常用色谱和光谱分析方法和技术
常用色谱和光谱分析方法和技术
色谱分析、光谱分析以及两谱联用技术，构成了药物分析学科领域中最主要和最基本的研究手段和方法，应用日趋广泛，发展十分迅速，新颖方法层出不穷。
新近常用的色谱分析方法：
一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC)又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC)，是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊（或称胶束，微胞等）浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical Micelle Concentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个（一般为25～160个）表面活性剂单体分子组成，其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内，胶囊溶液的某些物理性质（如表面张力、电导等等）以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊；后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同，并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析，是一种安全、无毒、经济的优越技术。
（一）原理：胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中，分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用；同时定量地指出分离组分的容量因子k'的倒数值与胶囊浓度成正比，一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。
（二）方法特点：与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系，而常规流动相是一种均相体系。特点：
1、高度的选择性：因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用，只要通过流动相中胶囊浓度的改变，就可使分离选择性获得改善和提高。此外，通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。
2、便于梯度洗脱：由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时，溶液中仅胶囊的浓度发生改变，而表面活性剂单体分子的浓度不变，不影响流动相与固定相的平衡过程，因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间，并减少了流动相的消耗，适用于常规。
3、提高检测灵敏度：胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度，从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。
4、因分离组分不易分出，故缺点是柱效低且不适于制备分离。
（三）常用表面活性剂：常用的阳离子表面活性剂主要有：溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyl trimethyl ammonium bromide or chloride,CTMAD或CTMAC)；阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)；非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。
二、手性分离色谱(Chiral Separation Chromatography,CSC)
是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异，有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。
（一）原理和方法：对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外，其理化性质是完
全相同的，因而难以分离。传统方法（分步结晶法、酶消化法等）有很大局限性，特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后，TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物，且需要较复杂的样品处理步骤，制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。
HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
间接方法主要基于外消旋体混合物经柱前衍生化形成一对非对映异构体(Diastereoisomers)。此法又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型对映体的物理性质完全相同，只能在手性固定相上才能获得拆分；如果利用对映体分子中的反应基团与某一光学纯试剂反应形成了非对映光学异构体混合物，其物理性质就有较大的差异，因而可在普通固定相（非手性固定相）上实现分离。本法需高光学纯度的手性衍生化试剂(Chiral Derivatization Reagent,CDR)，衍生化反应往往比较繁琐费时；各对映体衍生化反应的速率有时也不相同。由于可采用价格便宜、柱效较高的非手性柱和通过适当的衍生化反应可提高检测的灵敏度，以及衍生化过程中可伴随样品的纯化等优点，柱前手性衍生化的方法仍然是当前手性药物拆分、尤其是生物样品中药物对映体分离和测定的常用方法。
直接方法主要采用手性流动相添加剂(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可称为手性流动相(CMP)拆分法或手性洗脱法。它不必事先将样品制备成衍生物，而只须将手性剂加入流动相中。手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法所形成的衍生物那样牢固，但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构体性质却基本相同。常用的CMPA有：环糊精(Cyclodextrins)类（主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物）；手性离子对配合剂(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等；以及配位体交换型手性流动相添加剂(Chiral Ligand-exchange Complexes,CLEC)，其中手性配位体多为光活性氨基酸或其衍生物，再与二价金属离子形成螯合的配位化合物，以适当的浓度分布于流动相中，遇有药物消旋体时即可形成相应的非对映体配位化合物对，然后在正相柱或反相柱上完成拆分。近年来CSP法发展迅猛，应用日益广泛。它是不经转变成非对映体而直接拆分的方法，优点是：适用于不含活泼反应基团的化合物；除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂；样品处理步骤简单。但迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。根据分子结构选择合适的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有：手性电荷迁移配位体固定相，如 Pirkle型HPLC-CSP；蛋白亲和配体固定相，如 Enantiopac(LKB)；内部配位化合固定相，如环糊精(Cydobond)和纤维素酯(Chiracel)等；以及配基交换固定相，如
L-脯氨酸-Cu2+共价键合于聚苯乙烯等基质上。
CSP拆分对映体的理论概念：在HPLC的CSP柱上拆分对映体是利用药物对映体和特制的、在硅胶上键合的对映体固定相（CSP）之间所形成的非对映体复合物。由于非对映体复合物稳定性差异，可使两个对映体的保留时间不一致，与CSP形成稳定性较差的非对映体的药物对映体可先洗脱，因之实现了拆分。CSP设计是基于Dalgliesh在1952年提出的“三点手性识别模式”(Three-point chiral recognition model)，认为要实现手性识别，在手性化合物分子与CSP之间至少同时要有三个相互作用部位，其中之一必受空间影响，或是相互吸引或是相互排斥。生成的非对映体的相对强度，决定了两个对映体的分离度和洗脱次序。
（二）三类手性分离方法的比较：CDR法的优点是应用条件相对简易，只需采用普通HPLC的固定相和流动相即可而且通过衍生化有利于增加检测（紫外或荧光）灵敏度；缺点是样品中相关化合物须预先分离、衍生化手性试剂的光学纯度的高要求以及异体对的衍生化反应速率不一。
CMPA法的优点是不必作柱前手性衍生化；对固定相也无特殊要求；样品的非对映异构化络合具有可逆性而且利于制备。主要缺点是可拆分的化合物范围有限；某些添加剂不够稳定而且往往会干扰检测。
CSP法的优点较多，能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定，制备分离方便，定量分析的可靠性较高，采用此法研究考察的化合物已达数千种之多。缺点是样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂），对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那样广泛。
三、离子色谱(Ion Chromatography,IC)
是由经典的离子交换色谱发展开创而成的新的液相色谱分析技术，具有快速、灵敏、选择性好、且可同时测定多组分的优点；还能测定无机的或亲水性的有机阴离子。IC已广泛用于其他多个领域，但在医药研究中的应用尚处起始阶段。它不仅可用于药品的常规质量同时分析，也可有效地用于生产过程的质量控制和体内药物分析，具有美好的应用前景。
（二）类型特点与原理：阳离子交换柱用于分离样品阳离子；阴离子交换柱用作分离样品阴离子。洗脱液为含有阳离子和阴离子的一种稀溶液，经泵输送入色谱柱后，其阳离子或阴离子最终将色谱柱中所有可交换的离子置换出来，同时由检测器转换为恒定的信号——基线。然后，进样少量样品，样品离子即被树脂柱所接受，并与等同数量的洗脱液离子交换。如果样品中所有离子的浓度大于洗脱液的离子浓度，那么在柱顶端的总离子浓度就将增加，这就产生了一个脉动，当它沿着柱移动并通过电导检测器时即得到一个正峰；反之，则获得负峰。进样后，洗脱液离子继续不断地经泵输入色谱柱，对树脂的可交换部位与样品离子进行竞争，并且使样品离子沿着柱子移动。由于样品离子对交换树脂有不同的亲和能力，因而不同的样品离子沿柱以不同的速度移动，最后完成了分离。
