基因打靶技术的研究进展

基因打靶技术的研究进展
基因打靶技术的研究进展

技术与方法

生物技术通报

BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第9期

基因打靶技术的研究进展

张丽娜

刘国安

杨红

(西北师范大学生命科学学院,兰州730070)

摘 要: 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA 同源重组原理和胚胎干细胞(ES 细胞)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的试验手段,具有广阔的应用前景。对基因打靶技术原理、步骤、条件性基因打靶以及应用进行综述。

关键词: 基因打靶

DNA 同源重组

胚胎干细胞

The Research Progress ofGene Targeti ng

Zha ng L i na

L i u Guoa n

Y ang Hong

(College of Li fe Scie nce ,N or t h w estN or mal Uni versit y,Lanzhou 730070)

Abstrac:t G ene targeti ng is a ne w techn i que e m erged fro m the 1980s ,as an experi m enta lm ethod based on DNA hom og enous re

comb i nati on theo ry and embryon i c ste m cell(ES cell)system t o mod if y specific genes and m ake them express i n an o rganis m.It has been app lied i n som e aspec ts and w ill be used w i dely i n t he future .In th i s paper ,t he theo ry ,step ,appli cation of gene targeti ng and con d iti ona l genet targ eti ng w ere rev i ewed .

K ey words : G ene targeti ng

DNA ho m ogenous recomb i nation Embryon ic ste m cell

收稿日期:2010 03 26

基金项目:省教育厅研究生导师项目(0901 05)

作者简介:张丽娜,女,讲师,硕士研究生,研究方向:生化与分子生物学;E m ai:l li na791001@163.co m

基因打靶(gene tar geti n g )技术是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是利用基因转移方法,将外源DNA 序列导入靶细胞后,通

过外源DNA 序列与靶细胞内染色体上的同源DNA 序列间的重组,将外源DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,或对某一预先确定的靶位点进行定点突变,从而改变细胞遗传特性的方法

[1]

该技术具有定位性强、打靶后目的片段与染色体DNA 共同稳定遗传的特点,为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强有力的工具。美

国科学家马里奥 卡佩基(M ario R.Capecchi)、奥利弗 史密斯(O li v er Sm ith i e s)和英国科学家马丁 埃文斯(M arti n J .Evans)因基因打靶技术的开创性研究而获得了2007年度诺贝尔生理或医学奖。

1 基因打靶技术的原理

基因打靶技术是在胚胎干细胞(ES)技术和同

源重组理论的基础之上产生和发展的。同源重组是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA 分子之间或分子之内的重新组合。C apecchi 和S m ithies 都首先预见到新的遗传物质可以通过同源重组引入哺乳动物细胞的基因组,并对基因进行特异性修饰和改造。Capecch i 证明同源重组可以发生在外源DNA 和哺乳动物细胞染色体的同源序列间。他构建了一种携带有缺陷的新霉素抗性基因的细胞系,并证明这种有缺陷的抗性基因可以通过与外源DNA 间的同源重组得到修复[2]

。在

C apecchi 这些先驱性的工作进行同时期,Sm ith i e s

[3]

提出了同源重组可能用于修复突变基因的概念,并在1985年报道了在红白血病细胞中实现了人工打靶载体和细胞染色体上 球蛋白基因间的同源重组。然而这些工作都是在体外培养的细胞中进行的。要通过同源重组获得遗传修饰的动物,还需

生物技术通报B iotechnology Bulletin2010年第9期

要另外一种重要的载体 ES细胞[4]。

胚胎干细胞(e m bryon ic ste m cells,ES)是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞,具有向各种组织细胞分化的潜能,能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后,将它重新植回小鼠胚胎,它能发育成胚胎的各种组织。1981年,Evans等[5]和M ari n[6]分别报道从正常的小鼠囊胚中分离了ES细胞。与大多数EC细胞不同,ES 细胞具有完全正常的核型。尤其重要的是,Evans 等[7]研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系。胚胎干细胞的分离和体外培养的成功奠定了基因打靶技术的基础。

2 基因打靶技术的基本环节

基因打靶的技术要点如下:基因打靶载体的构建:把目的基因和调控序列等与内源靶序列同源的序列都重组到带标记基因的载体上;!打靶载体的导入:用电穿孔和显微注射等方法将打靶载体导入受体细胞内;?同源重组子的筛选:用选择性培养基筛选打靶击中的重组阳性细胞;#将重组阳性细胞转入动物胚胎,产生转基因动物,并进行形态观察和分子生物学检测。

2 1 打靶载体的构建

基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列。其中同源序列是同源重组效率的关键因素。试验表明,在哺乳动物细胞内,当同源序列长度在295bp-1 8 kb之间时,重组率与同源序列长度呈正比,当同源序列长度在200bp以下时,重组效率明显降低[8,9]。

基因打靶载体有基因插入型载体(gene i n ser ti o n vector)和基因置换型载体(gene rep lace m ent vector)。插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点,线性化后,同源重组导致基因组序列的重复,从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧,线性化后,同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。

