抗结核药物的研究进展和发展趋势

综　述

文章编号:100128689(2005)0420250204

抗结核药物的研究进展和发展趋势

Trends and advances i n an tituberculosis agen ts

陆宇　段连山

L u Yu and D uan L ian 2shan

(北京市结核病胸部肿瘤研究所,　北京101149)

(Beijing T uberculo sis and T ho racic T umo r R esearch Institute ,　Beijing 101149)

摘要:　结核病是除A I D S 外引起死亡最高的感染性疾病,严峻的结核病回升形势要求加速新型抗结核药物的研究开发。缩短疗程,提高M DR 2TB 疗效及对结核潜伏感染(L TB I )提供更有效的治疗是开发新抗结核药物要实现的目标。口恶唑烷酮类、硝基咪唑并吡喃类等药物是近年发现的新药,利用功能基因组学,蛋白质组学等加速药物筛选、有效传递药物至靶位的药物载体、联合抗结核药物的免疫辅助治疗剂等也是抗结核病药物的发展趋势。

关键词:　结核;　抗结核药物;　药物筛选;　载体中图分类号:R 978.3 文献标识码:A

收稿日期:2004207227

作者简介:陆宇,女,生于1971年,博士,助理研究员。主要从事抗结核药物药理学研究。

结核病是除A I D S 外引起死亡最高的感染性疾

病,是严重的全球性健康问题。抗结核药物是结核病化学治疗的基础,结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。结核病化疗的出现使结核病的控制有了划时代的改变,以异烟肼、利福平、吡嗪酰胺为核心的短程化疗曾取得令人瞩目的成就。人类迈入新世纪的今天,现有的抗结核治疗方案还远远不够理想,严峻的结核病回升形势要求加速新型抗结核药物的研究开发。目前,结核病治疗的两大难题在于结核分枝杆菌的持留性和耐药性,人们对结核分枝杆菌本质认识的逐步深入及新兴技术的发展,为抗结核药物的研究提供条件。现将抗结核药物的研究和发展情况介绍如下。1　开发新抗结核药物要实现的目标[1]1.1　缩短疗程

结核病是结核分枝杆菌引起的感染性疾病,在感染性疾病中结核病的治疗的一大特点是疗程过长。标准短程化疗的前2个月的强化期使患者的菌负荷量大大降低,转为非传染状态,4～6个月的巩固期主要是消除持留状态的细菌以减少复发的危险,至少6～8个月的疗程使患者的依从性难以保证,进而易导致耐药性的发生。在现有抗结核药物基础上进行超短化研究难以达到满意的治愈率和复发率。如果高效的抗菌剂和 或灭菌剂能将疗程缩短到2个月或更短,将大大有利于提高患者的依从性,当然,一种能缩短总疗程并减

少服药次数,服药数量的化合物将是最好的选择。1.2　提高多耐药结核病(M DR 2TB )的疗效

M DR 2TB 的发生率在全球呈上升趋势,M DR 2TB

患者的治疗药物选择受到极大的关注。但是,抗结核新药开发跟不上M DR 2TB 发生速度。目前M DR 2TB 患者的治疗只能应用异烟肼、利福平以外的价格昂贵、不良反应多的二线药物。改进M DR 2TB 的治疗急需新的药物。

1.3　对结核潜伏感染(L TB I )提供更有效的治疗

估计全世界约有20亿的人口感染结核菌,1000～2000万人在一生中发展成活动性结核病。在北美及一些L TB I 发生率低的地区,异烟肼是预防L TB I 的药物,异烟肼也是W HO 推荐的结核病和H I V 双重感染人群的有效药物,但却存在严重的限制性,L TB I 的治疗有待开发新的药物,以利显著降低结核病的发病率。2　抗结核药物开发的困难

在过去的20年,有1200种新药批准上市,但在发展中国家发现用于抗感染的不足1%,至于结核病,在制药工业中的积极性更是与需要不成比例[2]。在美国、欧洲和日本的实验室,对抗结核新药的研究,已从过去的基本静止状态发展到一个活力相当大的时期,但是自利福平问世至今的30年没有一个新型化合物用于抗结核治疗。除缺少商业利益外,开发有活性的新化合物并发展为临床有希望的抗结核药物还有困难。

