实时定量RT_PCR的原理及方法_阳成波

稀油站工作原理

稀油站的巡检说明书 工作原理: 在主机启动前,先启动低压泵,当低压供油压力正常后,启动吸联于低压管道上的高压油泵,高压由经过高压单向阀送往静压轴承,当高压达到一定压力(6-10MPa)时使主轴浮起,在轴承表面形成一层油膜。主机可启动,主机转动正常后(10分钟)可停止高压油泵,但低压油泵必须正常供油。低压油泵从油箱中吸油后经过单向阀、双筒网片式过滤器、冷却器流往静压轴承,维持主机正常运行。主机正常工作时,低压泵一台工作一台备用,若供油压力低于0、2MPA时启动备用泵,达到正常压力后停止,当供油压力小于0、1MPA、主机跳停。 结构及作用: 2台低压泵:作为设备润滑的动力源,将润滑油送到润滑点,同时可为高压泵供油; 2台高压泵(其她油站没):用高压泵将油的压力打到6-10MPa,将磨机托起,使磨机滑履面与滑履瓦之间形成油膜,减小摩擦,保护滑履瓦; 单向阀:防止润滑油回流或从另一台泵倒流; 安全阀:防止管道堵塞等造成油压超高,导致泵体损坏,安全阀可调节大小; 网片式过滤器:位于供油端,过滤油品中的杂物,避免因润滑油

受污染降低润滑效果或损坏设备(弊端就是造成油路压差增大,过滤效果越好阻力越大); 磁性过滤器、过滤网:位于回油管,有磁性过滤与过滤网组成,主要就是收集油品带回的金属屑与杂物; 冷却器:由于润滑油在润滑设备的同时也冷却了设备,带出大量的热,需通过冷却器进行冷却,否则润滑油的粘度下降或变质; 油管:送油 油箱:存油的地方 仪表:对油站的温度、压力、油位进行监控 加热器:当环境温度偏低时,润滑油的粘度发生变化,达不到设备润滑要求,这就需要对润滑油进行加热; 控制箱:油站通过控制箱来开关油站,同时通过仪表数据传输给PLC对油站的油压、油温油位等进行连锁保护; 阀门:根据不同设备的润滑要求不同,通过阀门来调节油量的大小与压力的大小,满足设备的润滑,阀门分进过滤器阀门(排油用)、短路阀(油不经冷却器)、进冷却器阀、出冷却器阀、溢流阀(直接回油箱阀)、供各润滑点的阀门等。 巡检要求与注意事项: 供油压力:0、3~0、4MPa 供油泵出口压力:＜0、8MPa

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是 一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的

实时荧光定量PCR原理和实验

实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更

为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

高低压稀油站技术要求

高低压稀油站 技 术 要 求

一、高低压稀油站技术参数 型号：GXYZ-63BF 公称流量：63L/min 公称压力： 过滤面积： 换热面积：12m2 进水温度：30℃ 进水压力： 冷却水耗量：9m3/h 冷却水系统方式：闭式循环水冷却系统 电加热器：4kW×3 220V 油箱加热 过滤精度： 供油温度：≤42℃ 站内油箱容积：1600L 驱动低压油泵电机：YX3-100L2-4/B5 3kW×2 380V 驱动高压油泵电机：YX3-132M2-6/B5 ×2 380V 高压泵主要技术数据： 高压油公称流量：10L/min 高压油压力：油压调节范围： 低压泵主要技术数据： 公称流量：风机轴承用：20L/min 油压调节范围：仪表输出信号：4-20mA信号，稀油站的温度、压力、液位等信号进电控箱数显仪显示控制，再送中控室DCS系统监控。 2台低压油泵能够自动互投，无主副泵之分，A泵运转中，B泵可拆卸解检，不停机； 高位油箱容积：400L（高位油箱回油时间保持20分钟） 站内油箱及高位油箱材质：碳钢（防锈处理） 二、供货范围：