现代离子色谱的过程有所不同，主要有以下两种：
1、抑制型离子色谱法(Suppressed IC)：由于离子交换分离的洗脱液几乎都是强电解质，其电导一般要较待测离子高二个数量级，簇会完全覆盖了待测离子的信号。为提高检测灵敏度，采用在分离柱后串联抑制柱的办法，可使洗脱液转变成低电导组分，以降低来自洗脱液的背景电导。另外可将样品离子转变成相应的酸或碱，以增加其电导。抑制装置有柱型和离子交换膜管型两种。抑制柱内填充与分离柱填料相反电荷的离子交换树脂。当分析阴离子时，要用苯乙烯系列的强酸型（H+）树脂装柱；而分析阳离子时，则用苯乙烯系列的强碱型（OH-）树脂装柱。抑制柱须定期再生。离子交换膜管型抑制系统可解决色谱上出现的水和碳酸离子的负峰。这是一种表面经磺化处理的聚苯乙烯多孔纤维管，管内流过流动相，管外流过再生抑制液，借助于离子交换作用来消除背景离子。
分析阴离子时，Na+穿出纤维管壁进入抑制液(H2SO4)中，与硫酸反应生成硫酸钠而被除去；同时，H+穿入管壁，与流动相的Na2CO3反应生成H2CO3。若流动相为NaOH时，则生成水。但是，CO32-和SO42-不能穿过管壁，而阳离子却可穿过。在实际应用中，环境温度超过40℃时，H2SO4有可能将管膜破坏。为此有人改用十二烷基苯磺酸(Dodecyl Benzene Sulfonic Acid,DBS)作再生抑制液来取代硫酸液。DBS则较为安全，而且这种抑制液能使HCO3-减少而使负峰变得更小，并且通常都出现于同一位置，使色谱的重现性提高，保留时间不变；但会出现F-峰的峰高变低和峰宽增加的问题。有人在膜管内装填苯乙烯和二乙烯苯的共聚物小球，因而提高了交换效率和色谱峰的锐度，这种改良后的装置称为组合型多孔纤维管抑制器，可使负峰现象大大改善，其效果最好。
对于阳离子来说，分离柱装有阳离子交换填料，抑制单元则为羟基阴离子交换剂，洗脱液中典型的是H+或苯二铵[Ph(NH3)22+]，通过抑制单元后分别转变为H2O或Ph(NH2)。抑制型离子色谱柱因价格昂贵，使用也较复杂，限制了该装置和操作的进一步发展。
2、单柱离子色谱法(Single Column IC,SCIC)：是一种不用抑制柱，直接用电导等检测器测定阴离子和阳离子的液相色谱法。特点是：采用足够低交换容量的分离柱，以及很稀浓度的洗脱液。进行阴离子分析时，树脂的交换容量为0.005～0.10Meq/g，典型的洗脱液是1.0310-4～4.0310-4mol/L的苯甲酸、羟基苯甲酸或邻苯二甲酸的钠盐或钾盐，这些洗脱液都足够稀，从
而使背景电导率相当低；大部分样品阴离子的当量电导比洗脱液阴离子要高，因此，样品浓度即使低至ppm级也能测得。采用羧酸页不是它的盐作为洗脱液时，对大部分离子的检测限可以扩大10倍。进行阳离子分析时，采用低容量的阳离子交换柱，它能与电导检测器或者其它类型的检测器相连，一价阳离子的分离系数用稀硝酸溶液作为洗脱液和电导检测器，而分离二价阳离子时则用乙二胺盐溶液。二价过度金属阳离子可以用弱的络合试剂，如乙二胺酒石酸盐进行分离。在强络合离子(Fe3+和Al3+)的样品溶液中加入络合试剂（如EDTA或磺基水扬酸盐）能获得更好的先择性。由于各种碱金属离子的当量电导均比洗脱液中的H+的当量电导小，H+的极限当量电导为350μS/当量，而Li+、Na+、K+分别为39、50、74。同样，二价阳离子和过渡金属离子也较乙二胺盐阳离子的当量电导小，因此样品峰相对于洗脱液的背景电导要小而呈负峰。由于两者之间当量电导的差异是很大的，因此检测灵敏度很好，特别是用酸作为洗脱液时更是如此。
（三）离子色谱中最常用的检测器：IC中使用的检测器有：电导检测器、分光光度检测器、荧光检测器、折光率检测器、电化学检测器以及原子吸收或发射光谱检测器。
1、电导检测器：是IC中使用最广泛的检测器。其作用原理是用两个相对电极测量水溶液中离子型溶质的电导，由电导的变化测定洗脱液中被分离组分的浓度。此检测器的死体积小，若采用抑制电导法，IC体系通常可获得极低的背景电导，适于使用二极式电导检测器，其敏感度可达
10-9g/l，线性动态范围达104；用SCIC体系时，洗脱液的背景电导常高达50μs/cm以上，极化效应严重，必须用五极式电导检测器或精心设计的二电极式电导检测器，其敏感度达10-9g/l，线性动态范围为103。由于电导率大小与离子运动速度有关，温度升高将减少液体的粘度，从而加速了离子的运动，这样就会使电导率增加。通常，温度每升高一度，电导率将增加22.5%，因此需采用绝热恒重措施，以提高仪器对环境温度变化的适应性。
2、紫外-可见分光光度检测器：应用越来越受重视，特点：(1)选择性好；(2)通用性好；(3)敏感度好，市售检测器的噪声水平可低至210-6吸光度单位，其敏感度达10-10g/ml，因之很易进行ppb级浓度的离子分析；(4)线性动态范围达105；(5)与电导检测器相比，受温度影响较小等。
四、高分辨气相色谱(High Resolution Gas Chromatography,HRGC)简述
HRGC在分离分析复杂有机化合物、天然产物、医药、环保等方面具有显著效果和特殊意义。与传统GC柱的主要差别在于HRGC柱是不装填充剂的空心柱，固定液相是涂渍或固定在柱管内壁上的。这种空心柱的渗透性很高，固定液量很少，这就使HRGC具有三大特点：分离效率高，一根20mm的色谱柱，总理论塔板数可达5万以上；分析时间短，与填充柱相比，可缩短若干倍；薄而均匀的固定液液膜，使柱流失的绝对量减少，因而信噪比得以提高。
（一）HRGC的色谱柱：最初使用的材料是不锈钢，操作方便，比较结实耐用，但对不少极性样品会有吸附并发生分解，成本也高，因而限制了它的应用范围。用玻璃作柱材料的螺旋形开管柱，可弥补不锈钢的一些不足，但易于破碎。熔融石英开管柱(Fused Silica Open Tubular Column,FSOT柱)对若干极性大、分子量也较大的药物也可不经衍生化而直接就能进行分离。开管柱(Open tubular column，Golay柱，空心柱)因柱管内径在0.2～0.8mm间，也称毛细管柱(Capillary column)，但此名称不正确，因开管柱的主要特点不只是内径小，而是由于柱开口（即中空），因此通气性佳，无涡流扩散，可使用长柱，因而分离效率高，可称之为“高分辨”。此外，还有填充毛细管柱(Packed capillary column)和微填充柱(Micropacked column)它们的柱管内径也很小，严格讲，HRGC是指使用开管柱（包括涂壁开管柱和涂担体开管柱）的气相色谱法。
常用的开管柱类型有：
涂壁开管柱(Wall-coated open tubular column,WCOT柱)：内径为0.05mm～0.53mm，内壁涂布固定相（SE30、OV-1、OV-225、Carbowax 20M等)，相膜厚0.1μm～8.0μm。缺点是柱容量低，不适于在室温下分析分子量很低的成分和永久气体。涂担体开管柱(Support-coated open
tubular column,SCOT)：内装10-3～10-4mm的固体担体，厚度一般为0.1mm，样品处理量大。多孔层开管柱(Porous-layer open tubular column，PLOT柱)：似SCOT，但常分两步制备，先是多孔层的沉积，然后再涂布固定相，多孔层常由重的晶性沉积或玻璃粉熔结而成。与SCOT相同，PLOT柱容量大而柱效较低。
固定化相开管柱(Immoblilized phase open tubular column，IPOT柱)：也称为不能提取相开管柱(Nonextractable phase open tubular column，NPOT柱)：是在WCOT柱涂布后，将固定相进一步用横向交联或键合的办法，使之固化，形成更大、更稳定的大分子薄膜。此种柱可分为两大类：交联柱(crosslinking column)是在固定液相分子间进行共价连结；键合相柱(bonding phase column)是固定液相与支持物的表面连结。这两种开管柱比WCOT柱的优越之处在于：产生了稳定的涂层；得到了不可提取的涂层；使用温度往往要比未固化相柱的柱温上限约高30℃也可用作超临界流体色谱法或液相色谱法的固定相。
（二）开管柱的进样方式：由于柱系统特性不同（如内径、膜厚、样品容量、载气种类和线速度等）以及样品性质的差异（如组分的浓度范围、温度范围和稳定性等），需采用不同的进样方式和方法：
1、分流进样(Split injection)：受柱容量限制，在分析很纯或浓度很高的样品时，对WCOT柱就须分流进样，即样品进入汽化室后被汽化样品按一定比例分成两部分，大部分放空，仅小部分进入色谱柱。入口分流器为最常用，优点是使用方便；缺点是不适于痕量分析和宽沸程样品。
2、无分流进样(Splitless injection)：有两种形式：一种是直接无分流，全部样品在最短时间内完全汽化均匀混合后直接进入色谱柱。进样量能达1μl。迄今这种进样器为宽孔柱（内径0.33mm，膜厚0.5μm)和SCOT柱所广泛使用。
另一种是Grob型分流（溶剂效应），注入的样品在汽化室中汽化，但在开管柱入口端再度冷却，以液体捕集，并保持冷却；然后快速加热色谱柱进行“再进样”。此法的优点是特别适用于痕量分析，对宽沸程样品也能获得满意结果。缺点是操作较难，必须利用溶剂效应或冷阱；溶剂的选择和起始柱温的限制；以及洗脱时间很严格、不能定量回收等等。
3、柱头进样(On-column injection)：这是一种针对分流和无分流进样的缺点而设计的正在发展的进样方法。特点是：（1）必须使用外径为0.17～0.23mm的细针，而开管柱内径又必须是大约0.32mm的；（2）不能通过隔垫进样；（3）要缓慢进样，以免倒流；（4）对热敏感，稀的和宽沸程的样品比较理想；（5）能给出定量结果。主要缺点是：样品中非挥发性物质在柱中积累，导致柱性变惰和柱效损失，为此，样品应经过仔细的预处理才可直接注入柱中，否则将缩短柱的寿命。
（三）开管柱的选择和性能评价：若供试品在填充柱上，经反复试验，对其组分的分辨率仍感不满意时；或要想使分析更加快速；或者，需要较好的色谱柱以克服样品峰的严重拖尾时；均可考虑选用开管柱进行分析。若缺少参考资料，可首先考虑样品组分的沸点和极性。一般，相差2℃或2℃以上的组分，采用非极性开管柱分离是合适的；若沸点相差在2℃以内，则需在极性较大的开管柱上进行分离为好。开管柱一般为柱长25m、内径0.25mm、膜厚0.25～0.4μm；但对低挥发性样品，则宜使用10m左右柱长、膜厚不大于0.2μm的开管柱为好。开管柱性能评价指标有：理论塔板数，容量因子，柱效率，涂渍情况，混合物的峰形以及峰的对称因子的大小等等。还可采用Grob标准试验混合物来进行综合性的进样考察。
五、多维气相色谱(Multidimensional GC,MDGC)：
是用两根或更多的柱连接起来，以达到单柱不可能达到的分离分析结果。最简单的MDGC
是2DGC，先将样品注入预柱（填充柱或开管柱），进行第一次分离。用中心切割(heartcut)选择所需的流分，使之进入分析柱通常用FOST柱进行第二次发离。两根柱可以在同一柱箱内或不同柱箱；切割用阀进行。所用预柱有：
1、高分辨柱：用于分离复杂混合物成为窄
切割带，然后再由分析柱进一步分离；
