Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具

一、Primer-BLAST介绍

Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-Blast可以直接从Blast主页（https://www.360docs.net/doc/1313230018.html,/）找到，或是直接用下面的链接进入：https://www.360docs.net/doc/1313230018.html,/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。

二、Primer-BLAST的输入

Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

（1）模板（Template）

在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。

（2）引物（Primers ）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check 区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。

（3）特异性（Specificity ）

在specificity check

的。这里提供了

4种数据库：chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI 标准来设计引物时，Primer-BLAST selected reference assemblies 包括以下的物种： zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice 。Nr 数据库覆盖NCBI 所有的物种。

三、实例分析

用人尿嘧啶DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG , GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点（NM_003362），UNG2的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列ClustalW 一下就可以了）。这里用UNG2的序列设计引物，选择RefSeq mRNA database ，物种是Human ，其它默认。结果如下图A-B 所示，设计的引物只能扩增出UNG2。看上面的图，把“”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C 所示，新的引物也可以扩增出UNG1（注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）。

接合拼接变异体

Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences. Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to allow splice variants.

四、一些Tips

1，在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession 号（尽量不要Fasta

另外，确保你的序列是最新版本的（在填Accession Number

序列）

2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域）

Accession 号（Primer-BLAST有参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”，如上面的第一幅图所示）。因为用Gi号或Accession 号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。

3，尽量使用没有冗除的数据库（如refseq_rna 或 genome database），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。

4，请指定一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。