高低压稀油站及配套设施、高位油箱、站内润滑管路；冷却器；现场电控箱<转换开关；启、停机按钮；指示灯；交流接触器；断路器；报警笛>等所有稀油润滑系统配套设施，构成一套完整的润滑系统。 不含：稀油站站外进、出口油管路、水管路及站外“球阀、止回阀、窥视镜、压力表”。 三、工作原理： 1、稀油润滑系统工作原理：即油液由油泵从油箱中吸出，经单向阀、双筒过滤器、冷却器，被直接送到设备的润滑点。稀油润滑系统的工称压力为，因此稀油润滑系统在出厂前，已经将稀油润滑系统中的安全阀泄荷压力调定在，当稀油润滑系统压力超过安全阀的设定压力时，安全阀将自动开启泄压，多余的油液即流回油箱。为保证稀油润滑系统供油压力的稳定，防止因供油压力过高，使润滑点处产生润滑油外漏现象。在稀油润滑系统供油口设计安装了压力调节阀，其主要作用为：可根据各润滑点对供油压力的需要，设定压力调节阀的工作压力，一般供油压力为。 2、采用双油泵设计：稀油站安装了两台油泵，一台工作，另一台备用，可相互转换成互为备用。正常工作状态下，工作油泵运行，发生故障油压下降，备用油泵自动启动投入工作，保证向主机连续供送润滑油。润滑油系统在运行中因故障油压下降达到时，备用油泵自动启动运行，并发出报警信号，此时需人工检查设备状态，无问题后手动停止泵用泵，否则需对设备进行检修。如备用油泵启动运行后，系统压力继续下降达到时，发出低压报警信号，提示主控室采取措施，对整套润滑系统进行检修。 3、采用双筒过滤器：过滤器有两个过滤筒，一个过滤筒工作，另一个过滤筒备用。当工作筒由于杂质的沉积压差达到时，压力变送器发出报警信号，即可转动换向阀换向，使备用工作筒投入工作，即可取出滤芯进行清洗和更换滤芯。 4、油箱液位控制：油箱液位控制采用磁翻板式液位变送器。当油箱液位因某种原因不断下降或上升，都有具体数值显示，达到设计规定的液位时，发出液位异常报警信号。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利

稀油站图纸

目录 一、用途 二、规格和性能 三、工作原理 四、电气操纵系统 五、安装调试和试运转 六、操作规程 七、维修和安全事项 八、常见故障及排除方法 九、搬运及贮藏 十、开箱检查 附： 系统图 电气原理图 接线端子图 外形图

一、用途 XYZ—63G型稀油润滑站主要用于冶金、矿山等机械设备的稀油循环润滑系统中，向减速器齿轮、主电机轴承等磨擦部位供送润滑油。 该油站工作介质粘度等级为N22~N320的工业润滑油。本油站通常是安装在主机附近的地下油库或地坑内。 二、规格和性能 三、工作原理 本油站由油箱、油泵装置、双筒网式过滤器和磁性过滤网装置、压差发讯器、压差变送器、压力变送器和油冷却器以及电器仪表控制装置、管道、阀门和附件高位油箱等组成。 工作时，油液由齿轮油泵从油箱吸出，经单向阀、双筒-网式油滤器、油冷却器、进入直通单向阀，共分两路，一路向主机供油，另一路进入高位油箱。油站的最高工作压力为0.4Mpa，最低工作压力为0.1Mpa。根据润滑点的需求，通过调节安全阀确定使用压力。当油站的工作压力超过安全阀的调定压力时，安全阀将自动开启，多余的油液即流回油箱。 本油站的结构有以下特点： （1）设有备用油泵 本油站有两台油泵，一台工作，一台备用。油站工作中，当系统压力低于压力变送器二次仪表的设定值时，备用油泵即自动启动进行工作，从而确保主机的润滑需求。 （2）双筒网式油滤器设置在油冷却器之前 润滑油在油滤器中的通过能力与其粘度有关。油的温度高则粘度低，通过能力好，过滤效果也较好。所以先过滤后冷却是相当有利的。 （3）采用双筒网式油滤器 双筒网式油滤器有两组过滤滤芯。一组滤芯工作，一组滤芯备用。当油压压差超过0.05MPa时，压差发讯器发出信号，人工开启转换阀使备用滤芯工作，即可不停机取出原