2、高容量柱：用于分离溶剂、主成分、衍
生化试剂，以保护分析柱和检测器。
3、样品预柱：用于除去样品中不需要的物
质，只切割待分析组分进入分析柱。
4、浓集柱：用以从稀浓度的样品中进行样品富集。
MDGC并不是一种新技术，近年来得到发展的原因是：
1、采用了FSOT柱，不仅高效、惰性，而且操作方便；
2、采用大口径、厚涂层的FSOT柱，样品载量大，可取代填充柱作预柱，而且惰性、分辨率较高，易于使用，而填充柱一般对痕量组分来说，活性太高。
3、有关硬件（如微量阀、低死体积柱切换装置）已经商品化。
六、常用的药物色谱分离的优化方法：
（一）色谱响应函数(Chromatographic Response Function,CRF)：尽管CRF还不能帖切地全面地反映出实际效能，但作为一个色谱系统效能的尺度和寻求理想指标的起点，为色谱分离质量提供初步的数值性的描述，值得探讨。CRF最初是作为两相邻色谱峰的分离参数的函数：
其中，ρi是k对色谱峰中(k为峰总数减1)相邻峰间分离的尺度。后来扩展到实际分离参数(ρι)和理论分离参数(ρ0)之间的比较以及实际分析时间(T L)和可接受的分析时间(T M)之间的比较：
式中，α为加权因子。有了CRF值，即可通过调节一组实验因子（如柱温、流速等）达到最好的响应。
（二）色谱优化函数(Chromatographic Optimization Function,COF)：主要是CRF方程进行了
改进，首先用峰的分辨率R(Resolution)代替峰分离参数(ρ),
因为在色谱测量中两者相比更习惯于采用分辨率，而且当峰
的分离参数ρ<0.75时，往往不太正常，这对非常难以分离的峰的优化是不利的。COF的定义如下：
式中，R i是第i对峰的分辨率，R id是第i对峰的理想分辨率，A i和B都是加权因子。当所有A i
和R id都相同时，COF非常相似于CRF。但对于色谱峰的重叠或出峰次序因条件改变而倒置时，上述两种优化指标就不能适用。有待继续索。
（三）单纯形法(Simplex Methods)：这是色谱分析最优化中常用的一种方法。就是在一定的空间中最简单的图形。如在二维空间，单纯形为三角形，任何其它图形都可分解为若干个三角形；在三维空间中，单纯形为四面体；n维空间的单纯形就是以n+1个顶点组成的图形。在二维空间中，不在一条直线上的三个点可构成一个单纯形。（见图）在它的三个顶点G、H、L，按其中所处条件(X1,X2)，求得相应的响应值（如CRF值）R G、R H、R L，然后进行比较。若其中R H最差，R G 次之，R L最好，则可设想函数变化趋势。一般来说，“好点”在“差点”的对称位置的可能性较大。将G与L的中点F与H相连，沿HF方向延伸，使HF=FR而获得R点。R点称为H关于F的反射点，这种做法称为反射，R即为新的考察点。按R所处条件依法取得其响应值，若比G点的响应好，则丢弃H点而与G、L构成新的单纯形。若反射点R在新的单纯形中也是响应最差的点，则会反射至H点（称为“振荡”）。为此规定，在新的单纯形中寻求次差点的反射点构成新的单纯形。以后有人提出了改进单纯形法，除了“反射点”，还运用了“扩张”和“收缩”等规则。若R R比R L好，说明情况有了改善，可延伸得更远一点（“扩张”至S点）。若R点响应比G好，比L差，则以GLR为新的单纯形。若比G、L都差时，则“收缩”至U点。若R点比H点差时，
则H“收缩”至T点。若HF方向上的所有点的响应值都比H点差，则将原单纯形LGH中的最佳点L作为中心，按一定比例收缩或扩张，产生新的单纯形。单纯形过程一直进行到满足给定的“收敛要求”为止。单纯形过程即可结束。
几种颇有应用潜力的光谱分析方法：
一、差示分光光度法(Difference Spectrophotometry)：简称ΔA法。取两份相等的供试液，一份加酸，另一份加碱或缓冲液或其他能够发生某种化学反应的试剂，有时也可不加任何溶液，然后将两者分别稀释至同样浓度，一份置样品池中，另一份置参比池中，于适当波长处，测其吸收度的差值（ΔA值），在供试溶液的一定浓度范围内，ΔA值与浓度C之间呈线性关系。优点：在不同pH介质中，或经适当化学反应后，供试物发生了特征性的光谱变化，而赋形剂或其他共存物质不受pH条件或化学试剂的影响，未引起光谱变化，从而消除了它们的干扰。同时，参比池与样品池中含有相同浓度的供试物与干扰物，这就为吸收度的测量提供了一个近似理想的参比溶液。ΔA法主要有：
1、利用最大吸收波长进行药物的测定：紫外光谱对pH十分敏感时，可测得ΔA（碱-酸）或ΔA （pH7-酸）。
2、利用最大吸收与最小吸收之差（即振幅）进行药物测定：某些药物共存物在某pH范围内的光谱与pH无关（即吸收度不变）。而主药有最大和最小吸收，两者差值与主药浓度成正比。
3、利用干扰杂质等吸收波长进行测定：于干扰物的等吸收波长处进行测量，如测得供试物的相应吸收度，即可消除共存物的干扰。
4、利用最小吸收波长(λmin)处的增色效应进行测定：某些药物在碱性和酸性溶液中于处吸收重叠，但吸收值不同。但在碱性或酸性溶液中于λmax或λmin处可产生增色效应，利用此效应可测定药物浓度。
二、正交函数分光光度法(Orthogonal Function Spectrophotometry)：在分光光度法中，任何一条吸收曲线，都可由一组正交多项式来描述它：
f(x)=ρ0φ0(λ)+ρ1φ1(λ)+……+ρkφk(λ)
其中系数ρi=∑φi(λ)f(λ)／s i, 式中：si为归一化因数，φi(λ)可从“正交多项式表”查得，f(λ)为所选波长区间内等间隔的各点波长处的吸收度，N：为测式点数（须大于i+1）。N值越大，所得ρi值越精确。
ρi是吸收度A的函数，ρi∝C，则ρi=A j C A，A j是常数，类似于经典分光光度法中的比吸收系数，数值上等于光路长为1cm、C A=1%(w/v)时的ρi，常写作：ρi(1%,1cm)，取样品与对照品在同样条件下测N点吸收度，计算ρi，根据式：ρi测=ρi(1%,1cm)3C A可求得C A。
在两组分混合液测定时，ρi混=ρiA(1%,1cm)3C A+ρiB(1%,1cm)3C B，可适当选择其中的ρi和波长区间，就可使ρiB3C B小到可以忽略不计，从而可以如同测定单一组分一样，由混合物的ρi和对照品的ρi(1%,1cm)，求出混合物中组分A的含量；反之，同理也可测定组分B的含量。
三、近红外光谱分析法(Near intra-red spectrum,NIR)：
波长范围800～2500nm(12500～4000cm-1)，优点：
1、没有中红外光谱(Mid intra-red spectrum,MIR,4000～400cm-1)吸收带显示出的边缘干扰(fringe interference)，故在一较大的吸收动态范围内这些吸收带强度与被测物浓度之间有线性关系；
2、和MIR不同，水分吸收不会覆盖C-H、N-H和O-H的吸收带，因此，NIRS(NIR Spectroscopy)可用于水溶液样品、含水固体和泥浆状样品的分析；
3、样品可不经溶剂稀释、制备溴化钾片等处理而可直接测定，免除样品制备时可能带入的误差，
因而其定量效果优于GC、HPLC和FTIR等法。
药典中原料药多用MIR作指纹分析，或以标准图谱核对，或与参比标准对照，所得光谱质量多取决于样品制备的准确性和重现性，而且操作繁琐、影响因素很多。NIRS法则方便得多，仅需将样品装入样品池内而不必作预处理。一般，液体样品可直接装入光路长1～30mm的石英池中。固体样品可直接放入具有石英窗的反射样品杯中；盖上弹簧压缩盖即可。在1分钟内即可完成装样；取出样品、清洗杯子的时间也不需1分钟。通常将样品杯置入NIR光谱仪内，每秒进行5
次扫描；一般扫描50次求得平均值制得最后的光谱，继之将光谱数据进行加工以作数据的定量或定性的解释。通常一次NIR分析仅需2～3分钟。
（一）用于鉴别：目前常用的是借助于计算机辅助的光谱匹配法(Spectral matching)，就是将供试药物的光谱和存贮于机内的参比光谱进行对比并计算出“匹配系数(Match index,M.I.)”。若M.I.越接近1.000，则这两个光谱越是匹配；而当M.I.接近于0.000时，则为极不匹配。有时会出现负值。
式(1)中，X和Y是二个光谱的矢量表示(Vectorial representation)；式(2)中Xi是光谱A在波长i处的振幅（吸收度）；Yi是光谱B在波长i处的振幅（吸收度）。矢量X和Y是由光谱A 和B的N个波长处所得吸收度读数总和而得到（在某波长范围内每隔Mnm测一次吸收度，故有N 个波长点）。在N维空间中这二个矢量具有不同的大小和方向。这二个矢量间可形成一个夹角（θ），夹角的cosθ即可确定M.I.。若θ=0°，则cosθ=1.000；若θ为90°，则cosθ=0.000，二矢量正交，完全不重叠。若θ大于90°，则cosθ为负值，这种情况有时会出现。
（二）用于纯度检查：较纯的样品的M.I.等于或接近于1，而纯度稍差的样品的M.I.距1尚有一定的差距。
（三）用于含量测定：NIR漫反射(NIR diffuse reflectance)吸收度（-lgR；R代表漫反射）与样品中待测组分浓度之间存在着一定的内在关系，样品i中某一组分的浓度y i可用这个样品在m 个不同波长处的吸收度X ik(k=1、2、…、m)的线性组合来表示：
式中，F0为与仪器有关的校正常数；F k(包括F1、F2、…、F m)为在波长1、2、…、m处待测组分或基质的校正系数；数值为正时表示这一波长为组分的特征波长；为负时表示系基质的干扰波长，应将此值扣除。上式也可改写成具体公式：
组分%=F0+F1log(1/Rλ1)+F2log(1/Rλ2)+…+F m log(1/Rλm)
式中的校正常数(F0)和校正系数(F k)通常是选用n个浓度已知的样品作为校正集(Calibration set)，分别测得校正集样品在m个不同波长处的吸收度，再用多元线性回归(Multiple Linear Regression,MLR)或偏最小二乘(Partial Least Square,PLS)算法，借助于电子计算机进行数据处理以求出校正常数和系数，同时选择出校准的最佳波长，并获得各相应组分的校准公式，之后用于实际样品的测定，即得。校准公式一旦建立，实际测定时方法简易、快速、精确。
四、核磁共振光谱定量分析法(NMR)：
（一）特点：
1、对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。
2、利用内标法或相对比较法，分析混合物中某一化合物时可无需该化合物的纯品作对照。
3、信号峰的宽度很窄，远小于各信号之间的化学位移的差值，因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。
4、方法简易快速、专属性高，可选择性地测定复方药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体；一般无需分离，且不破坏被测样品。
