋白均由 233 aa 组成 ,氨基酸同源性仅为大约64 %。多肽扫描显示 , PCV21 与 PCV22 的 Cap蛋白上存在共同的抗原决定簇 ,但血清学实验却显两种病毒的 Cap 蛋白都只有单一的糖基化位点 ,分别位于 PCV22 Cap 的 143 aa～145 aa (N YS) 及PCV21的102 aa～104 aa (N YS)

Cap 蛋白N 端富含碱性氨基酸,与蛋白的核内定位有关。Nawagitgul 等用杆状病毒表达ORF2基因,在电镜下能观察到ORF2蛋白可以自我装配成病毒衣壳样颗粒

1. 2 复制与转录PCV基因组以滚环模式进行复制。在复制过程中,病毒首先产生双链(ds)的复制型中间体(r f) 。该复制型中间体DNA的2条链都能进行基因转录和蛋白质的表达。将2个 PCV2全基因组串联入 PSK载体,转染 PK 15细胞,可产生感染性的病毒粒子,表明 PCV基因组首尾相连对病毒DNA的滚环复制是必不可少的。

2 分子免疫学特征

2. 1 PCV2的靶细胞PCV2 常存在于淋巴组织、肺、肝和肾等组织器管中,使淋巴组织(淋巴结、胸腺、扁桃体和脾) 、肺、肝和肾出现以细胞浸润为主要特征的炎性病理变化和淋巴细胞萎缩。Otali 等发现,PCV2 抗原可在淋巴结的滤泡和旁

2. 2B淋巴细胞、 T淋巴细胞损耗Shibahara 等用末端脱氧核酸

转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷刻痕末端标记法和免疫组化法对患有PMWS猪的淋巴组织进行研究,发现PCV可导致B淋巴细胞减少和凋亡,而且一些包涵体是由吞噬性溶酶体从凋亡细胞中得到的

。Segales等研究发现,与 PCV2 阴性猪相比较,PMWS病猪血液中单核细胞增多,并出现了低密度未成熟的粒细胞;同时,B淋巴细胞与 T淋巴细胞(主要是CD4 +)的数量减少,由此推测 PMWS发病猪细胞免疫功能大大降低,缺乏有效的免疫应答能力。

PCV2感染猪后可损伤猪体免疫系统,引起免疫抑制。

2. 3 P MWS猪体内细胞因子的改变

贫血、淋巴细胞减少并伴有广泛的淋巴细胞缺失和细胞因子 mRNA 表达的改变,特别是胸腺 I L-10 mRNA水平的增加和胸腺明显萎缩L28 产量明显下降, IFN-γ减少,说明PCV2能损害 TH1免疫应答

2. 4 PMWS猪肉芽肿的发生机理PMWS最突出的病理变化之一就是淋巴结的广泛肿大。K rak owka 等认为,PMWS猪的肉芽肿是由免疫介导的。K im等用单核细胞趋化蛋白 21(MCP 21)和白细胞介素28( I L28)的互补DNA作为探针进行原位杂交试验( ISH) ,结果表明MCP 21 可能在引起 PMWS猪淋巴结肉芽肿中起了重要作用[21]

3 分子流行病学

Fenaux等对来自北美不同地区的6株 PCV2分离株进行研究,发现PCV2 分离株因地源不同而产生分支[22]。其研究表明,尽管 PCV2 不同分离株的基因组通常比较稳定,但是不同地区的 PCV2分离株在基因组序列上还是有所改变。研究表明,尽管 PCV2 不同分离株的基因

组通常比较稳定,但是不同地区的 PCV2 分离株在基因组序列上还是有所改变有研

究表明,衣壳蛋白的氨基酸序列存在3个主要的氨基酸差异区,其中的2个是主要免疫活性区。对上述70株 PCV2 进行进化树分析后发现,欧洲、中国大陆、台湾以及加拿大的毒株