近些年发展起来的基于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统,也称为重组工程(reco m b i n eering),可以在线性化DNA片段和大肠杆菌染色体、B AC和P AC克隆等之间实现同源重组,该技术所需的同源序列短(40-60bp),不需使用限制性内切酶和连接酶,为构建打靶载体提供了一个高效、精确、灵活的平台[10,11]。例如,2007年Chan等[12]通过改进重组工程系统的技术,在96孔板上可进行全部的操作,同时完成96个条件基因打靶载体的构建只需要2周,使大规模构建基因打靶载体成为可能。

2 2 转化受体细胞

外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力,可用于时空特异性基因打靶,在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力[13]。

通常情况下,遗传修饰的中靶ES细胞通过显微注射被引入受体囊胚的内细胞团中。这些ES细胞必须整合入生殖系,才能使修饰过的遗传信息传递到子代小鼠。为了快速获得基因打靶小鼠,一些研究小组采用四倍体囊胚补偿技术,通过电融合获得只能发育为胎盘组织的小鼠四倍体囊胚用于中靶ES细胞的显微注射,ES细胞在这样的环境中能利用其全能性发育为一个完整的个体,从而直接获得基因突变的杂合子小鼠[14-16]。2007年,Pouey m irou 等[17]报道了将中靶的ES细胞通过激光辅助注射到8细胞期的小鼠胚胎中,此时受体胚胎的内细胞团还没有形成,使得中靶ES细胞更具竞争力。通过这种方法获得的F0代小鼠几乎完全由中靶ES细胞发育而来,并100%能经过生殖系将突变基因遗传到F1代小鼠。这种改良的显微注射方法不受ES细胞品系的限制,显著提高了中靶ES细胞的整合效率,大大缩短了基因打靶小鼠研制的周期[4]。

2 3 筛选受体细胞

由于外源基因与靶细胞DNA可发生同源重组或非同源重组,而且同源重组的发生频率较低,故必须从中筛选出被转化的靶细胞,并从中去除随机插入的细胞。这就需要在打靶载体上加入正负选择系统(positive and negative selecti v e syste m)。其原理是首先在体外构建打靶载体,然后在靶基因的同源序列之间插入新霉素抗性基因(neo)作为正筛选的标

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2010年第9期张丽娜等:基因打靶技术的研究进展

记,在同源序列的3?端插有不含启动子的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(H SV tk)作为负选择,疱疹病毒胸苷激酶基因由邻近的新霉素抗性基因启动子调节。将打靶载体导入细胞后,因为随机整合使新霉素抗性基因与胸苷激酶基因同时整合至基因组中,胸苷激酶基因的表达产物能将致死核苷类似物9 (1,3 二羟 2 丙氧甲基)鸟嘌呤代谢成致死核苷,从而杀死随机整合细胞。而同源重组细胞由于仅有位于同源序列之间的新霉素抗性基因而整合,在药物G418和丙氧鸟苷的双重筛选下仍能存活。该系统主要是通过杀死随机整合细胞而浓缩同源重组子克隆,达到从大量随机整合的细胞中筛选到同源重组子克隆的目的[18]。

2 4 中靶细胞的鉴定

采用特异PCR和Southern杂交等技术对所筛选克隆的基因组进行鉴定。进行PCR鉴定时,先设计一对引物,其一端以打靶细胞染色体基因组DNA 的特定基因座为模板,另一端以载体上导入的外源基因为模板,对筛选细胞的染色体DNA进行特异PC R扩增,这样可保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。然后对经PCR鉴定的克隆用South er n杂交产生特殊带谱的方法来进一步确定同源重组克隆,即中靶细胞。

3 条件性基因打靶技术

条件性基因打靶(conditiona l gene tar geti n g)可定义为将某个基因的修饰限制于某些特定类型的细胞或小鼠发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。它实际上是在常规的基因打靶的基础上,利用重组酶介导的位点特异性重组技术,在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的%按纽&,从而使对小鼠基因组的修饰范围和时间处于一种可控状态。条件性基因打靶的基本原理是利用一种位点特异性的重组酶Cre。C re是一种主要存在于低等生物体中,但在哺乳动物细胞中能有效的发挥作用的重组酶[19]。这个酶的特点是可特异性识别具有34个碱基的不对称的核酸序列loxP,使得两个位于l o xP之间的序列发生重组。C re/l o xP系统首先是使目的基因位于两个同向的loxP位点之间,然后在ES细胞内发生同源重组,选择性标记筛选后,将其注入胚囊中,最后再注入假孕小鼠子宫内以繁殖转基因小鼠。这与传统的敲除技术一样,但是产生的小鼠却与正常小鼠表型一致,仅在基因组上目的基因的两端含有loxP位点。当Cre出现时,l o xP位点间的目的基因被敲除。因此这个系统不但需要目的基因位于loxP位点间的转基因小鼠,还需要C re转基因小鼠。将C re序列的前端插入组织特异性的启动子,就使得Cre在特定的组织或细胞中表达,导致这些组织或细胞中的靶基因被敲除,而其它组织或细胞中Cre不表达,靶基因不会被改变,也就形成不同组织特异性的C re转基因小鼠[20,21]。因此,当目的基因位于loxP位点间的转基因小鼠与组织特异性的C re转基因小鼠交配后,则目的基因就可在特异的组织中敲除,达到了敲除组织类型上的控制[22]。军事医学科学院生物工程研究所的研究者在国内自主研制成功了10余种组织特异性Cre重组酶转基因小鼠以及系列组织特异性条件基因敲除小鼠,通过对突变小鼠的表型分析,系统地揭示了Sm ad4基因在组织器官发育和稳态维持以及相关疾病发生过程中的作用机制[4]。