（二）定量分析方法：NMR图谱中，可获得化学位移、偶合常数、共振峰面积或峰高。化学位移和偶合常数是结构测定的重要参数；而共振峰面积或峰高是定量分析的依据。共振峰面积或峰高直接与被测组分的含量成正比。定量分析时，一般只对该化合物中某一指定基团上质子引起的峰面积或峰高与参比标准中某一指定基团上质子引起的峰面积进行比较，即可求出其绝对含量。当分析混合物时，也可采用其各个组分的各自指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较，然后求得相对含量。因此，在测量峰面积或峰高以前，必须了解化合物的各组成基团上质子所产生共振峰的相应位置，也就是它们的化学位移值（δ值），并选择一个合适的峰作为分析测量峰。常用的NMR定量分析方法有：
1、内标法（绝对测量法）：在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后，进行NMR光谱测定。将样品指定基团上的质子引起的共振峰（即吸收峰）面积与由内标物质指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量(Wu)可由下式求得：W u/W s=A u2EW u/ A s2EW s—— W u=W s2A u2EW u/ A s2EW s式中：Au为样品测得和峰面积（不少于5次测定的平均值）；A s为内标物测得的峰面积（不少于5次测定的平均值）；EW u为样品在该化学位移处的质子当量；EW s为内标在该化学位移处的质子当量。若样品重为W，则百分含量=W u/W 3100%
对内标物要求：(1)最好能产生单一的共振峰，在扫描的磁场区域中，参比共振峰与样品峰的位置至少有30Hz的间隔；(2)应溶于分析溶剂中；(3)应有尽可能小的质子当量(EW s)；(4)不应与样品中任何组分相互作用。常用的内标物有：苯或苯甲酸苄酯（在5.3ppm处，由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致），适用于非芳香化合物；马来酸，适用于非链烯型化合物。
2、相对测量法：当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以样品指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A1/n1)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A2/n2)进行比较，然后按下式计算样品与该杂质的相对百分含量：
样品的相对百分含量={(A1/n1/[(A1/n1)+(A2/n2)]}3100%
式中，n1和n2是指定基团的质子数。本法适用于含有一、二种杂质的样品的分析。
3、外标法：欲测样品中某一组分的含量，可采用该组分的标准品做成一系列不同浓度的标准液，使样品液浓度在其范围内，然后进行NMR测定，由所得图谱中某一指定基团上质子引起的峰面积对浓度作图，即得标准品的校正曲线。在平行条件下，测定样品溶液组分指定基团上质子的峰面积，即可由校正曲线求得样品的浓度。
4、峰高或峰位测量法：结构相似的混合物样品（如互为异构体），由于其NMR峰分离效果不好，用峰面积定量法不能精确测定，误差较大，此时可考虑采用峰高测量法或峰位测量法。
(1)峰高测量法：是基于峰高与样品中有关核的浓度成正比，各组分之间的峰高比只取决于样品的百分组成，而与样品的多少和仪器的性能无关。测定某一对异构体时，先用异构体I和II的纯品配成溶液，再用质子快速交换简化光谱。由简化的NMR光谱可知两异构体的吸收峰互不干扰；可测出各自峰高。两者摩尔数M I+M II=1，若两者的峰高为H I和H II，则：
H I=M I3C I=（1-M II）C I；H II=M II3C II；两式中，C I和C II是异构体I和II的峰高系数，为已知，H I和H II可测得。据此可求得M I和M II。
(2)峰位测量法：当样品中两种组分之间具有可进行质子快速交换的基团时，经质子快速交换后，原来两种组分基团的信号合并，在NMR光谱上得到单一信号，此峰的化学位移与两组分的摩尔分数有线性关系，因此，测出混合物的化学位移，可直接求出二组分的混合比例。如有机胺及其盐的N-CHa上的质子可以进行质子快速交换，可用NMR法定量测定有机胺酸性水溶液的氯仿提取液中游离胺及其盐的比例。混合物中N-CHa的化学位移(δm)可按下式计算：
δm=δb+(δa-δb)Xa 式中δb和δa为纯的游离胺及其盐的化学位移，Xa为盐的摩尔分数。以δm 对Xa或Xb（游离胺的摩尔分数）作图，应呈直线关系。因此可先用纯品配成已知组成比例的混合物，测得其δm并作出校正曲线后，再测得未知混合物的δm，即可由校正曲线求得Xa或Xb。
五、质谱及其联用技术：
（一）质谱(MS)法常用的离子化方式：基本原理是将供试物分子经一定离子化方式，如电子轰击或其它离子化方式，一般是把分子中的电子打掉一个成为M+，继之裂解成一系列碎片离子，再通过磁场使不同质荷比(m/z)的正离子分离并记录其相对强度，绘出MS图。即可进行元素分析、分子量测定、分子式确定和分子结构的解析和推断等等。
1、电子轰击离子化(Electron Impact Ionization,IC)：是最常用的一种，特点是可使分子引起相当大的碎裂，所得分子离子峰往往并不很强甚至不能识别。分子较大碎裂对供试药物的鉴定和结构解析是十分有利的；但对混合组分的分析和药物纯度检查是不利的。
2、化学离子化(Chemical Ionization,CI)：是极为有用的一种，由于其谱形简单，能提供较强的准分子离子峰[Quasi-molecular,(M±H)+离子]和很少的碎片峰，因之，用于混合组分的分析和纯度检查是十分有利的。
3、场致离子化(Field Ionization,FI)：非常适用于易变分子的离子化，如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺类药物均宜采用；此法也能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。
4、场解吸离子化(Field Desorption Ionization,FD)：扩大了MS的使用范围，此法可用于极性大、难气化以及对热不稳定的化合物，因而在生物活性组分、药物及其代谢产物或分解产物的研究分析工作中是一种非常重要而且十分有效的分析工具。
5、负离子化学离子化(Negative Ion CI,NICI)：灵敏度较高，可以提高到fg(10-15)水平，只要供试药物本身或通过衍生化后具有高电子亲合能力者，就可选用此法，而且可给出特征的负离子峰。
6、快原子轰击(Fast Atomic Bombardment,FAB)：是将样品溶解于低挥发性的液体基质中，用高速的中性粒子，如氩、氙等原子来轰击而解吸，因之称为快原子轰击离子化。特点：可直接进行分析，毋需做成衍生物；可适用于较大分子的MS分析，而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有机化合物的测定。如将FABMS与HPLC联用将成为适应力更强的分析手段之一。
7、激光解吸(Laser Desorption Inoization,LD)：是新近发展起来的一种有效离子化技术，能量高、指向性强，因此具有其它能源难以达到的离子化成效，可获得很强的准分子离子峰。
在MS分析中，究竟选用哪一种离子化方式，主要取决于供试物的稳定性和挥发度。
（二）MS与分离步骤的联用：MS已具有较高的鉴识和解析有机化合物的能力；但是如将其与某些适当的分离步骤联用，则会更有效地解决分析鉴定的难题。主要联用方式有：
1、薄层色谱-质谱联用(TLC-MS)：是一种最简单的联用技术，目前多以“脱机”(off-line)形式进行，即将TLC分离出来的组分洗脱或连同少量吸附剂一并直接向MS仪中进样。此法可用于混合药物的组分鉴定、纯度检查和药物稳定性试验以及其分解产物的鉴定。检测水平一般低于μg级。常采用TLC/EI-MS方式进行。
2、气相色谱-质谱联用(GC-MS)：是当前最为活跃的联用技术，其检测限可达10-9～10-12g水平。目前多用高分辨气相色谱-质谱(HRGC-MS)联用；其质量分析器部分，除了通常的磁铁式单聚焦质谱仪外，还有双聚焦质谱仪。也有采用四极质谱仪的，而且可进行快速记录，受到广泛重视。一般，供试物经GC分离为单一组分，按其不同保留时间，与载气同时流出色谱柱，再经接口(Interface)，进入MS仪，然后可通过EI或其它方法产生一定的MS图谱，由计算机自动检索核对，即可迅速鉴识样品。通常在规定条件下所得的MS碎片图及其相应的强度，犹如人的指纹图一样，易于辨识，方法专属、灵敏，一般可检知1μg/1g的样品，甚至检知水平更微。常用方法有：
(1)总离子流色谱法(Total Ionization Chromatography,TIC)：是利用MS仪来记录色谱流出物的总离子流；这时，MS仪仅作为GC的检测器。因此，总离子流色谱图一般是与GC色谱图一致的。
(2)反复扫描法(Repetitive Scanning Method,RSM)：在整个色谱分离过程中，MS仪可按一定间隔时间进行反复扫描，如每2～3秒扫描一次。在复杂的混合组分分析中，可得许多MS图谱，继之，用数据处理系统进行自动测量、记录和运算，最后根据GC图谱上的相应点，制得标准MS
谱图。
(3)质量色谱法(Mass chromatography)：将上述反复扫描所得并已储存在计算机中的MS图中重新画出一个或若干个碎片的洗脱过程图，因而也称之为重建离子流图(Reconstructed Ion Current Profile)。根据特征峰下的面积即可进行定量测定。优点是：即使分谱过程中分离很差或有峰重叠时，也能对测定物作出鉴定，并可于 g～pg范围内进行定量。
(4)质量碎片图谱法(Mass Fragmentography)：也称多离子检测(Multiple Ion Detection,MID)或选择性离子监测Selected Ion Monitoring,SIM)。此法也是GC-MS测定中最重要的方法之一。系用保留时间为横坐标，记录一个或若干个特征离子碎片的强度所构成的质量碎片图谱，也就是进行选择性离子记录。此法可提高检测灵敏度2～3个数量级，达到pg水平。通过同时记录多个碎片及其相应的离子强度比，则可大大提高测定的专一性。测定时选用的信号离子碎片应具有特征性并尽可能有强的高峰。作成适当的衍生物往往会有利于碎片信号峰的产生。当采用四级质谱作为分析器时，由于它能进行快速的电场改变，因而可在谱的全程中任意选择几个碎片质量作成质量碎片图谱；而磁铁质谱仪仅能在峰的两侧的20%左右的质谱范围内选择其它信号峰。通过测量质量碎片图下的面积，即可进行定量分析。若以供试物的稳定同位素标记物作为内标，可用于人体上直接进行研究和测定，是十分理想的定量方法。此法大多已计算机化，整个过程十分快速而方便。
3、液相色谱-质谱联用(LC-MS)：主要是HPLC-MS联用，由于接口技术的突破，HPLC-MS联用进入实用阶段。由于普通HPLC的洗脱速度约为1ml/min，这些流动相液体挥发成气体，将产生150～1200ml/min的气流。而正常真空状态的质谱仪仅能承受20ml/min的气体进入，若直接相连，质谱仪的真空系统会立即失效而无法工作。另外，HPLC常用于挥发性差、热不稳定化合物的分析，而经典MS离子化方法是将样品在真空条件下加热挥发成气体后进行离子化，两者联用时有可能发生样品热分解。CI、FAD等的使用，使发生热分解的问题得到解决。剩下的问题是找到理想的LC-MS接口，要求其应具有下列特征：
