植物中蔗糖酶的研究进展

植物中蔗糖酶的研究进展

司丽珍①　储成才②

(中国科学院遗传与发育生物学研究所　北京100101)

摘　要　在大多数高等植物中,蔗糖是碳水同化产物由源向库运输的主要形式。在库中,蔗糖酶可以把蔗糖水解为葡萄糖和果糖,以满足植物生长发育中对碳源和能源的需求。本文综述了近年来有关蔗糖酶的一些研究进展,包括蔗糖酶的分类、基本性质、基因结构、酶活性的调节以及功能等。

关键词　植物,蔗糖酶,活性调节,功能

0　引言

植物在叶片中(源组织)通过光合作用将C O2固定成碳水化合物,然后运向非光合组织(库组织)。植物大多以非还原性二糖如蔗糖的形式完成碳水同化产物由源到库的运输。在库组织中,蔗糖被分解为己糖,为植物生长发育提供碳源和能源。蔗糖分解主要由蔗糖合成酶(EC2.4.1.13)或蔗糖酶(E C3.

2.1.26)来完成。蔗糖合成酶是一糖基转移酶,在尿苷二磷酸(UDP)存在下把蔗糖转化为尿苷二磷酸葡萄糖和果糖。蔗糖酶是一水解酶,把蔗糖水解为葡萄糖和果糖。蔗糖酶有多种同工酶,分别处于不同的亚细胞位置,生化特性也不尽相同[1,2]。虽然对它们的功能特异性还不太清楚,但已确知蔗糖酶在植物中主要参与对蔗糖不同利用途径的调节。由于糖在植物中不仅是作为能源,而且也是基因表达的重要调节物质之一,因此蔗糖酶也间接参与细胞分化和植物发育的调控。鉴于此,蔗糖酶的研究无论在理论上还是在实际上都具有重要意义而备受重视。本文就近年来有关研究进展做一介绍。

1　蔗糖酶的分类

根据植物中蔗糖酶所处亚

细胞位置,蔗糖酶可分为液胞型

蔗糖酶、细胞质型蔗糖酶和细胞

壁型蔗糖酶。前两者又统称为胞

内蔗糖酶,细胞壁型蔗糖酶又被称为胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶进行反应所需的最适pH值也有所不同,由此蔗糖酶又可分为酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和细胞壁型蔗糖酶在pH4.5至5.0时催化效率最高,因此也称为酸性蔗糖酶。细胞质型蔗糖酶水解蔗糖的最适pH值为中性或略微偏碱性,因此称为中性/碱性蔗糖酶。而根据其溶解性,蔗糖酶又可分为可溶性蔗糖酶(包括液胞型蔗糖酶和细胞质型蔗糖酶)与非溶性蔗糖酶(细胞壁型蔗糖酶)。

2　蔗糖酶基本性质

大多数植物含有至少2种液胞型蔗糖酶,它们均以可溶性蛋白的形式存在。而细胞壁型蔗糖酶则以离子键的形式与细胞壁结合,并有多种同工酶存在。液胞型和细胞壁型蔗糖酶在pH4.5至5.0时效率最高,且从果糖残基攻击蔗糖,因而这类酸性蔗糖酶被称作β-呋喃果糖苷酶,也正因为如此,酸性蔗糖酶也可催化其他含有β-果糖的多糖,例如水苏糖、棉子糖的水解。目前已从多种植物中分离出酸性蔗糖酶,成熟多肽的分子量大多在55～70kD之间。在菜豆中,变性SDS凝胶电泳证明一70kD的液胞型蔗糖酶可以被水解成30kD的N-端和38kD的C-端两个片段。它们在蔗糖浓度很低时有一Km值,酶活性被重金属离子如Hg2+,Ag2+抑制,表明催化中心有巯基存在。酸性蔗糖酶也被其反应产物抑制,葡萄糖是非竞争性抑制剂,而果糖是竞争性抑制剂[3]。