4 基因打靶技术的应用

4 1 基因功能的研究

后基因组时代的主要任务就是分析大量新基因的功能。研究者利用基因打靶技术揭示了某些基因在组织器官发育、生理过程以及疾病发生中的重要功能。例如,Lo li n等[23]敲除试验鼠体内负责编码产生S6蛋白激酶1的基因,可以起到%热量限制&的效果,试验鼠患与衰老有关疾病的情况可大大减少,其中雌性试验鼠的寿命可延长约五分之一。这一研究为开发抑制人类衰老的药物提供了思路。最近日本研究者发现,小鼠内的转录抑制因子Bm i1基因被敲除后,造血干细胞失去了多能性,只能分化成淋巴细胞。由此认为该基因是造血干细胞生成血细胞过程中的一个关键分化基因[24]。W u等[25]通过同时敲除小鼠卵巢上皮中的两个抑癌基因PTE N 和Apc,结果表明小鼠100%发生卵巢子宫内膜腺癌,其肿瘤的发生、发展以及转移过程均与人类疾病相似。Zhao等[26]将m i R 1 2基因靶向敲除后,可导致50%突变小鼠在分窝前死亡,研究结果揭示了该m i R NA在调节心脏形态发生、电传导和细胞周期控制方面的生理功能。

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生物技术通报B iotechnology Bulletin2010年第9期

4 2 建立人类疾病的动物模型

由于人类疾病动物模型对医学和生命科学的研究非常重要,而以自然或诱发发生的人类疾病模型既不能满足现代医学研究的需要,也具有很大的局限性。基于基因同源重组原理的基因打靶技术的出现,使转基因在体内的定点整合成为现实,因而产生了去除特定基因的动物模型。例如,A ron等[27]用基因打靶技术剔除了大鼠一个插入报告基因和两个内源基因I g M和Rab38,成功培育出首只永久可遗传的基因突变大鼠,为后续开发人类疾病基因突变动物模型奠定基础。Ja m es等[28]发现敲除一个对正常肌肉功能至关重要的肌动蛋白基因,小鼠肌肉仍然能够形成,但是肌肉细胞功能受损。在这个发现的基础上建立了目前了解甚少的人类肌肉疾病的新小鼠模型,该模型还给研究退化肌肉疾病的遗传学家一个研究人类中央核疾病的新靶标。Shapir o 等[29]通过基因打靶途径建立了肺慢性阻塞性疾病小鼠模型,为肺慢性阻塞性疾病的基因治疗提供了很好的动物模型。随后,利用基因打靶技术建立了人类癌症、心血管疾病、骨质疏松、神经退行性病变、免疫缺陷等疾病小鼠模型,为疾病机理研究、新药研发和治疗方案提供了宝贵的遗传资源。

4 3 用于疾病的基因治疗

基因治疗是纠正疾病相关缺陷基因的一种技术,大多数试验性基因治疗是从正常基因替换异常的致病基因。因此通过基因敲入技术将正常基因引入病变细胞中。代替原来异常的基因或对缺陷基因进行精确改正。使修复后的细胞表达正常蛋白,不再表达错误产物,是一种理想的基因治疗策略。另外,可通过基因打靶技术敲除多余的、过量表达的、影响正常生理功能的基因,以达到治疗目的。

4 4 用于改造生物和培育新的生物品种

基因打靶技术不仅适用于动物。而且可以应用于植物,使转基因植物和生物反应器的制备更为精确。外源基因将被准确地插入受体的基因组中。定点改造原有的基因功能,使生物获得优良的性状,并避免由于外源基因在基因组中随机整合可能带来的不利影响。对动植物生殖细胞或早期胚胎干细胞的基因进行修饰改造,可以产生一些人类需要的新品种。如生长速度、喂食效率(feed e fficiency)等特性的改造。M yostati n基因敲除小鼠比野生型小鼠具有明显多的骨骼肌[30],双肌牛也是由于M yosta ti n 基因外显子3个碱基突变造成的。因而如果能在绵羊或猪上敲除该基因将可产生骨骼肌明显增大的品种,这将具有很高的经济价值[31]。又如Ralph等[32]敲除了烟草中一种能够将尼古丁转化成去甲烟碱的基因,结果表明,遗传修饰的烟草植株中致癌物NNN的量减少了6倍,并且与烟草致癌有关的亚硝胺物质减少了50%。这一发现可能有助于发展出致癌物含量减少的烟草产品或无烟烟草产品。在中国,袁三平发明了一种利用基因打靶技术制备哺乳动物乳腺生物反应器的方法,通过该方法将医用蛋白基因加到基因打靶动物中,可以获得合成医用蛋白的基因打靶生物反应器。这将对人类的健康产生深远的意义。