(1)对HPLC系统应无任何特殊要求，并能保证其效率；
(2)接口的死体积和时间常数要小；
(3)采用EI或CI等离子化方法时，样品不分解；
(4)采用接口后的LC-MS的稳定性和灵敏度应能与GC-MS相媲美；
(5)价格应较合理。但目前尚无一种能完全满足上述要求。常用的LC-MS接口有：传送带接口(Moving Belt Interface,MB)、直接液体进样 (Direct Liquid Introduction,DLI)、热喷射接口(Thermospray,TSP)、电喷射接口(Electrospray,ESP)、单分散气雾形成接口(Monodisperse Aerosol Generation Interface,MAGIC)等。
4、串联质谱(Tandem Mass Spectrometry,TMS)：即MS-MS。将第一台MS作为分离器，第二台作为分析仪器来对混合组分直接进行分析。此法具有三种扫描方式。第一种是子扫描(Daughter scan)，代表混合物中某一特定组分的离子，由MS1产生，输入MS2的反应区，即可得到一幅代表最初选定的特定离子的谱图，即MS-MS子谱。此方式广泛用于鉴定特定化合物，这种离子谱是由初始离子产生的，因而也就是它相应中性碎片的指纹谱。第二种是母扫描，MS1扫描时，MS2
保持恒定，得到可产生某一碎片离子的所有反应离子的谱图，即母谱。第三种是中性丢失扫描，两个质谱仪同时扫描，可给出原始混合物中所有通过丢失一个特定的中性碎片的离子的分子量。
这种中性碎片常常是某种官能团的特征。和单级MS相比，此法能明显改善信号的信噪比，对测试样品的需要量也可大大减少。因之，此法特别适用于复杂混合物中痕量组分的鉴识。
（三）MS在药物分析中的应用：由于需样量少、检测限低。已广泛用于多个学科领域，尤其是药学学科。
1、用于药品的鉴定：依据是分子离子峰与其它特征峰以及它们之间的强度比。具有完全相同质谱的药物是十分罕见的，药物分子中的杂原子可产生一些适于鉴定的特征峰。
2、用于药品的纯度检查：若杂质分子量比药物分子量大，则很容量识别；若小，则只有当药物分子产生较少碎片，以及杂质的分子峰处于谱图的空位时才能检出。此外，杂质和药品间的挥发度比也是一个影响因素。若两者具有相同挥发度时，只有当杂质存在足够大的数量时才能被检出。
3、用于药品的定量分析：常以待测组分的特征峰峰强或面积对浓度作图，得出计算曲线，借以进行MS定量分析。为减少不同操作间的误差，往往需加入内标，以内标物对测定物信号的强度比和浓度作出计算曲线。
4、用于药物分解产物或代谢产物的研究：MS及其联用技术也可用于药物在温度、光线和机体代谢等因素的作用下所产生的分解物或代谢物的结构研究和量的变化。
5、用于混合药品或复杂组分的分析：这是最能展示MS及其联用技术才能的方面。既可借助于由混合组分的各自特征信号所组成的混合物MS图谱，也可与适当的分离手段联用后逐一鉴定之。
液相色谱分析方法建立
一. 方法建立的步骤 二．开始前应知道 1. 样品的性质 在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。 表 1 有关样品组分和性质的重要信息 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度 样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。 2.分离的目的 HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？； （2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。 （4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？ （5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。 有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？ 方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。 三. 样品的预处理和检测 1. 预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现：
色谱法是一种重要的分离分析方法,它是利用不同物质在两相
色谱扫盲班 第一课色谱法概述 色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的叫气相色谱，流动相为液体的叫液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪，目前，主要有气相色谱仪和液相色谱仪。 色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特。1905年，他将从植物色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名。这就是最初的色谱法。后来，用色谱法分析的物质已极少为有色物质，但色谱一词仍沿用至今，在50年代，色谱法有了很大的发展。1952年，詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系并提出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反映载气流速和柱效关系的范笨姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年，高莱(Golay)发明了毛细管柱，以后又相继发明了各种检测器，使色谱技术更加完善。50年代末期，出现了气相色谱和质谱联用的仪器，克服了气相色谱不适于定性的缺点。则年代，由于检测技术的提高和高压泵的出现，高效液相色谱迅远发展，使得色谱法的应用范围大大扩展。目前，由于高效能的色谱往、高灵敏的检测器及微处理机的使用，使得色谱法已成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析仪器。 在这里主要介绍气相色谱分析法。同时也适当介绍液相色谱法。气相色谱法的基本理论和定性定量方法也适用于液相色谱法。其不同之处在液相色谱法中介绍。 第二课气相色谱仪 典型的气相色谱仪具有稳定流量的载气，将汽化的样品由汽化室带入色谱柱，在色谱柱中不同组分得到分离，并先后从色谱柱中流出，经过检测器和记录器，这些被分开的组分成为一个一个的色谱峰。色谱仪通常由下列五个部分组成： 载气系统（包括气源和流量的调节与测量元件等） 进样系统（包括进样装置和汽化室两部分） 分离系统（主要是色谱柱） 检测、记录系统（包括检测器和记录器） 辅助系统（包括温控系统、数据处理系统等）
气体色谱分析方法总结
永久性气体色谱分析 .方法原理 以或分子筛为固定相，用气固色谱法分析混合气中地氧、氮、甲烷、一氧化碳，用纯物质对照进行定性，再用峰面积归一化法计算各个组分地含量. .仪器和试剂①仪器气相色谱仪，备有热导池检测器；皂膜流量计；秒表. ②试剂个人收集整理勿做商业用途 或分子筛（目）；使用前预先在高温炉内，于℃活化后备 用.纯氧气、氮气、甲烷、一氧化碳装入球胆或聚乙烯取样袋中.氢气装在高压钢瓶内. .色谱分析条件 固定相：或分子筛（目）；不锈钢填充柱管φ×；柱温：室温. 载气：氢气，流量个人收集整理勿做商业用途 检测器：热导池检测器，桥流；衰减，检测室温度：室温. 气化室：室温，进样量用六通阀进样，定量管. .定性分析个人收集整理勿做商业用途 记录各组分从色谱柱流出地保留时间，用纯物质进行对照. .定量分析 由谱图中测得各个组分地峰高和半峰宽计算各组分地峰面积.已知氧、氮、甲烷、一氧化碳地相对摩尔校正因子分别为、、、.再用峰面积归一法就可计算出各个组分地体积百分数（）.个人收集整理勿做商业用途 白酒中主要成分地色谱分析 .方法原理 白酒地主要成分为醇、酯和羟基化合物，由于所含组分较多，且沸点范围较宽，适合用程序升温气相色谱法进行分离，并用氢火焰离子化检测器进行检测. 个人收集整理勿做商业用途为分离白酒中地主要成分可使用填充柱或毛细管柱，常用地填充柱固定相为；邻苯二甲酸二壬酯吐温硅烷化白色载体（目）；聚乙二醇有机载体（目）；吐温司班红色载体（目）等.也可使用以聚乙二醇或交联制备地石英弹性毛细管柱. .仪器和试剂个人收集整理勿做商业用途 ①仪器带有分流进样器和氢火焰离子化检测器地气相色谱仪、皂膜流量计、微处理机. ②试剂氮气、氢气、压缩空气，与白酒中主要成分对应地醛、醇、酯地色谱纯标样. .色谱分析条件个人收集整理勿做商业用途 色谱柱：冠醚交联石英弹性毛细管柱φ×，固定液液膜厚度.程序升温：℃（）以℃升温至℃（）. 载气：氮气，流量.燃气：氢气，流量.助燃气：压缩空气，流量. 个人收集整理勿做商业用途 检测器：氢火焰离子化检测器，高阻 Ω，衰减，检测室温度℃. 气化室：℃，分流进样分流比：，进样量. .定性分析个人收集整理勿做商业用途 记录各组分地保留时间和保留温度，用标准样品对照. .定量分析 以乙酸正丁酯作内标，用内标法定量. 有机溶剂中微量水地分析 .方法原理 以为固定相，利用高分子多孔小球地弱极性、强憎水性，可分析有机溶剂甲醇中地微量水含量.用纯水对照定性，用外标法测水地含量. .仪器和试剂①仪器气相色谱仪，热导池检测器；皂膜流量计；秒表. ②试剂个人收集整理勿做商业用途 氢气，苯水饱和溶液；（目）. .色谱分析条件 色谱柱：（目）；不锈钢填充柱管φ×；柱温：℃. 载气：氢气，流量. 个人收集整理勿做商业用途
如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法
摘要本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。 关键词薄层色谱法（TLC法）有关物质方法建立 有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。 TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。 1．测定方法类型 常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。 2．展开剂的确定（即专属性试验） 专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来验证系统适用性。之所以如此配制，目的是模仿样品中有可能存在的状态，即有少量（1%左右）杂质存在时是否能与主成分达到完全分离，只有这样才能比较客观、科学地反映样品中实际存在情况的（见图1）；而不应把该溶液配制成：主成分与中间体相同浓度的。因为一者实际检测时样品中不可能存在此种情况；二者该浓度不易确定，目前国内申报资料中一般的作法均是配制成较低的一致浓度，这样各斑点当然易于完全分离了（见图2），但在实际测定时，由于主斑点急剧增大，很易将相邻杂质包含于主成分斑点中。同样，质量标准中的系统适用性试验用溶液的配制方法亦如此。
离子色谱分析方法通则..