实时荧光定量PCR全方位解析

实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧

实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤

实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。

定量PCR原理及实验方法

定量PCR原理及实验方法 方法简介 所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 RT-qPCR是由三个步骤组成: 1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA; 2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA; 3.检测:实时检测和定量扩增的产物. RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint): 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性 3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。存在的问题 由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析： 1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品 2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞 3.总RNA或者mRNA 4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合 6.变异系数、灵敏度 7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。 8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。 RNA质量评价 现在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course (http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。

实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：

（3）Ct值： CT值的重现性：

5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。

稀油站工作原理及常见故障处理 (2)

稀油站工作原理及常见故障处理 一、稀油站结构及组成 稀油站一般分为两大系统,低压供油系统与高压供油系统构成。主要由两台低压齿轮泵、两台高压柱塞泵,双筒网片式过滤器、油冷却器、油箱、阀门以及一些供油管道,加上电气控制柜组成。高低压泵功率一般都就是2、２ＫW,不过这也不就是固定的,可根据主机工况需要来进行配置。低压供油系统工作压力为0.４ Mpa,高压供油系统压力为3１、５Ｍpa,可通过调节阀门来调整其压力大小。在主机启动、低速或者就是停车时,采用高压系统形成一层静压油膜,并且运行一定的时间待主机运行具有动压油膜后,高压泵才停止供油,低压泵接着继续保持供油,以保证主机运行润滑的需要。 二、工作原理 稀油站的工作原理基本相同:油液由齿轮泵从油箱中吸出,经单向阀、双筒网式过滤器、换热器,被直接送到设备润滑点。每台稀油站设有2台油泵,一台工作,一台备用。稀油站油泵输出油压为0、4ＭPa,流量为2、5L／ｈ。润滑油流程:工作油泵一单向阀一过滤器一冷凝器(夏季使用)一压力继电器一主机设备润滑点一返回油箱—油泵。下面谈谈影响稀油站正常工作的几个因素: ①压力 低压最高压力为0、4Mpａ,最低压力为0、1２Mpa。当压力Ｐ＜0、１2Ｍpａ时,备用泵就会自动投入工作;当供油压力达到0.4Mｐa

时,备用泵自动停止工作。若备用泵起动后压力仍低于0、12Ｍpa时,主机就会发出停车报警信号,这就是一个重故障信号之一,会导致主机跳停。这就是压力低的情况,如若压力过高,P＞０、45Ｍpａ时,也会报警,但此时主机不会停车。稀油站刚开起的时候,当低压供油压力大于0、2５MＰａ时,启动高压泵,高压泵启动十分钟后,高压出口油压达到6MPa时转由压力控制器控制主机启动,当压力达到14ＭPa时,主机运行速度达到正常运转速度,可停止高压泵工作,由低压供油继续工作,将润滑油运送到各个润滑点。另外有一个压力的因素就是过滤器压差,当过滤器的压差≥0、1ＭPa时,有报警铃声响但主机不会停,必须由人工手动切换阀更换工作筒。 ②油温 油站在起动前,如果油温低于２5oＣ,则PLC模块会给一个信号给加热器继电器,继电器得电就自动进行加热。当油温达到３8oC时,又自动停止电加热器,启动低压泵投入工作。在主机正常运行中,供油出口油温下降至35oＣ时会再自动开起电加热器,以维持油温在一定范围内,保证油质的液态性与流动性,以便于油的循环往复。当油温过高时,若达到45o时,出现报警信号但主机也不会停机,这时就需要人工打开泠却器进行冷却。 ③温位 在温箱里面装有一个温位发讯器,也就就是通常我们说的油浮子。它就是用来检测并控制油箱里的油位情况,最高与最低油位置可由人工根据需要来设定,控制点采取开点形式,当油浮子处在最高或最