结核分枝杆菌复杂的病理生理学使其能在机体以休眠状态存在很长时间甚至很多年,造成治疗困难。目前由于对结核分枝杆菌这种状态的代谢机理的认识还不全面,造成对持留菌可能有抗菌活性的化合物在利用目前的药物筛选方法未能予以发现。

结核分枝杆菌基因组测序工作的完成,为新的药物作用靶点设计及缩短疗程的方法提供大量的资源,然而利用DNA序列信息并转化为最佳药物开发方法正在发展之中。

抗结核药物的临床开发过程漫长,一个新药从发现到临床应用,大概需要10年的时间,花费5～10亿美元,有效的临床试验为时长而且复杂。因而在过去的30年间治疗结核病的新药注册的很少,现有的规定条例又不明确或标准化,一个新药至少要安全、有效,以及药品质量的可控性。对于结核病来说,就意味着一个新治疗化合物要在多药治疗方案中与标准的6个月的短程方案做对照,一般临床试验要在治疗结束后的2年中观察复发率。所以也急需一种考核疗效的标记物,以缩短临床试验的周期。

3　抗结核新药研究开发的状况及趋势

尽管存在困难,近年来抗结核药物的研究开发获得进一步的发展,发现了一些有苗头的新化合物,开发的前景也很广阔[3]。

3.1　近年研究和开发的抗结核药物

3.1.1　利福霉素类　利福喷丁于1998年在美国获得批准用于治疗结核病。利福布丁获准用于H I V合并结核病不能应用利福平的患者。苯并口恶嗪利福霉素(rifalazil,KRM21648,RL Z)比利福平具有更强的杀菌作用,对结核分枝杆菌的M I C比利福平强64倍,而半衰期长达60h,在小鼠结核病治疗实验中RL Z加吡嗪酰胺的联合灭菌效果可与异烟肼与利福平的联合治疗效果相比拟,而在停药后复发率更低。现进入 期临床研究。但利福霉素类药物存在交叉耐药性,且有动物实验结果表明它们均对M DR2TB无效。

3.1.2　氟喹诺酮类(FQ s)　研究发现本类中第三代、第四代氟喹诺酮类药物中有不少具有较强的抗结核分枝杆菌活性,对非结核分枝杆菌亦有作用,目前环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等成为治疗M DR2TB的主要选择药物。莫西沙星(m ox ifloxacin)(M I C0125Λg m l)[4]、加替沙星(gatifloxacin)(0125Λg m l)[5]和加仑诺沙星(garenoxacin)等第四代FQ s显示更强的抗结核活性,具有一定的开发潜力。

3.1.3　新大环内酯类药物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素)　这类药物是红霉素的衍生物,抗分枝杆菌的作用机制是菌体内核糖体的SO S亚基可逆性结合,干扰蛋白质的合成。其中罗红霉素抗结核分枝杆菌作用最强。与利福平和异烟肼有协同作用。此类药物有良好的药动学特征,口服易吸收,组织穿透性好,组织细胞内浓度高于血药浓度,并有中等长的半衰期,新大环内酯类药物主要用于非结核分枝杆菌感染和耐多药结核病的治疗。

3.1.4　口恶唑烷酮类　本类属于新型的合成抗菌剂,具有广谱的抗分枝杆菌作用,作用机制是通过与50S 核糖体亚单位相结合抑制细菌蛋白质的合成,目前正从中开发抗革兰阳性耐药菌和抗分枝杆菌的新药。其中PNU2100480在治疗小鼠结核感染中证实其疗效,剂量100m g kg时与异烟肼25m g kg的效果相当,此外在合并的实验中发现其作用与异烟肼和 或利福平在不同实验中的活性[6]。另一药利奈唑酮(L inezo lid)在小鼠实验治疗中比PNU2100480和异烟肼稍差,已试用于耐药结核病的治疗并取得明显的疗效[7],但因有血液学毒性等及价格昂贵等问题而受限。