离子色谱分析方法通则 1 范围 本标准规定了离子色谱法对仪器的要求和分析方法。所用仪器应具备输液泵、离子交换色谱柱、抑制器以及检测器(电导检测器、安培检测器、吸光度检测器或者其中任一种检测器)等。系统中应含完成分析任务所必需的附件—色谱工作站或积分仪等。 本标准适用于多种阴离子、阳离子、有机酸、糖类的测定。 2.引用标准 GB 1.4-88 标准化工作导则化学分析方法标准编写规定 GB 3102.8-93 物理化学和分子物理学的量和单位 3 定义 3.1 电导 conductance 电阻的倒数称为电导，单位为西门子，符号是S。它的导出单位为微西门子，符号是μS。1S=106μS。 3.2 电导率 conductivity 25℃时，一立方厘米液体的电阻的倒数，以Ω1·cm1或S/cm 表示。 3.3 抑制电导检测 suppressed conductance detection 在分离柱后，采用离子交换膜或离子交换柱将淋洗液中的淋洗离子转变为弱酸、弱碱或水，使淋洗液的背景电导降低，同时提高检测灵敏度的方法称为抑制电导检测。 3.4 分辨率(分离度) resolution 评价色谱柱对相邻双峰分离情况的指示： 分峰的分离情况。分辨率按
式中 R—相邻两组分峰的分辨率 tR1——组分1的保留时间 tR2——组分2的保留时间 W1——组分1的峰底宽度 W2——组分1的峰底宽度 4 方法原理 不同的色谱柱中装填有不同类型的离子交换树脂。离子交换树脂上的活性交换基团能与样品中的离子及流动相中的淋洗离子发生离子交换作用。此种交换作用又因不同离子与树脂上的活性交换基团之间的静电力或亲和力存在差异，与树脂静电力或亲和力大的离子易被保留而难于被洗脱，静电力或亲和力小的离子则易于洗脱。随着淋洗液的流动，样品中的离子与树脂上的交换基团不断地发生交换—洗脱—再交换—再洗脱，最终被淋洗液带到检测器中形成高斯分布型色谱峰。在一定的色谱条件下组分峰的流出时间即保留时间固定，以此作为组分离子的定性依据。在一定的浓度范围内组分的峰面积(或峰高)正比于组分的浓度，积分仪拾得此信号给出组分的定量结果。 图1 分辨率示意图 5 试剂和材料 5.1 配制淋洗液、再生液的试剂纯度应是分析纯(A.R)或分析纯以上试剂。 5.2 去离子水应满足以下要求: 5.2.1 电导率:<1μS/cm(20℃时)。
实用高效液相色谱法的建立破解版
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。 一、 基本术语基本术语 读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分 在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）： 图1. 典型色谱图 1. 保留因子(k)： t t t k R ?= (1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.04 2. 拖尾因子(T f )
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 a b a f W W W T 2+= (2) 图2. 典型拖尾峰 在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63. 3. 理论塔板数（N ）
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 图3. 峰高与峰宽的关系 2(16W t N R = (3) 或 2( 54.55 .0W t N R = (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。 设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=3410 4. 分离因子(α) 10 212t t t t k k R R ??= =α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。 设在图1中峰2的保留时间为6.50min, 则分离因子为: (6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.16
色谱分析分离方法概述
色谱分析分离方法概述 本书是色谱世界《色谱技术丛书》的第一分册。全书共四章，主要说明了色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用，色谱法的特点、分类及性能比较，色谱法的原理，色谱模型理论等方面的内容。 第一章色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用 第一节色谱法发展简史 一、色谱法的出现 二、色谱法的发展 三、色谱法的现状和未来 第二节色谱法在工业生产和科学研究中的作用 一、色谱法在经济建设和科学研究中的作用 二、色谱法在分析化学中的地位和作用 第三节色谱法与其他方法的比较和配合 一、色谱法的特点和优点 二、色谱法和其他方法的配合 第二章色谱法的特点、分类及性能比较 第一节色谱法的定义与分类 一、按流动相和固定相的状态分类 二、按使用领域不同对色谱仪的分类 第二节现代色谱法的应用领域和性能比较 一、色谱法的应用领域
二、各种色谱方法的性能比较 第三章色谱法的原理 第一节色谱分析的基本原理 一、色谱分离的本质 二、色谱分离的塔板理论 第二节色谱法中常用的术语和参数 一、气相色谱中常用的术语和参数 二、液相色谱中常用的术语和参数 第三节色谱的速率理论 一、气相色谱速率理论 二、液相色谱速率理论 第四章色谱模型理论 第一节色谱模型概述 一、色谱模型理论的意义 二、色谱模型的建立 三、色谱模型的求解 第二节线性色谱 一、理想过程 二、反应色谱 三、扩散的影响 四、相间传质阻力的影响 五、同时含扩散与相同传质阻力的情形
第三节单组分理想非线性色谱 一、理想非线性色谱数学模型分析 二、谱带发展与流出曲线 三、理想非线性色谱间断解的数学意义———弱解 四、非线性反应色谱 第四节双组分理想非线性色谱 一、数学模型分析 二、情形 三、简单波的传播 四、激波 五、谱带的发展与保留值的计算 第一节色谱法发展简史 俄国植物学家茨维特于1903年在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上形成三种颜色的6个色带。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”.茨维特于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。把茨
液相色谱仪的原理和分析方法
液相色谱仪的原理及分析方法 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外,柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅣA)项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1)色谱柱的理论板数（N,用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间ｔR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2),按n=5.5４(t R/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。 （2) 分离度（R)
气相色谱分析方法的建立
气相色谱分析方法的建立
内标法与外标法 一、内标法 什么叫内标法?怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。 在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括： 1、内标物在样品里混合不好; 2、内标物和样品组分之间发生反应， 3、内标物纯度可变等。 对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样
(推荐)薄层色谱分析步骤及注意事项
薄层色谱分析步骤及注意事项 薄层色谱法(thin layer chromatography简写TLC)是物理化学的分离技术，常用于药物的分离与分析现对此方法的分析步骤及注意事项提点建议。 薄层色谱分析步骤 完成TLC分析通常需经制板、点样、展开、检出4步操作。 ⑴制板 在一平面支持物(通常玻璃)上，均匀地涂制硅胶、氧化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有：10cm×20cm、5 cm×20cm、20cm×20cm等。称取适量硅胶，加入0.2％～0.5%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-N a），充分搅拌均匀，进行制板。一般来说10cm×20cm的玻璃板，3～5g硅胶/块；硅胶与羧甲基纤维素钠的比例一般为1：2～1：4。制好的玻璃板放于水平台上，注意防尘。在空气中自然干燥后，置1l0℃烘箱中烘0.5～lh，取出，放凉，并将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。 ⑵点样 用微量进样器进行点样。点样，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm.底线距基线1～2．5cm，点间距离为lcm左右，样点与玻璃边缘距离至少lcm，为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1～2cm，再进行点样。 ⑶展开 将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定距离后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。 ①展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高、 宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖。 ②展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。