5 展望

基因打靶技术自诞生以来,对生命科学和医学的研究领域产生了深远的影响。它使得科学家第一次能对关于特定基因生理功能的假设进行试验验证。基因打靶技术的应用使得研究者可以在生理状态下深入研究基因在哺乳动物胚胎发育、神经系统、心血管系统和免疫系统等复杂生物学过程和组织器官中的功能。现在的发展趋势是:(1)通过条件基因打靶技术在时间和空间上对基因剔除进行调控;

(2)发展满足大规模基因功能研究需要的随机基因打靶技术;(3)通过定位引入技术在基因组上引入精细突变以研制精确模仿人类疾病的动物模型。

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基因敲除技术研究新进展2011

基因敲除技术研究新进展 黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所 gene knockout)技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells,ES cells)以取代目的基因,再筛选出已靶向灭活的细胞,微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明,使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献,在该领域取得重大进展的三位科学家,70岁的美国人chi)、82岁的美国人奥利弗?史密西斯(Oliver Smithies)和66岁的英国人马丁?埃文斯(Martin Evans)分享了2 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术,属完全性基因敲除,不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物,被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础,Cre在哪种组织细胞中表达,基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术,其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制,避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术,即可诱导的区域性蛋白质敲除技术,用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能,从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性,达到空前的时间精度,成组研究最先进的工具之一。 以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成,因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类,大动物更有益于某些繁琐的手术操作,同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。 一、大鼠ES细胞基因打靶技术 ,大鼠的生理和药理特性与人类更相近,是研究人类疾病的一种重要动物模型,在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新,用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠,这在基因敲除技术上又是

转基因研究的现状及发展

转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点,中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速,由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年,是一境利与弊的争论,措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代,其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状,分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1.在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种,通过克隆特定基因组中的某些编码片段,对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组,如果转基因在宿主基因组能得以表达,那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力,或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。(其用于遗传育种,不仅可以加速改良的进程,使选择的效率提高,改良的机会增多,并且不会受到有性繁殖的限制。)例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊,获得的转基因动物抗病力明显提高;丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中,为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2.在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白(乳腺生物反应器)可能是转基因动物的最大应用,这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom (1992)用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连,融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前,把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注,不仅各国政府投资,一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3.转基因的应用存在的问题及展望 (1)转基因表达水平低,许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响,往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达,影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性,从而使大部分转基因表达水平极低,极少部分基因表达水平过高。 (2)难以控制转基因在宿主基因组中的行为,转基因随机整合于动物的基因组中,可能会引起宿生细胞染色体的插入突变,还会造成插入位点的基因片段丢失,插入位点周围序列的倍增及基因的转移,也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 (3)不了解哪些基因控制多数生理过程,不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 (4)制作转基因动物的效率低,这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题,也是制约着这项技术广泛应用的关键。 (5)对传统伦理是一种挑战,对人类的生存有一定的负面作用等。 当然,我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术,配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟,许多问题有望逐步得到解决。

基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目:基因敲除技术研究进展 作者:王振宇 学号:201207744 指导教师:谢放 完成日期:2014-7-16

基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上,本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术,针对某个序列已知但功能未知的序列,改变生物的遗传基因,令特定的基因功能丧失作用,从而使部分功能被屏障,并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立,而最成熟的实验动物是小鼠,对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

生物芯片研究进展分子生物学论文

生物芯片研究进展 摘要 生物芯片是切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器是便携式生物化学分析器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。本文主要阐述了生物芯片技术种类和应用方面的近期研究进展。 关键词 生物芯片,疾病诊断,研究运用,基因表达 基因芯片的种类 基因芯片产生的基础则是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。根据基因芯片制造过程中主要技术的区别,下面主要介绍四类基因芯片。 一、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列 开发并掌握这一技术的是Affymetrix公司,Affymetrix采用了照相平板印刷技术技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片,生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度,能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。 原位合成法主要为光引导聚合技术(Light-directed synthesis),它不仅可用于寡聚核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术(photolithography)与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法,技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。 Affymetrix公司已有诊断用基因芯片成品上市,根据用途可以分为三大类,分别为基因表达芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片,基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于研究机构和生物制药公司,可以用来寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等许多领域,Affymetrix公司主要生产通用寡聚核苷酸芯片;疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断,包括各种遗传病和肿瘤等,目前Affymetrix公司生产