3.1.5　硝基咪唑并吡喃类　源于20世纪70年代印度研究者的发现。CG I217341对耐药结核分枝杆菌的M I C为011～013Λg m l,体外抗结核活性近于异烟肼、利福平,动物实验结果亦然,与其他抗结核药物无交叉耐药,是有希望的抗结核药,正处于 期临床研究阶段。本类中筛选出硝基咪唑并吡喃有效化合物PA2 824对敏感结核分枝杆菌和单耐利福平结核分之杆菌的M I C是01015～0125Λg m l,多耐药结核分枝杆菌对PA2824同样敏感,与现有的抗结核药物无交叉耐药性[8]。体外实验发现PA2824在低氧环境下培养的非复制期结核分枝杆菌模型中有作用,其活性类似于甲硝唑,明显强于CG I217341和异烟肼(异烟肼对此模型中的结核分枝杆菌无作用)。应用结核分枝杆菌报告荧光素酶表达的菌株的短期小鼠感染模型对50种以上的NA P s化合物的体内活性测定时发现,虽然PA2824的体外抗结核活性不是最强的,但在口服25m g kg剂量下具有最强的体内活性,说明PA2824具有较NA P s中其他化合物良好的药动学特征。急性动物毒性实验LD50是1000m g kg,500m g kg连续口服28d,未出现明显不良反应。PA2824对多耐药结核分枝杆菌、非复制持留性结核分枝杆菌均具有抗菌活性,说明NA P s可能具有新的作用机制[9]。

本类中筛选出的有效化合物为PA2824,它对药物敏感的结核分枝杆菌及耐利福平的结核分枝杆菌的M I C为01015～0125m g m l,对耐多药结核分枝杆菌也敏感。它对缺氧条件下培养的结核分枝杆菌有杀菌

活性。治疗豚鼠气雾感染结核时,40m g kg每日一次连用30d时,其疗效与异烟肼治疗相当。硝基咪唑并吡喃类已证明对持留状态和休眠状态的结核分枝杆菌有效,这类化合物的出现对改善非复制菌群的作用带来极大的希望,提示有可能成为缩短疗程的有效药物。

3.1.6　吩噻嗪类　氯法齐明(氯苯吩嗪,clofazi m ine, CFM)是一种用于麻风病的药物,近年来开始试用于耐药结核病的治疗。CFM是一种吩嗪染料,通过与分枝杆菌的DNA结合抑制转录而产生抑制分枝杆菌生长的效果。硫利达嗪(th i o ridazine)[10]是抗精神病药,服药后耐受性较好,氯丙嗪对敏感菌及耐药菌均有效在体外减慢结核分枝杆菌的生长。此类药物对人体结核病的治疗作用尚有待进一步研究。

3.1.7　脂肪酸和分枝菌酸合成的抑制剂　是抗结核药物开发的一个新领域。硫内酯霉素(th i o lactom ycin, TLM)在试管内小鼠巨噬细胞模型中显示,TLM有杀灭细胞内结核分枝杆菌作用并呈剂量依赖性。辛磺酰基乙酰胺(N2octanesu lfonylacetam ide,O SA)对耐异烟肼和多耐药结核分枝杆菌的M I C分别为6125和1215Λg m l。

3.1.8　硫乙酰霉素[11]　Glaxo2Sm ithk line公司抗结核药项目执行董事D uncan博士称,公司正与美国国立卫生研究所(N I H)合作开发一种天然抗结核药物——硫乙酰霉素,这种低分子量化合物在体内和体外均具有抗结核能力,对耐药结核分枝杆菌亦有作用,该研制始于2001年,进入临床应用可能尚需数年。

3.2　利用功能基因组学、蛋白质组学等加速药物筛选

1998年结核分枝杆菌H37R v基因组全序列的破译[12],标志着对结核分枝杆菌的研究进入了后基因组时代。新药开发的关键是发现新型先导化合物,目前多数药物开发流程是从药物作用靶点开始的,即基因组→新作用靶点→筛选→先导物→药物。利用分子水平和细胞水平的筛选模型,采用高通量药物筛选技术,尤其是芯片技术已逐渐成为新药开发的主要技术。

药物作用靶点是指具有重要生理或病理功能,能够与药物相结合并产生药理作用的生物大分子及其特点的结构位点。以结核分枝杆菌基因组独特的基因作为靶点,可减少交叉耐药的发生。利用功能基因组技术可以发现统计上具有显著性,重现性高的差异表达,从而研究药物作用的选择性并开发出选择性抑菌药。通过获得的大量基因和蛋白质数据进行分析和计算,发现新的功能基因或蛋白质结构,为新药研究提供信息。