气相色谱的定性与定量分析
气相色谱的定性与定量分析 一、 实验目的： 1、 学习计算色谱峰的分享度 2、 掌握根据纯物质的保留值进行定性分析 3、 掌握用归一化法定量测定混合物各组分的含量 4、 学习气相色谱信的使用方法 二、 方法原理 1、 柱效能的测定：色谱柱的分享效能，主要由柱效和分离度来衡量。柱效率是以样品中验 证分离组分的保留值用峰宽来计算的理论塔板数或塔板高度表示的。 2 2 21 1654 .5??? ? ??=??? ? ? ??=b R R W t W t n 理论塔板数： n L H = 理论塔板高度： 式中R t 为保留值（S 或mm ）：2 1W 为半峰宽（S 或mm ）：b W 为峰底宽（S 或mm ）：L 为 柱长（cm ）。 理论塔板数越大或塔板高度越小，说明柱效率越好。但柱效率只反应了色谱对某一组分的柱效能，不能反映相邻组分的分离度，因此，还需计算最难分离物质对的分离度。 分离度是指色谱柱对样品中相邻两组分的分离程度，对一个混合试样成功的分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。分离度R 的计算方法是： 2 112)(2B b R R W W t t R +-= 或 ()） （ ）（221121122W W t t R R R +-= 分离度数值越大，两组分分开程度越大，当R 值达到1.5时，可以认为两组分完全分开。 2、 样品的定性： 用纯物质的保留值对照定性。在一个确定的色谱条件下，每一个物质都有一个确定的保留值，所以在相同条件下，未知物的保留值和已知物的保留值相同时，就可以认为未知物即是用于对照的已知纯物质。但是，有不少物质在同一条件下可能有非常相近的而不容易察觉差异的保留值，所以，当样品组分未知时，仅用纯物质的保留值与样品的组分的保留值对照定性是困难的。这种情况，需用两根不同的极性的柱子或两种以上不同极性固定液配成的柱子，对于一些组成基本上可以估计的样品，那么准备这样一些纯物质，在同样的色谱条件下，以纯物质的保留时间对照，用来判断其色谱峰属于什么组分是一种简单而行方便的定性方法。 用标准加入法来定性。首先用未知的混合样品在一定的色谱条件下采集混合物样品的色谱峰，然后取一定量的混合物样品中加入怀疑有的物质的纯物质，在相同的色谱条件下采集加入某纯物质的色谱峰，用两个色谱图进行比较，就会发现两个色谱图上某一个峰的保留值相同，但加了某纯物质的色谱图上的色谱峰的峰高增加、峰面积增大，那么此峰即为某纯物质。 3、 样品的定量
气相色谱法的优点色谱分析方法的建立气相色谱法
气相色谱法的优点色谱分析方法的建 立/气相色谱法 如何来确定是柱子流失还是系统污染带来的基线漂移呢？最简单的方法就 是把柱子从色谱仪上取下，堵住检测器的入口，再观察在程序升温时基线的漂移情况第二部分气相色谱法的建立 第一早刖言 1，引言 2, 那些样品可以作为分析对象 1, 引言 气相色谱法是根据气-固、气-液、气-液-固之间的相平衡，借溶质分配系数的不同而进行分离的方法建立相平衡的"界面"最好是无穷大，气相色谱法能满足在这个极大的表面上瞬间建立相平衡的条件 由于一般用惰性气体作载气，故可认为溶质和载气分子之间基本上没有相互作用为减少色谱柱中的纵向扩散，流动相最好用分子量大的载气另外，还存在一个使理论塔板高度（H）最小的最佳线性流速但气相色谱法在选择色谱柱时基本上可以忽略这些研究固定相液体、载体表面、吸附剂以及溶质在液相中或固体表面上的分子间相互作用，才是选择色谱柱的必要事项 2, 那些样品可以作为分析对象 分析样品的物性（如沸点、官能团、反应性、溶解的溶剂系统等）与选择气相色谱的分离条件密切相关
保留体积（Vg）与样品沸点（TB）之间的关系： 式中：M1-液相的分子量，丫-溶质的活度系数(同系物溶质的丫基本相同，则保留体积的对数与TB成直线关系)，T-色谱柱温 (1)溶质之间沸点相差20C时：容易用标准色谱柱分离； ⑵溶质之间沸点相差10C时：若选择与溶质有相似极性的固定液，很容易分离； (3)溶质之间沸点相差5C时：用较长的色谱柱或用结构与溶质很类似的固定液； ⑷溶质之间沸点相差0~2C时：当两者的沸点相近时，若每种溶质的官能团不同，选用与其中一种溶质的极性相近的固定液就容易进行分离但对具有相同官能团的同系物要选择可以利用结构差异的固定相(如分离o-，m-，p-位 取代苯可用FFAP/Carbopak C等气-液-固体系)； ⑸溶质沸点在-50C以下：用强吸附剂作填料，而且柱温要置于低温; (6) 溶质沸点在-50~20C :用吸附剂或以吸附剂为载体，且在担体上涂渍 极性固定液的填料； (7) 溶质沸点在20~300C :几乎所有的填料均可使用； (8) 溶质沸点在300C以上：用高沸点固定液或根据情况将样品衍生化后再供分析用，或者用液相色谱法测定 第二章色谱分离条件选择的指标 1, 柱效能(N) 2，选择性(a) 3, 分离度(R)
气相色谱定性分析
气相色谱定性分析 一、实验目的 1、了解气相色谱仪的基本结构和工作原理。 2、学习和熟悉气相色谱仪的基本操作。 3、了解氢火焰离子化检测器和电子俘获检测器的原理和特点。 二、实验原理 各种物质在一定的色谱条件（固定相与操作条件等）下有各自确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。对于简单的多组分混合物，若其中所有待测组分均为已知且它们的色谱峰均能分开，则可将各个色谱峰的保留值与各相应的标准试样在同一条件下所得的保留值进行对照比较，就能确定各色谱峰所代表的物质，这就是纯物质对照法定性的原理。该法是气相色谱分析中最常用的一种定性方法。以保留时间作为定性指标，虽然简便，但由于保留时间的测定受载气流速等色谱操作条件的影响较大，可靠性较差；若采用仅与柱温和固定相种类有关而不受其他操作条件影响的相对保留值r is 作为指标，则更适合用于色谱定性分析。相对保留值r is 定义为： M R M R R R is t t t t t t r S i S i --== '' 式中'',,S i R R M t t t 分别为死时间，被测组分 i 及标准物质s 的调整保留时间；s i R R t t ,为被测组 分i 及标准物质s 的保留时间。 氢火焰离子化检测器（FID ）是典型的破坏性、质量型检测器，是以氢气和空气燃烧生成的火焰为能源，当有机化合物进入以氢气和氧气燃烧的火焰，在高温下产生化学电离，电离产生比基流高几个数量级的离子，在高压电场的定向作用下，形成离子流，微弱的离子流（10-12～10-8A ）经过高阻（106～1011Ω）放大，成为与进入火焰的有机化合物量成正比的电信号，因此可以根据信号的大小对有机物进行定量分析。本实验以丙酮作为标准物质，利用保留时间和相对保留值进行甲苯和乙酸乙酯的定性分析。 三、仪器与试剂 1、Agilent 6890N Network GC system ，FID 检测器 2、氮气、氢气、空气 3、微量注射器：1μL 和50μL 4、 试剂：丙酮、甲醇 5、配制混合试样 在2只10mL 的容量瓶内，按1：1的比例分别配制丙酮、甲醇溶液，摇匀备用。 四、实验步骤 1、开机
色谱分析和其他分析方法的对比
.1.气相色谱与光谱、质谱法比较 气相色谱法的最大优点是易分离。分析多组份混合物，光谱(红外，紫外光谱)、质谱法就不及色谱法。而且一般来说色谱法的灵敏度与质谱接近，比光谱要高，造价却比光谱、质谱仪都低。色谱法的缺点主要是难以对未知物分析定性，如果没有已知的纯样品或已知纯样品的色谱图，就很难判断某一色谱峰究竟代表何物。而质谱则既能分析多组份混合物，且可测定出未知物的分子沮。用光谱法可以测出分子中含有那些官能团。这些都是气相色谱法所不及的。所以把色谱与质谱、光谱结合起来联用，就可以解决未知物的分析问题，发挥更大的作用，成为目前解决复杂混合物强有力的先进手段之一。这种结合包括收集色谱分离后的单组份或窄馏份，用光谱、质谱定性。色谱一质谱联用，色谱一光谱联用等。国内利用毛细管色谱一质谱联用仪成功地解决了一些油品的组份分析。不论从速度或效果看，都是十分理想的。比如最好的鉴别仪器是在线微波水分仪等等。 2．近红外光谱分析法 与常规分析技术不同，近红外光谱是一种间接分析技术，必须通过建立校正模型（标定模型）来实现对未知样品的定性或定量分析。具体的分析过程主要包括以下几个步骤：一是选择有代表性的样品并测量其近红外光谱；二是采用标准或认可的参考方法测定所关心的组分或性质数据；三是将测量的光谱和基础数据，用适当的化学计量方法建立校正模型；四是未知样品组分或性质的测定。由近红外光谱分析技术的工作过程可见，现代近红外光谱分析技术包括了近红外光谱仪、化学计量学软件和应用模型三部分。三者的有机结合才能满足快速分析的技术要求，是缺一不可的。 与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术具有诸多优点，它能在几分钟内，仅通过对被测样品完成一次近红外光谱的采集测量，即可完成其多项性能指标的测定（最多可达十余项指标）。光谱测量时不需要对分析样品进行前处理；分析过程中不消耗其它材料或破坏样品；分析重现性好、成本低。对于经常的质量监控是十分经济且快速的，但对于偶然做一两次的分析或分散性样品的分析则不太适用。因为建立近红外光谱方法之前必须投入一定的人力、物力和财力才能得到一个准确的校正模型。 近红外光谱主要是反映C-H、O-H、N-H、S-H等化学键的信息，因此分析范围几乎可覆盖所有的有机化合物和混合物。加之其独有的诸多优点，决定了它应用领域的广阔，使其在国民经济发展的许多行业中都能发挥积极作用，并逐渐扮演着不可或缺的角色。主要的应用领域包括：石油及石油化工、基本有机化工、精细化工、冶金、生命科学、制药、医学临床、农业、食品、饮料、烟草、纺织、造纸、化妆品、质量监督、环境保护、高校及科研院所等。在石化领域可测定油品的辛烷值、族组成、十六烷值、闪点、冰点、凝固点、馏程、MTBE含量等；在农业领域可以测定谷物的蛋白质、糖、脂肪、纤维、水分含量等；在医药领域可以测定药品中有效成分，组成和含量；亦可进行样品的种类鉴别，如酒类和香水的真假辨别，环保废弃物的分检等。 3. 一、近红外光谱技术的发展过程：近红外区域按ASTM定义是指780~2526 nm范围内的电磁波，是人类最早发现的非可见光区域。50年代中后期，近红外光谱漫反射分析技术开始广泛应用于农副产品的测定。 进入60年代中后期，随着（中）红外光谱技术的发展及其在化合物结构表征中所起的巨大作用，人们淡漠了近红外光谱在分析测试中的应用。直至80年代后期，近红外光谱才真正为人们所注意，这在很大程度上归功于化学计量学方法的应用，再加上过去中红外光谱技术积累的经验，使近红外光谱技术迅速得以推广。