转基因技术的研究进展

作物转基因技术的研究进展 摘要:作为生物技术领域的前沿,转基因技术已在多种植物上取得重大进展。本文主要介绍了当前作物转基因技术的三大主流方法:农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法,并阐述了这几种转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆,甘薯等几种主要农作物的应用进展状况。 关键词:转基因技术、农作物、应用 Genetically Modified---转基因,简称GM,是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因,将其转入另一种生物中,使与另一种生物的基因进行重组,再从结果中进行数代的人工选育,从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。而其衍生出的转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中,从而达到改造生物的目的,即把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。 1983年比利时科学家Montagu 等人和美国Monsanto 公司Fraley等人分别将T- DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株———转基因烟草。自此之后,作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段. 国际农业生物技术应用服务组织2 月13 日在京发布的1 份报告显示,全球27 个国 家超过1800 万农民,2013 年种植转基因作物,种植面积比2012 年增加了500 万公顷。此外,首个具有耐旱性状的转基因玉米杂交品种亦于2013 年在美国开始商业化。 据该报告显示,全球转基因作物的种植面积于转基因作物商业化的18 年中增加了100 倍以上,从1996 年的170 万公顷增加到2013 年的1.75 亿公顷,其中美国仍是全球转基因作物的领先生产者,种植面积达7010 万公顷,占全球种植面积的40%。国际农业生物技术应用服务组织创始人兼荣誉主席、本年度报告作者Clive James 表示,目前排名前10 位的国家种植转基因作物的面积均超过100 万公顷,这为将来转基因作物的多样化持续发展打下了广泛基础。在种植转基因作物的国家中,有19 个为发展中国家,8 个为发达国家;发展中国家的种植面积连续2 年超越发达国家。 目前,作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.但在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术也相对较为成熟. 一、农杆菌介导法 农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时,受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激,活化质粒上Vir 区基因的表达,将质粒上的另一段DNA(T-DNA)共价整合到植物基因组上,在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响,如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件(pH、温度和光照条件)等[32],此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低[33],且基因沉默少,转移的基因片段长等优点。 农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法,迄今为止,农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%,已成为植物基因转化首选方法。 二、基因枪介导法 基因枪法又称微弹轰击法,是将外源基因包裹在直径1~2 nm的钨或金颗粒表面,加速轰击植物外植体靶组织,穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此,通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制,可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。 最早的基因枪是由美国Cornel 大学的Sanford 等在1987 年研制成功的。目前基因枪介

基因芯片技术基础知识(概念、制备、杂交、应用及发展方向)

生物科学正迅速地演变为一门信息科学。最明显的一个例子就是目前正在进行的HGP (human genome project),最终要搞清人类全部基因组的30亿左右碱基对的序列。除了人的遗传信息以外,还有其它生物尤其是模式生物(model organism)已经或正在被大规模测序,如大肠杆菌、啤酒酵母、秀丽隐杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计划。但单纯知晓生物基因组序列一级结构还远远不够,还必须了解其中基因是怎样组织起来的,每个基因的功能是什么,又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中展开其表达谱的,即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出(后基因组时代,蛋白组学)[1],涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具,最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳(2-D-gel)(及相应的质谱法测蛋白分子量)和生物芯片(Biochip)技术[2]。 一.什么是基因芯片 生物芯片,简单地说就是在一块指甲大小(1cm3)的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等,但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定)并与保护基建立共价连接;作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子,通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等)将生物分子探针(寡核苷酸片段或基因片段)以大规模阵列的形式排布,形成可与目的分子(如基因)相互作用,交行反应的固相表面,在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征,CCD相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号,作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中,最成功的是DNA芯片,即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵,与样品中同源核酸分子杂交[3]的芯片。 基因芯片的基本原理同芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization, SBH)。

基因芯片发展史

基因芯片的制备及应用摘要基因芯片技术是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量DNA探针片段有序地固化予支持物的表面然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交再对杂交信号进行检测分析就可得出该样品的遗传信息。基因芯片技术目前国内外都取得了较大的进展该技术可用于DNA测序基因表达及基因组图的研究基因诊断新基因的发现药物筛选给药个性化等等所以为二十一世纪生物医药铺平道路将为整个人类社会带来深刻广泛的变革促进人类早日进入生物信息时代。关键词基因芯片微阵列基因诊断药物筛选一、基因芯片的制备基本过程1 DNA方阵的构建选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物并作相应处理然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针或PCR技术扩增基因序列再纯化、定量分析由阵列复制器或阵列机及电脑控制的机器人准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。2 样品DNA或mRNA的准备。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统好于传统PCR 技术他们在靶DNA上设计一对双向引物将其排列在丙烯酰胺薄膜上这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法即大规模平行固相克隆这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆且不必分离和单独处理每个克隆使样品扩增更为有效快速。在PCR扩增过程中必须同时进行样品标记标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。3 分子杂交样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高若用于突变检测则杂交条件相反。芯片分子杂交的特点是探针固化样品荧光标记一次可以对大量生物样品进行检测分析杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式使分子杂交速度缩到1min甚至几秒钟。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸为探针效果更好。4 杂交图谱的检测和分析用激光激发芯片上的样品发射荧光严格配对的杂交分子其热力学稳定性较高荧光强不完全杂交的双键分子热力学稳定性低荧光信号弱不到前者的1/351/52不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜或落射荧光显微镜等检测到由计算机软件处理分析得到有关基因图谱。目前如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速有取代荧光法的趋势。二、基因芯片的应用 1 测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列准确率达99。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1 基因序列差异结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2到83.5之间示了二者在进化上的高度相似。2基因表达水平的检测用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列其中14个为完全序列31个为EST检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交经激光共聚焦显微扫描发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena 等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。 3 基因诊断从正常人的基因组中分离出DNA 与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可