另外,植物中至少含有两种细胞质型蔗糖酶,它们水解蔗糖的最适pH为中性或偏碱性。中性或偏

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①

②联系人。

(收稿日期:2002-03-29)

女,1974年生,博士生;研究方向:分子遗传学

碱性蔗糖酶的特性还不太清楚,但与酸性蔗糖酶相比,这些酶是蔗糖专一性的。碱性蔗糖酶大多以同源四单体的形式存在,分子量大约在54～65kD,其Km(蔗糖)一般为10mmol/L,酶活性受反应产物葡萄糖、果糖的抑制,但不被重金属离子抑制[4]。由于中性蔗糖酶分离比较困难,对它们的研究很少。

3　蔗糖酶的基因结构

酸性蔗糖酶已从番茄[5]、拟南芥[2]、玉米[6]、胡萝卜中[7]被克隆,其基因结构基本相同,含有6～8个外显子[2]。除胡萝卜的细胞壁型蔗糖酶外[7],所有基因都包含一个极小的外显子,仅仅编码一个保守元件NDPNG中心的三肽(DPN)。在马铃薯中,这一最小的外显子具有特殊的交互剪切特性[8]。正常表达蔗糖酶基因时,没有发现转录后加工的错误,然而在冷胁迫时,RNA这一剪切加工过程被打乱,转录产物的外显子缺失。目前,还不清楚这一剪切异常是否具有生理生化作用。对酸性蔗糖酶的氨基酸序列分析表明,N-端有一信号肽(signal peptide)和前肽(propeptide)。对前肽的功能还不太清楚,推测可能与蛋白质折叠、蛋白质定位[9]、或者对酶的活性控制有关[10]。

对于中性/碱性蔗糖酶的研究较少,从胡萝卜中克隆的中性蔗糖酶的N-端无信号肽,富含半胱氨酸,且与酸性蔗糖酶的同源性很低[11]。

4　蔗糖酶的调控

由于中性/碱性蔗糖酶在提取的过程中,酶活性很容易丧失,因此对它们的研究比较少。而对酸性蔗糖酶的调控已有相当丰富的信息。

在拟南芥中,酸性蔗糖酶至少由四个基因At be-ta fruc1,A t beta fruc2,At beta fruc3,At beta fruc4编码,包括细胞壁型蔗糖酶基因和液胞型蔗糖酶基因[1],对其表达模式的分析表明,其表达均呈器官或发育特异性[12]。对于细胞壁型At beta fr uc1基因,在成熟的叶片中表达活性很高,在子叶中、花器官中没有表达。At beta fr uc2基因则是花器官特异性表达。液胞型A t beta fruc3的表达模式与前两个细胞壁型蔗糖酶的完全不同,Northern和RT-PCR的结果表明在子叶中的表达较高,但在成熟叶片、根以及花器官中的表达均很低。At beta fr uc4在幼嫩的叶片中有表达,在成熟叶片中却没有表达。对马铃薯的胞外蔗糖酶的分析表明,它们的表达也是器官特异性的, Lin6是库组织特异性表达,而Lin5和Lin7分别为雄蕊、雌蕊特异性表达,表明这两个基因与花器官中碳水同化产物的供应有关[13]。在番茄中,也已分离出1个液胞型蔗糖酶和4个细胞壁型蔗糖酶基因,它们的表达也呈器官特异性[14]。这表明,植物中酸性蔗糖酶有一小的基因家族所编码,这些基因在植物发育过程中的特定时间、空间独立地表达。