现有不少抗结核药物(如I N H、E M B和PZ A)其作用机制涉及结核分枝杆菌的细胞壁生物合成过程,干扰细胞壁的某些组分如分枝菌酸、阿拉伯半乳聚糖、肽多糖和分枝菌素等可能代表新药的特异靶点,破坏这些分枝杆菌组分生物合成,期望获得特异源性发挥治疗作用,而对正常菌群无作用。

近年研究证实结核分枝杆菌在巨噬细胞中处于休眠状态的长期持留,需改变其代谢途径,异柠檬酸酶对其起关键作用。因此抑制异柠檬酸酶可能是消灭持留态结核分枝杆菌的特别有效途径。此酶的基因已被克隆和表达,为新药的开发提供了依据。此外,对分枝杆菌毒力基因认识的逐渐增加,可以加快对基因编码的新的药物靶点的识别。利用分枝杆菌基因组的信息,应用定量的构效关系开发新药在不久的将来成为可能。目前正在研究中的有:抑制结核分枝杆菌TD P2鼠李糖合成的药物[13],针对编码某些代谢酶及在逃避宿主巨噬细胞中起作用的毒力基因的反义DNA。有希望的药物设计靶点:icl基因、p caA基因、m m aA4基因、M m pL家族蛋白等。

3.3　有效传递药物至靶位的药物载体

抗结核药物的研究除直接开发新药外,也包括药物载体的研究。利用脂质体或单克隆抗体作载体,使药物选择性作用于靶位,增加病灶或细胞内药物浓度,可以提高疗效。药效学显示链霉素、卡那霉素、阿米卡星和利福平脂质体抗菌活性显著高于游离药物,氧氟沙星和克拉霉素脂质体抗菌作用也明显提高[14]。含铁血黄素巨噬细胞作为传递药物至巨噬细胞的穿梭载体;微球技术通过单一发射不引起任何毒性将胶囊药物按所需的剂量传递以延长作用时间[15],而且还能传递到宿主细胞;气雾化制剂传递药物以减少药物的副作用;均具有一定的开发潜力。

3.4　联合抗结核药物的免疫辅助治疗剂

免疫辅助治疗在结核病的治疗中有很重要的作用。已经在辅助的临床实验中证实I L22、G M2CSF一定程度上对结核及M A C感染的患者有效,但是,免疫增强细胞因子如IFN2Χ、I L212因为在辅助治疗过程中可能诱导免疫抑制细胞因子的产生,这在某种程度上是严重的副作用,不太可能成为分枝杆菌感染的治疗药物。所以,需要开发不同于细胞因子的免疫调节制剂。如A T P及其类似物通过嘌呤类的P2X7受体增强巨噬细胞的抗菌活性;吡啶甲酸(p ico lin ic acid),增强巨噬细胞的活性。此外还可以从机体免役环节和途径入手研制药物:研制防止液化药物使用预防液化的治疗方法有利于治疗结核病和防止空洞的形成;从阻断和避免抑制性环路的激活,可能是开拓新的免疫制剂的途径之一;T h1细胞免疫低下,是结核病免疫学的特

征,也是结核病慢性化的主要原因之一,研制调节T h 淋巴细胞歧化方向,维持T h 1 T h 2反应平衡的药物,可能对治疗有益。4　结语

根本改善抗结核治疗迫切需要新的抗结核药物,全球抗结核药联合会希望到2010年至少能注册一种新开发的抗结核药,并且到2012年能提供给高发区使用,为达到这一目标,2005年以前必须有5种新的抗结核药完成临床前试验。开发一种新的抗结核药物既需要财力和时间,还要评估在体外、体内和临床的效果,并非易事,可谓任重而道远。但抗结核药物的发展前景比几十年前大大开阔,我们或许能从中得到点启示,致力于其中,在众多研究者的不断积极探索中,会有新的发现,以最终达到控制结核病的目的。

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(上接第197页)3　结论

(1)高品质林可霉素的生产可以通过改造现有生

产工艺完成,改造后的生产工艺为

:

(2)在恒温、四级逆流萃取条件下,稀盐酸浓度0107%,稀盐酸与洗前1体积比为2∶1时,B 组分含量可降到1%以下。

(3)洗前的酸水返回到溶剂萃取工段回收酸水中

的有效成分,提高产品收率。

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