分子生物学综述论文(基因敲除技术)

现代分子生物学 课程论文 题目基因敲除技术 班别生物技术10-2学号 10114040220 姓名陈嘉杰 成绩

基因敲除技术的研究进展 要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此后经历了近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家马里奥?卡佩奇(Mario Capecchi)和奥利弗?史密西斯(Oliver Smithies)、英国科学家马丁?埃文斯(Martin Evans)因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因敲除技术从此得到关注和肯定,并对医学生物学研究做出了重大贡献。本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组 前言 基因敲除又称基因打靶,该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改制,具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)以取代目的基因,再筛选出已靶向灭活的细胞,微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠,再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明,使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术,属完全性基因敲除,不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物,被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础,Cre在哪种组织细胞中表达,基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术,其同样以Cre/LoxP系统为基础,利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制,避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。2004年该实验室Cui等又报道了第四代基因工程技术,即可诱导的区域性蛋白质敲除技术,用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能,从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性,达到空前的时间精度,成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。 2.实现基因敲除的多种原理和方法: 2.1.1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初,胚胎干细胞(ES 细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年,Thompsson首次建立了

课程论文 转基因作物的研究进展

生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名: 学号: 专业/班级: 课程名称:生物工程原理 指导教师:教授 生物与环境工程学院 2011年5月

转基因作物的研究进展 摘要:人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程,对其基因问题的研究作了讨论,并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析,最后对此项技术作出展望。 关键词:转基因作物;DNA技术;基因导入;安全性 前言 转基因植物(transgenic plant),是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质,改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面,如可食用的大豆、玉米等,或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来,转基因作物同普通植物似乎没有任何区别,它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来,生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去,以便使它具有某种新的特性:抗除莠剂的特性,抗植物病毒的特性,抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体:细菌、病毒、昆虫等。这样,通过生物工程技术,人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性,这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年,全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年,首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年,美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、

基因工程技术的现状和前景发展

基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术,经过30多年来的进步与发展,已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言,生物学将成为21世纪最重要的学科,基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量,改善品质,增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展,植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中,在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状,通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力,已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面,也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战,耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长,从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来,导入植物体可获得转基因植物,目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高,人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明,利用基因工程可以有效地改善植物的品质,而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域,近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展,如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因,成功地导入到马铃薯中,培育出高蛋白马铃薯品种,其蛋白质含量接近大豆,**提高了营养价值,得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。 基因工程应用于医药方面 目前,以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一,发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上,基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子,在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前,应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试,并进入临床验证阶段;专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制,它可有目的地寻找并杀死肿瘤,将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂,最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒,修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中,是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面

转基因动物技术应用研究进展汇总

转基因动物技术应用研究进展 摘要:本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述,重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述,最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字:动物转基因技术;应用;展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,

生物芯片技术研究进展

生物芯片技术研究进展 张智梁 摘要:随着DNA测序技术的发展和几种同时监测大量基因表达的新技术出现,人类基因组DNA序列分析可能很快完成,并由此产生了生物信息学,而DNA芯片技术应运而生。生物芯片主要是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析,是近些年来发展迅速的一项高新技术。生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。 关键词:生物芯片;研究进展;应用 生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析,其实质就是在面积不大的基片(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)表面上有序地点阵排列一系列已知的识别分子,在一定条件下,使之与被测物质(样品)结合或反应,再以一定的方法(同位素法、化学荧光法、化学发光法、酶标法等)进行显示和分析,最后得出被测物质的化学分子结构等信息。因常用玻片/硅片等材料作为固相支持物,且制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。这项技术是由美国旧金山以南的的一个新兴生物公司首先发展起来的。S.P.AForder及其同事于90年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法,并在此基础上于l993年设计了一种寡核苷酸生物芯片,直至l996年制造出世界上第一块商业化的DNA芯片。在此期间国际上掀起了一片DNA芯片设计的热潮,出现了多种类型的DNA芯片技术。DNA芯片在产生的短短几年时间内技术不断,现已经显现出在基因诊断、基因表达分析和新基因的发现、蛋白组学方面的应用、基因组文库作图等生物医学领域中的应用价值。 l、生物芯片的分类 目前常见的生物芯片分为3类:第1类为微阵列芯片,包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片;第2类为微流控芯片(属于主动式芯片),包括各类样品制备芯片、聚合酶链反应(PCR)芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等;第3类为以生物芯片为基础的集成化分析系统(也叫“芯片实验室”,是生物芯片技术的最高境界)。“芯片实验室”可以完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作。这些微型集成化分析系统携带方便,可用于紧急场合、野外操作甚至放在航天器上。 2、生物芯片的应用 2.1基因测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列,这种测定方法快速,具有十分诱人的前景。芯片技术能辨别单核苷酸多态性(SNPs),当基因组序列中的单个核苷酸发生突变,就会引起基因组DNA序列变异。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCAl基因序列差异,结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性为83.5%~98.2%,提示了二者在进化上的高度相似性。Check 等通过运用DNA微集阵列分析研究与早期心血管疾病相关的候选基冈一丁SP基冈家族,结果发现TSP-1和TSP-4基因错义变异与早期冠状动脉疾病相关,它们在m液凝固和动脉修复中起重要作用,而丁SP一2基冈非编码区的突变却在心脏病的发生过程有一定的保护作用。在卵巢癌发展过程中,基因TP53起到临界