除了器官和发育特异性表达外,糖的组成和浓度也能显著地影响这些酸性蔗糖酶的表达[15]。不同植物以及同一植物中的不同的蔗糖酶对糖有不同的反应。目前,已鉴定出了两类反应不同的基因,第一类随着碳水化合物的增加,其表达增加,另一类,糖对其有负调控作用,减少蔗糖的含量,其表达增加,且对葡萄糖、蔗糖及其他的代谢糖的反应类似。有趣的是,在美洲土荆芥的细胞中,可溶性酸性蔗糖酶基因的表达不受糖的影响,而细胞壁型蔗糖酶基因的表达随糖含量的增加而升高[16]。在胡萝卜中,糖对酸性蔗糖酶也没有影响。对于在不同植物中不同的酸性蔗糖酶基因对蔗糖反应不同的原因还不太清楚,一种可能是在植物,例如胡萝卜中,植物本身贮存了很多的糖分,因而糖含量作为酸性蔗糖酶的调节剂就不太有利,糖对其的调控功能可能没有发育或在进化中丢失。在这些植物中,短暂的生理改变仅仅导致糖含量的微小变化,这些变化不足以有效地调控蔗糖酶基因的表达。

在许多植物中,生长素[17]、赤霉素[18]、或者细胞分裂素[19]等植物生长调节剂也能增加酸性蔗糖酶的活性,具体是由于植物激素对蔗糖酶表达的直接调控,还是由激素导致细胞的增生产生了新的库组织,仍不太清楚。在美洲土荆芥的组培细胞中,由于细胞分裂素的影响,细胞壁型蔗糖酶的mR NA与葡萄糖载体的转录同时增加[19],这很可能是由于激素刺激细胞增生,造成所需碳源供应的增加。

伤害对酸性蔗糖酶基因的表达也有调控作用。例如,可溶性酸性蔗糖酶的活性在成熟马铃薯块茎的切片中有显著增加[20],在18小时迅速达到最高峰,随后下降。当胡萝卜的根冠受到机械损伤时,其细胞壁蔗糖酶的表达也发生改变[21],mR NA在受伤后12小时达到最高值,同时伴随有酶活性的提高。伤害对其表达的影响不是系统性的,活性的改变仅限于伤害部位。

酸性蔗糖酶活性的增加与感染不同病害之间的关系也有许多报道[21]。在胡萝卜根冠中,与病毒接

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触1小时后蔗糖酶转录水平达到最高,然后迅速下降。与伤害对其表达的影响一样,病害浸染对其表达的影响也不是系统性的,活性的改变仅限于浸染部位。

5　蔗糖酶的功能

5.1　对植物生长的调控

与蔗糖在植物中有很多重要功能(营养、渗透调节、信号分子)相联系,蔗糖酶同样也具有很多功能。多数情况下,蔗糖酶把蔗糖水解为己糖,提供给呼吸消耗,或者作为碳源及能源合成许多其他化合物。蔗糖酶可以在韧皮部参与蔗糖的长距离运输[22]。另外,蔗糖酶把蔗糖分解为葡萄糖和果糖可以大大地增加细胞渗透压,表明蔗糖可能在细胞伸长和植物生长中起作用[23]。

在多数研究中,蔗糖酶的功能是通过测量生理过程中蔗糖酶活性来推测的。例如在迅速生长的胡萝卜根或豆类茎中,蔗糖酶活性很高,同时这些组织中蔗糖含量很低或者可以迅速地下降,因此酸性蔗糖酶在这些组织中的功能即为水解蔗糖以满足植物对还原糖的高度需求[4]。在豌豆的子叶中表达酵母蔗糖酶导致蔗糖含量降低,己糖积累。转基因植物的细胞中含有大的液泡,而且能维持很长时间,然而在野生型中,大的液泡往往被小的蛋白体取代。在植物日趋成熟或脱水时,转基因植物出现质壁分离现象,同时在内膜系统形成囊泡[24]。植物组织的生长不仅仅需要己糖作为碳源和能源,同时细胞伸长也需要一个推动力,即细胞的渗透压在平时相对稳定,但在细胞壁伸长时升高。可溶性酸性蔗糖酶在渗透调节中起作用的一个间接证据是通过分析在引力效应中叶枕上半部与下半部的反应获得的[23]。在下半部分,蔗糖酶活性增加了3倍,这证明植物生长的一个潜在动力是渗透压梯度。