色谱分析法
在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制型离子色谱法. 但是如果选用低电导的流动相(如1×10-4~ 5 ×10-4M的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐),则由于背景电导较低,不干扰样品的检测,这时候不必加抑制柱,只使用分析柱,称为非抑制型离子色谱法. 例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相,钠离子的干扰非常严重,这时可在分析柱后加一根抑制柱,其中装填高容量H+型阳离子交换树脂,通过离子交换,使NaOH转化为电导值很小的H2O,从而消除了背景电导的影响. 何为化学抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。 薄层色谱法（TLC）是将样品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，利用不同组分迁移的速度不同，使样品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。 固定相：吸附剂流动相：展开剂分离原理：吸附、解吸附 特点：设备简单、操作方便专属性强、展开剂灵活多变、 色谱图直观和容易辨认具分离和分析双重功能 “三高、一快、一广”高灵敏度、高选择性、高效能 分析速度快应用广 分类（根据作为固定相的支持物不同）： ?薄层吸附层析（吸附剂） ?薄层分配层析（纤维素） ?薄层离子交换层析（离子交换剂） ?薄层凝胶层析（分子筛凝胶） 一般实验室中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即比移值（Rf）是化合物的物理常数，其大小与化合物的极性有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。 色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 可用于精制样品，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐
液相色谱分析方法开发的技巧
液相色谱分析方法开发的技巧 你是否一直头疼于液相实验室或是方法开发问题出现的各种意外状况？或许本文总结的“应该避免做的七件事【DDT（Don't Do That）】”可以帮到你。以下提到7个DDT并没有特别的先后顺序，但是如果都能避免的话，我相信可以让在实验室的日子少一些鸡飞狗跳，多一些岁月静好。 DDT #1：不要滴定含有有机溶剂的溶液 配制缓冲液和并调节其pH有三种方法：正确的方法，简便的方法和错误的方法。 例如我们打算配1000 mL pH 4.0，浓度为20 mM的醋酸盐缓冲液。 正确的方法根据一些网站或者计算工具的计算结果称量好需要的醋酸和醋酸钠的量，然后使用容量瓶稀释到1000 mL。或者也可以分别配好20mM的醋酸溶液和醋酸钠溶液，然后混合在一起直到测到的pH是4.0为止。这两种方法都可以得到大约1000 mL pH 4.0 浓度20 mM的缓冲液。 简便的方法是先配好1000 mL 20mM的醋酸钠溶液，然后使用浓醋酸滴定到pH达到4.0。这方法会配得比1000 mL稍微多的缓冲液，而且使用了高浓度的醋酸滴定，所以缓冲液浓度不再是20mM。但是这有关系吗？如果使用反相柱的话，缓冲液的浓度影响并不大，所以得到的谱图基本不会有差别。但是如果使用离子交换、HILIC、混合模式或是其他的离子作用模式，缓冲液的浓度就有影响了，这时使用上述两种不同方法配出来的缓冲液很可能得到不同的谱图。所以在这些情况下不管使用哪一种方法配制的缓冲液，都要把配制具体方法记录下来，确保以后的分析人员在重复实验时可以得到相同的分析结果。 错误的方法是将缓冲液与有机溶剂（如甲醇或者乙腈）混合后再进行pH滴定。要知道当把有机溶剂加入到水溶液中后，pH计会测出与加入有机溶剂前不同的数据，而且实验室的温度对滴定含有有机溶剂的缓冲液影响也大，我就有遇到使用这种方法配出的缓冲液，在夏天开发出来的方法，在冬天就没法重复，就是因为实验室温控不好而导致冬夏温差大，结果冬天和夏天利用这方法配制的缓冲液就有明显的差异。 当我们描述一个液相分析方法的缓冲液成分和pH时，习惯把其中的pH对应缓冲液中的水相部分的pH，而忽略加入有机溶剂后缓冲液的pH的变化。加入有机溶剂后，pH的值是会改变，但是如果我们每次都是以相同的方法配制的话，每次的改变都应该是相同的。DDT #1就是提醒我们一定要避免滴定含有有机溶剂的缓冲液。 DDT #2：避免在多个方法上使用同一支柱子 当两个不同的方法需要使用规格和描述完全相同的色谱柱时，避免使用同一支柱子，建议每个方法单独使用一支色谱柱。或许有人好奇在不同的方法上使用同一支柱子到底有什么不好呢？虽然看上去一柱多用挺方便和经济，但是我们迟早会发现前一个方法中的杂质，辅料或是较晚出峰的分析物很可能会在第二个方法中出现，甚至在使用同一支柱子以不同方法分析同一种分析物时，也可能会有
气相色谱的原理定性定量分析
气相色谱的原理及定性定量分析 基本原理 气相色谱是将有机物分离的一种方法，它也可以对混合物的组成进行定性定量分析。混合物是通过在流动相和固定相中的相作用而分离的。流动相和固定相构成色谱法的基础。流动相可以有气体和液体两种状态，固定相则有液体和固体两种状态。流动相是气体的称作气相色谱。流动相是液体的称做液相色谱。气相色谱是一种分配色谱，其固定相是由特定的液体黏附在一些固体基质上组成的。 各种气相色谱仪虽然在功能、价格和操作上有所不同，但其都是由气流系统、分离系统、检测系统和数据处理系统所组成的。如下图：
气相色谱的气流系统主要包括气源和气体纯化及调节装置。气源一部分是作为流动相 的载气，我们所使用的载气是氮气。气源的另一部分是作为后期检测所用的燃烧气体，主要是氢气和空气。由于进入分离系统的气体纯度需要保证，所以不论气源纯度如何，都应通过气体净化装置才能进入色谱分离系统。虽然根据检测器或色谱柱不同，气相色谱的气体纯度有所差异，但所有气体的纯度至少要达到99％以上，许多情况下应达99?99％。气相色谱分离系统包括样品汽化室和色谱柱两部分。气相色谱分离技术需要所测有机物样品必须在气态才能进行，因此，首先需要将液态或固态的样品加热(100一300℃)汽化才能进入色谱柱进 行分离。这样气相色谱进样是用人工或自动注射的方式将有机样品首先注入汽化室。 气相色谱的定性定量分析 气相色谱主要功能不仅是将混合有机物中的各种成分分离开来，而且还要对结果进行定 性定量分析。所谓定性分析就是确定分离出的各组分是什么有机物质，而定量分析就是确定分离组分的量有多少。色谱在定性分析方面远不如其它的有机物结构鉴定技术，但在定量分析方面则远远优于其它的仪器方法。
液相色谱定量分析方法
当前位置：液相色谱仪->相关知识->定量分析 色谱法不仅是一种分离方法，而且通过被分离组分分别进入检测器，能精确测的各组分在样品中的含量。 定性分析：通常用与标准样比较保留时间进行定性，即保留时间相同可能是同样的组分；保留时间不同，肯定不是同样的组分。 液相色谱定量分析的基本原理 定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。 液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。液相色谱法定量的依据： 被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。 定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。 由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。 测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。 定量分析常用术语： 样品（sample）含有带测物，供色谱分析的溶液。分为标样和未知样。 标样（standard）浓度已知的纯品。 未知样（unknow）浓度待测的混合物。 样品量（sample weight）待测样品的原始称样量。 稀释度（dilution）未知样的稀释倍数。 组分（componance）欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。 组分的量（amount）被测物质的含量（或浓度）。 积分（integerity）由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。 校正曲线（calibration curve）组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。 常用的定量方法 标准曲线法，分为外标法和内标法。 外标法在液相色谱中用的最多。 内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。 外标法 用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。 注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。 在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，