基因敲除技术的最新进展doc - 丁香园

基因敲除技术的最新进展  yunfenglin 干细胞与组织工程讨论版  【摘要】 自从上世纪80年代初的胚胎干细胞技术的成熟,在短短的20年里,关于基因敲除动物模型的报道呈几何数增长。现在的技术已经可以产生在时间和空间上都可以人为控制的,从点突变到染色体组大片段的删除和重排的各种基因突变小鼠,这样就可以让研究每个基因的具体功能成为可能。本文将首先简介基因敲除技术的技术背景、基本原理、基本步骤;然后将重点介绍现在基因敲除的常用策略及其利弊;接着将探讨基因打靶结果不理想的常见因素,包括基因背景、基因重复、基因补偿、和基因补充;最后介绍基因打靶技术的技术热点,包括组织特异性打靶、诱导性打靶。并探讨基因打靶技术在颌面外科的应用前景。 【关键词】基因敲除、条件性基因打靶、组织特异性基因打靶、诱导性基因打靶 技术背景 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的[1],是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(Embryonic Stem cell,ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cell mass,ICM)细胞[2],它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能,能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后,将它重新植回小鼠胚胎,它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时,结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能,这种重组称为同源重组。[3] 基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术[4]。它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠,它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段,具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立,而最成熟的实验动物是鼠,对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。2000年初的敲除了决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍,展示了基因敲除技术的美好前景。 基本步骤 利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为: a.ES细胞的获得:现在基因敲除一般应用于鼠,而最常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用,最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域,并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。[5,9,11] b.基因载体的构建:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因,TK基因等)的载体上,此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同,此载体有不同的设计方法,可分为替换性载体和插入型载体[6,7]。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上,这种情况下应设计的插入型载体要包括外源

基因工程的现状与发展趋势

题目:基因工程的现状与发展趋势专业:13食品科学与工程 学号:132701105 姓名:盛英奇 日期:2015/7/1

【摘要】从20世纪70 年代初发展起来的基因工程技术,经过40多年来的进步与发展,已成为生物技术的核心内容。生物学成为21世纪最重要的学科,基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 【关键词】基因工程技术;应用;前景;现状 一、墓因工程的原理及研究内容 基因工程是人们在揭示生命之谜的过程中建立起来的。早在300多年前,人们就发现,世界上生物尽管种类繁多,千姿百态,但都是细胞(如肉眼看不见的细菌等微生物)或者是由细胞构成的(如现存的200多万种多细胞动植物)。人们还发现,生物有遗传和变异的特征,遗传保证了生物种类的延续不断,变异则赋予生物种的进化,保证生物种类对环境的适应。而生物的所有特性及遗传变异都是由生物体细胞内的遗传物质所决定的,这种遗传物质就是被科学家称之为脱氧核糖核酸(简称DNA)的大分子物质,一般位于生物的细胞核内。DNA是由许多核昔酸连接而成的高分子化合物,如把DNA比喻成长链条,核昔酸就是组成这链条的一个个环节。生物细胞核内的DNA分子是由两条成对的多核昔酸长链互相缠人类开始学会干预生物的变异,即通过杂交、筛选等方式改变生物物种的某些特性,使之有利于人类,如水稻、小麦等作物的育种,家禽家畜优良品系的培育等,它是通过动植物父、母本交配繁殖时,生殖细胞内DNA上相应性状基因互相间可能出现的交换来实现的,这种交换的概率是人们不能控制的,所以选种的过程较为缓慢,需几年乃至几十年的时间,而且亲缘关系相差较远的生物种之间很难杂交。而本世纪}o年代初诞生的基因工程,则是按照人类的需要,从某种生物体的基因组中,分离出带有目的基因(即所需基因)的DNA片段,运用重组DNA技术,对这些DNA片段进行体外操作,把不同来源的基因按照设计的蓝图,重新构成新的基因组(即重组体),再将重组DNA分子插入到原先没有这类DNA 片段的受体细胞(亦称宿主细胞)的DNA上,并使其不仅能“安家落户”,而且能“传种接代”,即能准确地把该外源基因的遗传特性在新的细胞(宿主细胞)里增殖和表达出来。就像一台机器上的零部件拆下来安装到另一台机器上。在生物体中,这种生命零件就是基因。因为用的是工程技术的方法原理,故称基因工程,亦叫遗传工程。用这种方法所形成的杂种DNA分子与神话中的那种狮首、羊身、