在正在发育的向日葵下胚轴中,发现细胞伸长速率与酸性蔗糖酶活性之间存在很强的正相关[4]。Woodson和Wang(1987)的研究表明,在正在开放的麝香石竹花中,可溶性酸性蔗糖酶的活性提高和还原糖水平的提高是调节麝香石竹花瓣生长的一个很重要因子,这些还原性糖主要来源于蔗糖的输入和随后的水解[25]。

在甘蔗中,液胞型酸性蔗糖酶的活性在未成熟的、生长旺盛的茎组织中活性很高,随着茎成熟度的增加,其活性也随之下降[26,27]。液胞型酸性蔗糖酶的这种变化不仅表明在细胞的伸长过程中需要把蔗糖转化为单糖,同时也表明在细胞的增殖过程中也需要有蔗糖作为代谢底物。由此可见,液胞型酸性蔗糖酶在植物的生长过程中通过对蔗糖的调控而发挥重要作用。

蔗糖酶对逆境条件下维持细胞的正常功能也起一定的作用。例如,非季节性的降雨,或高温,延迟收获等都可导致蔗糖的重新转移,以适应外界的变化[28]。在转基因烟草中,酵母蔗糖酶的表达提高了植物的抗盐性,在盐胁迫的情况下植物的光合作用没有改变,而野生型在同样条件下光合作用被抑制。进一步分析证明转基因植物的渗透压与对照相比有显著提高,这表明蔗糖酶可以通过对植物渗透压的调节来提高植物的抗盐性[29]。

与细胞内蔗糖酶一样,细胞外蔗糖酶在调节同化物的分配及抗逆境等方面,同样也起重要作用[30]。细胞外蔗糖酶在信号传导中所起的作用将有助于阐明其在源—库调节中承担的角色。在转基因胡萝卜中,细胞外蔗糖酶和液胞型酸性蔗糖酶在植物的生长和发育中都起重要作用[31],且细胞外蔗糖酶在植物的早期发育中尤其需要。

5.2　对源-库关系的调控

酸性蔗糖酶在调控源—库关系方面所起的调控作用已通过分子操纵技术在模式植物,如烟草、拟南芥、马铃薯、番茄中得到证实。通过在亚细胞的不同部位过量表达酵母的蔗糖酶,证明其在光合同化物的长距离运输中起重要作用[32,33]。酵母的蔗糖酶无论在烟草的液胞还是在细胞质中定点表达,转基因植株都表现出生长不正常,碳水化合物在源叶片中积累,根系形成延迟,且出现严重矮化现象,在叶片中积累淀粉和可溶性糖,这表明转基因植株的糖运输平衡被打乱。在细胞质中表达蔗糖酶时,源叶片和库叶片中的淀粉和可溶性糖都有积累,叶片出现卷曲现象,这说明在叶片顶部细胞分裂和细胞生长都相对较快[33]。在马铃薯的源叶片中,过量表达酵母的蔗糖酶,转基因植株表现为叶片皱缩,生长受阻且块茎数减少。而在细胞水平上,表现为源叶片中的己糖、淀粉、氨基酸含量增加,尤其是脯氨酸,其含量是野生型的40倍,转基因植株的光合速率降低,渗透压提高,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的蛋白含量没有变化,但处于活化态的比例和催化效率降低[34]。在转基因烟草、拟南芥和番茄中也观察到同样的表现型,尽管受抑制的程度在不同植物中存在差异[2]。然而,在马铃薯块茎的细胞质中特

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异性表达酵母的蔗糖酶导致块茎变小,产量降低,但块茎数目增加。如果在块茎细胞间定位表达此基因,结果则正好相反,即块茎变大,数目减少,但产量增加。通过反义技术,在番茄中降低胞内酸性蔗糖酶的表达,尽管植株的生长没表现出异常,但果实变小[35]。以上结果表明库的大小是可以通过改变蔗糖的代谢来调节的[36,37]。

酵母蔗糖酶基因在Ubiquitin启动子调控下被导入甘蔗愈伤组织中[38],在这些细胞的液胞和细胞质中,蔗糖酶的活性提高,但蔗糖的积累减少。通过反义表达,在转基因番茄中降低酸性蔗糖酶的活性,可以改变蔗糖与己糖的比例[35,39]。尽管转基因植株与野生型在表现型上没有差异,但果实比对照减少了30%,这表明此基因在库的发育中起重要作用。