组成了一个大的分支,而这个大的分支又可以进一步分为几个亚支

5 PCV 与其他病原体的相互作用

PCV 往往与其它病原体同时存在于一个猪群或猪体内 ,临床上表现为继发感染或混和感染。

PCV 常与猪细小病毒( PPV)或猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染猪。由 PCV 单独感染的患猪主要表现为渐进性消瘦 ,生长发育受阻 , 体重减轻 ,皮肤苍白或有黄疸 ,有呼吸道症状 ,有时还有腹泻,但临床上 PCV 引起的病理变化比较严重 , 说明 PCV 与其它病原体可能存在相互协同作用。Allan G M[ 18 ]报道 PCV22 或 PCV22 与 PPV 混合感染未吃初乳的仔猪 ,可使猪表现 PMWS症状及病理变化 ,混合感染较 PCV 单独感染严重 , 可引起试验猪死亡 ,而单独感染 PPV 的试验猪不表现任何临床症状和病理变化。

2DNA疫苗的特点、研究方法及研究进展。（13分）（猪病会议237页）

核酸疫苗具有许多突出的优点:①核酸疫苗表达的抗原接近天然构象 ,抗原性强; ②激发机体全面的免疫应答 ,其保守抗原的保护性免疫应答对不同亚型的病原体有交叉抵御作用; ③制备简单 ,成本低廉 ,易进行规模化生产 ,且运输保存方便; ④使用安全 ,没有感染病原的危险 ,核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段 ,而不是整个病原体的基因 ,且利用质粒作载体 ,不涉及感染性因子; ⑤免疫具有持续性,一次接种可获得长期免疫力 ,避免了灭活疫苗、重组亚单位疫苗等需多次加强免疫的繁琐; ⑥能联合免疫 ,即可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将不同抗原基因的多种质粒联合应用 ,制备多价 DNA 疫苗; ⑦核酸疫苗既有预防作用 ,也有治疗作用;⑧接种途径多样化,既能采用注射方式接种(包括皮内、皮下、肌注、基因枪注射技术) ,亦能口服、喷雾接种。核酸疫苗与传统疫苗相比有许多全新的潜在优势 ,从而被誉为第三次疫苗革命。但是DNA 疫苗也有其缺陷性 ,主要有以下几点[1 ]: ①核酸疫苗能长期在体内表达 ,是否会引起机体的过量免疫或产生免疫耐受现象 ,最终导致机体的免疫抑制; ②外源基因进入机体后会不会与宿主的基因发生整合,导致宿主细胞肿瘤基因发生活化且进入宿主细胞的DNA最终去向不确定; ③持续的抗原表达所激起的强烈CTL 应答可能对机体其它细胞产生毒性杀伤作用; ④DNA接种后会不会引起机体的免疫功能发生紊乱 ,产生抗DNA 抗体;⑤目前进行的实验都是以动物为模型 ,应用于人体后是否出现不良反应。以上这些都是今后需

要重点研究解决的问题。

3动物抗病毒育种的研究方法与进展。（13分）

1 对抗病力的直接选择

最简单的方法就是在通常的生产条件下对种畜进行观察和选择 , 当有病原攻击动物时 , 在相同感染条件下有的个体不发病 , 有的个体发病。不发病的个体表明具有抗性遗传基因 , 将这些个体选出进行大量繁殖 , 久而久之 , 可使抗病个体增多 , 抗病基因频率增加。此种直接选择法在家禽抗病育种上较成功的例子是对鸡卡氏住白细胞原虫病的研究 ,

2 对抗病力的间接选择

2.1 分子遗传标记辅助选择

标记辅助选择 (MAS) 就是利用 DNA水平的选择来代替以表型为基础的选择 , 提高选种的效率和选种的准确性 , 特别是对抗病性状和中等遗传力性状的选择。现已发现许多疾病都

有标记基因或标记性状 , 典型的例子是鸡 MHC的 B21血型因子 , 可通过间接选择 B21纯合个体而培育抗马立克病的抗病群。姜勋平等 ( 2005) 证实对这种基因型进行标记辅助选择和标记辅助交配 , 有可能提高群体中 A基因频率 , 不仅可以实现抗病育种还可以提高猪的肉质和胴体性质。Yonash等 (1999) 用 78个微卫星标记研究了273只 F2代白来航蛋鸡对马立克氏病的抗性 , 发现 14个抗性 QT L, 其中 7个为显著影响 , 并精确定位。