基因芯片技术的应用和发展趋势

基因芯片技术的应用和发展趋势 随着基因芯片技术的日渐成熟, 在功能基因组、疾病基因组、系统生物学等领域中得到了广泛的应用, 已经发表了上万篇研究论文, 每年发表的论文呈现增长的趋势. 芯片制备技术极大地推进了生物芯片的发展, 从实验室手工或机械点制芯片到工业化原位合成制备, 从几百个点的芯片到几百万点的高密度芯片, 生物芯片从一项科学成为一项技术, 被越来越多的研究者广泛运用. 各个实验室不断产生海量的杂交数据, 相同领域的研究者需要比较不同实验平台产生的数据, 作为基于分子杂交原理的高通量技术, 芯片实验的标准化、可信度、重现性和芯片结果是否能作为定量数据等问题成为所有的芯片使用者关心的课题. 迈阿密原则和微阵列质量控制系列研究回答了这两个问题. 迈阿密原则(Minimum Information About a Micro- array Experiment, MIAME, 微阵列实验最小信息量)提出了生物芯片标准化的概念, 该原则的制定使世界各地实验室的芯片实验数据可以为所有的研究者共享. 同 时, 美国国家生物信息学中心(NCBI)和位于英国的欧洲生物信息学研究所(EBI)也建立了GEO ( https://www.360docs.net/doc/1214214470.html,/geo/)和ArryExpress (http:// ;https://www.360docs.net/doc/1214214470.html,/arrayexpress/)公共数据库, 接受和储存全球研究者根据迈阿密原则提交的生物芯片数据, 对某项研究感兴趣的研究人员可以下载到相关课题的芯片原始数据进行分析. 2006年美国FDA联合多个独立实验室进行了MAQC系列实验(micro array quality control, MAQC), 旨在研究目前所使用的芯片平台的质量控制. 该研究的12篇系列文章发表在2006年9月份的Nature Biotechnology 上, 用严格的实验分析了目前主流芯片平台数据质量, 芯片数据和定量PCR结果之间的相关性, 芯片数据均一化方法, 不同芯片平台之间的可重现性. 证明了不同芯片平台产生的数据具有可比性和可重现性, 各种芯片平台之间的系统误差远远小于人为操作和生物学样品之间本身的差异, 肯定了芯片数据的可信性, 打消了以往对芯片数据的种种猜疑, 明确了基于杂交原理的芯片同样可以作为一种定量的手段. 推动了生物芯片技术在分子生物学领域更广泛的应用. 生物信息学和统计学是在处理基因芯片产生的海量数据中必不可少的工具. 随着芯片应用的推进, 芯片数据分析的新理论和新算法不断地被开发出来, 这些方法帮助生物学家从海量的数据里面快速筛选出差异表达的基因. 一次芯片实验获得的是成千上万个基因的表达信息, 任何一种单一的分析方法都很难将所有蕴含在数据中的生物学信息全部提取出来, 从近年来生物信息学研究的趋势来看, 目前研究的重点开始转向芯片数据储存、管理、共享和深度信息挖掘, 旨在从芯片数据中获得更多的生物学解释, 而不再停留在单纯的差异表达基因筛选上。 目前基因芯片的制备向两个主要方向发展. 第一, 高密度化, 具体表现为芯片密度的增加, 目前原位合成的芯片密度已经达到了每平方厘米上千万个探针. 一张芯片上足以分析一个物种的基因组信息. 第二, 微量化, 芯片检测样品的微量化, 目前芯片检测下限已经能达到纳克级总RNA水平, 这为干细胞研究中特别是IPS干细胞对单个细胞的表达谱研究提供了可能. 另一方面, 微量化也体现芯片矩阵面积的微量化, 即在同一个芯片载体上平行的进行多个矩阵的杂交, 大大减少系统和批次可能带来的差异, 同时削减实验费用. 微阵列技术改变了生物学研究的方法, 使得微量样品快速高通量的分析成为可能, 从单个基因的研究迅速扩展到全基因组的系统生物学研究. 微阵列技术帮助生物学研究进入后基因组时代, 研究成果层出不穷。 2001年国家人类基因组南方研究中心韩泽广博士研究小组利用cDNA芯片对肝癌和正常组织中的12393个基因和EST序列进行了表达谱筛查, 其中发现了2253个基因和EST在肝癌中发生了差异表达, 并对这些差异基因的信号通路进行了分析, 发现WNT信号通路在肝癌的发生中出现了表达异常. 2002年中国科学院神经科学研究所张旭博士研究组利用表达谱芯片对大鼠外周神经损伤模型背根神经节的基因表达进行了研

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