5.3　对蔗糖在库中分配的调控

一个比较有争议的问题是蔗糖酶在库器官如种子、块茎、根系中是否参与蔗糖的代谢。在赖马豆种子和马铃薯块茎的发育中,蔗糖合酶(Sucrose syn-thase)是蔗糖降解的主要酶,蔗糖通过蔗糖酶降解的量是很低的[40]。这一结论也与对小麦胚乳发育的研究结果一致[41]。蔗糖合酶的活性在胚乳的整个发育过程中都比蔗糖酶活性高。Weber等(1995)[42]在对种子发育过程中光合产物卸出和分配机理方面的研究得出了相反的结论。在前贮存期,他们发现在子叶和胚乳中高水平的己糖含量与种皮中高的细胞壁蔗糖酶活性存在正相关。据此他们提出了一个模型,蔗糖酶在种子的早期发育阶段调控卸出过程,而细胞壁型蔗糖酶的作用即在早期建立库的强度。Miller等(1992)[43]在研究玉米的一个遗传缺陷型突变株中得出了同样的结论。在此突变株中,其种子重量仅有正常种子的1/5,蔗糖酶没有活性,因而干扰了光合产物运向发育中的种子。

在贮存糖的库器官例如果实中,高的酸性蔗糖酶活性与己糖的积累密切相关。在以贮存蔗糖为主的野生番茄果实中,蔗糖酶的活性降得很低,然而在以贮存己糖为主的栽培番茄果实中,蔗糖酶的活性在果实刚开始成熟时是增加的[44]。通过反义或基因抑制来降低蔗糖酶的活性,可以把以贮存己糖为主的果实转变为以贮存蔗糖为主[35,39],这表明在番茄中有一可溶性蔗糖酶控制糖分的组成。在对低温下贮存的土豆块茎糖分的研究也得出了类似的结果,通过反义手段来降低蔗糖酶的活性导致己糖/蔗糖比降低,但并没改变糖分总量[45]。因而可溶性酸性蔗糖酶起糖组分调节因子的作用。

在马铃薯块茎的细胞质和胞间特异性表达酵母的蔗糖酶,导致蔗糖含量降低,葡萄糖含量提高。块茎细胞质中蔗糖酶活性的提高增加了糖酵解的速度,造成磷酸化中间产物积累,但这些磷酸化中间产物并没有用来合成淀粉。另外,在胞间表达蔗糖酶并没有增加磷酸己糖的含量[37]。

6　问题及展望

目前,对酸性蔗糖酶的研究已取得了很大进展,不仅提纯了蔗糖酶,建立了活性测定方法,而且已从多种植物中克隆了它们的cDNA,并在转基因植物中进行了表达和功能鉴定。但对于植物中的蔗糖酶,还有很多有待解决的问题,如:1)为什么位于不同亚细胞中的蔗糖酶具有不同的特性,它们之间是如何协调的?2)中性/碱性蔗糖酶的功能是什么?3)是否还有其他的代谢产物或物质调控蔗糖酶的表达,等等。这需要把生理、生化、以及分子生物技术有机结合在一起,对这些问题的最终解决将有助于更好地在植物中操纵碳水化合物的代谢与分配。

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Advance Made in Plant Invertase

Si Lizhen,Chu Chengcai

(Institute of Genetics and Developmental Biology,CAS,Beijing100101)

A bstract

In higher plants,sucrose is the main for m of assimilated carbon to be transported from”source”to”sink”tissues, where sucrose was cleaved into Glu and Fru by invertase to provide cells with car bon and energy for plant gr owth and de-velopment.Therefore,invertase plays an important role in source-sink interaction and plant ener gy supply.In this pa-per some advance in invertase research including the classification,main pr operties,gene regulation,and its functions were reviewed.

Key words:Plant,Invertase,Regulation

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