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC

实时荧光定量pcr步骤

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

稀油站工作原理

稀油站工作原理 -标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

稀油站的巡检说明书 工作原理： 在主机启动前，先启动低压泵，当低压供油压力正常后，启动吸联于低压管道上的高压油泵，高压由经过高压单向阀送往静压轴承，当高压达到一定压力（6-10MPa）时使主轴浮起，在轴承表面形成一层油膜。主机可启动，主机转动正常后（10分钟）可停止高压油泵，但低压油泵必须正常供油。低压油泵从油箱中吸油后经过单向阀、双筒网片式过滤器、冷却器流往静压轴承，维持主机正常运行。主机正常工作时，低压泵一台工作一台备用，若供油压力低于0.2MPA时启动备用泵，达到正常压力后停止，当供油压力小于0.1MPA.主机跳停。 结构及作用： 2台低压泵：作为设备润滑的动力源，将润滑油送到润滑点，同时可为高压泵供油； 2台高压泵（其他油站没）：用高压泵将油的压力打到6-10MPa，将磨机托起，使磨机滑履面和滑履瓦之间形成油膜，减小摩擦，保护滑履瓦； 单向阀：防止润滑油回流或从另一台泵倒流； 安全阀：防止管道堵塞等造成油压超高，导致泵体损坏，安全阀可调节大小；

网片式过滤器：位于供油端，过滤油品中的杂物，避免因润滑油受污染降低润滑效果或损坏设备（弊端是造成油路压差增大，过滤效果越好阻力越大）； 磁性过滤器、过滤网：位于回油管，有磁性过滤和过滤网组成，主要是收集油品带回的金属屑和杂物； 冷却器：由于润滑油在润滑设备的同时也冷却了设备，带出大量的热，需通过冷却器进行冷却，否则润滑油的粘度下降或变质； 油管：送油 油箱：存油的地方 仪表：对油站的温度、压力、油位进行监控 加热器：当环境温度偏低时，润滑油的粘度发生变化，达不到设备润滑要求，这就需要对润滑油进行加热； 控制箱：油站通过控制箱来开关油站，同时通过仪表数据传输给PLC对油站的油压、油温油位等进行连锁保护；阀门：根据不同设备的润滑要求不同，通过阀门来调节油量的大小和压力的大小，满足设备的润滑，阀门分进过滤器阀门（排油用）、短路阀（油不经冷却器）、进冷却器阀、出冷却器阀、溢流阀（直接回油箱阀）、供各润滑点的阀门等。 巡检要求和注意事项： 供油压力：0.3~0.4MPa

实时荧光定量PCR具体实验步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板

川润稀油站说明书

1 控制设备功能 控制柜配套与高低压稀油润滑设备的控制，控制具有对两台低压油泵电机、四台高压油泵电机、加热器及仪器仪表等控制。两台低压油泵电机一备一用，四台高压油泵电机长期工作，加热器控制油箱温度，仪器仪表对油系统进行监测和控制。电控柜采用可编程序控制器以实现自动控制、保护及故障报警功能，并具有与中控室联接的DCS接口。 2 电气原理图（见附件） 3 使用环境条件 3.1供电电压380V,波动±10％；频率50HZ，波动±1％； 3.2环境温度0～40℃,相对湿度小于90％(25℃时)； 3.3无震动、无腐蚀性气体、无爆炸的环境； 3.4 海拔高度≤1000米； 4安装 4.1电控柜防护等级：IP44，电控柜应安装在防雨的位置，具体位置由用户自行决定，箱体要固定。 4.2引入电源进线分别接到 U、V、W、N端子上，联接牢固，接地线PE不能与零线N联接在一起，一定要分开联接。 4.3 电动机、加热器的接线：U1、V1、W1……U7、V7、W7，油站接线盒上的端子排号码应一一对应电控柜端子排的号码联接，见附图1460200-2153，联接牢固，线路联接完成，均应仔细核对，不得有误。联接电动机和加热器的电缆应能足够承受其相应的电流。 4.4 仪器仪表的接线：油站接线盒上的端子排号码应一一对应电控柜端子排的号码联接，见附图1460200-2153，联接牢固，线路联接完成，均应仔细核对，不得有误。建议联接的控制电缆应≥1mm2。 4.5 电控柜与中控室的联接：去中控室的联线均为无源开关接线，中控室返回至电控柜的联线也均应为无源开关接点，应按所需功能对应正确，见附图1460200-2153，联接牢固，不得乱接，否则在控制上会出现控制错误和破坏设备的可能，线路联接完成，均应仔细核对，不得有误。建议联接的控制电缆应≥1mm2。 5 投运前的准备 5.1 按电动机铭牌参数检查并校定电机控制回路热过载继电器的整定值。 5.2合上小型断路器，分别点动油泵启动按钮，检查电动机的旋向是否和标记一致，若方向相反，则任意交换两相电机电源，直至方向完全正确。