2.2 直接进行抗病主基因选择

前 , 抗性基因的研究还不多 , 但是识别特定的抗病基因对抗病育种具有重大的意义 , 不仅可以直接进行主基因选择抗病育种 , 而且可进一步进行转基因动物的培育。研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和 F18受体基因。Hanset等(1995) 通过检测与 RYRⅠ紧密连锁的葡萄糖酸异构酶 (GP I )位点 , 将大白猪氟烷阴性基因渗入到皮特兰中 , 并经 3次回交 , 已经获得氟烷阴性皮特兰品系。

3 进行转基因工程抗病育种, 实施转基因方案基因工程技术是实现动物抗病育种非常重要的手段。利用基因转移技术可以降低动物疾病易感性。首先获取抗病基因并克隆 , 再将克隆的抗病基因导入动物胚系细胞 ( germ line) 在染色体中正确整合后获得能遗传的抗病个体 , 然后通过常规育种技术扩大群体 , 最终育成抗病品系。3. 3. 1 干扰素基因途径

3. 3. 2 干扰素受体基因途径

3. 3. 4 反义核酸途径

3. 3. 5 核酶: 途径

3. 3. 6 病毒中和性单克隆抗体基因途径

3. 3. 7 MHC等位基因途径

2 开展抗病育种的现实困难和问题

①抗病性的遗传机制非常复杂且受环境影响较大。②病原微生物的遗传特性及与寄主动物的相互关系也十分复杂。③抗病性或易感性指标难以测定 ,且缺乏进行间接选择的可靠遗传标记。④病原微生物

变异迅速 ,易形成能克服动物抗性的变异品系。⑤抗性与生产力性状之间及对不同疾病的抗性之间常存在负相关。⑥世代间隔较长 ,必须经长时间选择才可能有效。

尽管开展抗病育种工作受到许多现实困难和问题的制约 ,但其前景十分诱人 ,同时基因工程学等相关学科和技术的迅猛发展为抗病育种的开展提供了许多新的思路和手段 ,使开展抗病育种的途径日益丰富扎扎实实地开展动物基因组的基础研究 , 特别是疾病抗性基因研究 , 充分利用现代生物学技术 , 采用分子标记辅助选择和转基因工程抗病育种将会是实现抗病育种的希望所在。抗病育种必将成为今后动物育种的一个热点

5 转基因植物可饲疫苗的研究进展及其应用前景（13分）（动物基因工程疫苗原理与方法119页）

转基因植物疫苗(transgenie plant vaccine)或植物疫苗(plant-based vaccine)是借助植物遗传转化载体将抗原基因导入植物，使其在植物中表达，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。

与目前的细菌、酵母及哺乳动物细胞等传统疫苗生产系统相比，用转基因植物生产基因工程疫苗具有其独特的优势：①植物细胞的全能性；②完整的真核细胞表达系统，使表达产物具有较好的免疫原性及生物活性；③口服植物疫苗能诱导粘膜免疫反应；④植物细胞的细胞壁起到生物胶囊的作用；⑤生产简便、成本低廉，不需要冷藏和低温运输；⑥安全性好，无外源性病原污染等。目前，转基因植物疫苗的

研究主要有两个方向，一种是利用植物生产大量的蛋白质抗原，经分离和提纯再制备成疫苗；另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。

目前在植物生产基因工程疫苗方法上的研究主要有3种，一是以植物病毒为载体的瞬时表达，此途径不属于转基因植物的范畴；二是农杆菌介导的核转化，将携带重组质粒的农杆菌感染植物细胞后，导人的外源基因通过同源重组整合到细胞染色体上，含整合外源基因染色体的植物细胞在一定条件下长成新的植株，此植株在生长过程中表达外源基因并将这种性状传给子代；三是用基因枪法进行叶绿体转化，为了实现外源DNA的定点整合，构建叶绿体表达载体时，一般在外源基因表达盒的两侧连接同源重组片段或定位片段(targeting frag． ment)，当载体被导人叶绿体后可将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。

2不同植物中表达疫苗抗原及免疫原性评价

近年来，已有众多研究表明转基因植物表达的疫苗抗原能诱导人或动物体内产生特异性中和抗体及激发粘膜免疫应答。由于动物疫苗的试验能比人用疫苗更快地付诸于临床应用，更多的学者致力于研发预防动物传染病的植物疫苗。因为不同的受体植物对抗原蛋白翻译后修饰的差异以及植物本身不同蛋白的影响，研究报道的转基因植物疫苗免疫原性及对动物的免疫保护水平差异较大。