肺形侧耳发酵培养基优化及多糖提取工艺_王瑞

菌物学报

jwxt@https://www.360docs.net/doc/1c18963099.html,

15 July 2015, 34(4): 787‐793

https://www.360docs.net/doc/1c18963099.html,

研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.150042

基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2014CB138304） *

Corresponding author. E ‐mail: qwang2003@https://www.360docs.net/doc/1c18963099.html, 收稿日期：2015‐02‐10，接受日期：2015‐05‐19

肺形侧耳发酵培养基优化及多糖提取工艺

王瑞朱宴妍朱相杨王琦*

吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心吉林长春 130118

摘要：通过碳源、氮源单因素实验和正交实验，对野生肺形侧耳进行发酵培养基优化。选取浸提时间、浸提温度及液料比3个因素，以胞内粗多糖提取率为指标，采用正交实验设计确定菌丝体胞内多糖提取的最佳工艺。结果表明，适宜肺形侧耳深层发酵的培养基为蔗糖1.5%，麸皮5%，蛋白胨0.6%，KH 2PO 4 0.15%，MgSO 4 0.75%，VB 1 0.01%。胞内多糖提取的最佳工艺为浸提时间2h ，液料比50:1，浸提温度90℃，此条件下多糖提取率为34.35%。关键词：肺形侧耳，发酵，多糖，提取率

Optimization of fermentation medium and intracellular polysaccharide extraction technique of Pleurotus pulmonarius

WANG Rui ZHU Yan ‐Yan ZHU Xiang ‐Yang WANG Qi *

Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118, China

Abstract : The culture medium for Pleurotus pulmonarius fermentation was optimized by the single factor experiment of carbon source and nitrogen source and the orthogonal experiment. P. pulmonarius intracellular polysaccharide extraction technique was optimized by using extraction rate as index in the orthogonal experiment with three factors, extraction duration, temperature and liquid ‐solid ratio. The results showed that the appropriate submerged fermentation culture medium of P. pulmonarius included saccharose 1.5%, bran 5%, peptone 0.6%, KH 2PO 4 0.15%, MgSO 4 0.75% and VB 1 0.01%. The highest extraction rate was obtained on condition that liquid and solid ratio was at 50:1 and extracting duration 2h at 90°C. Under such a condition, the polysaccharide extraction rate was 34.35%.

Key words : Pleurotus pulmonarius, fermentation, polysaccharides, extraction rate

肺形侧耳Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél.，隶属于担子菌门

Basidiomycota 、伞菌纲

Agaricomycetes 、伞菌目Agaricales 、侧耳科Pleurotaceae 真菌，是一种常见的食药用真菌（戴

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玉成和杨祝良2008；戴玉成等2010），其商品名为“凤尾菇”。该菌含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸和维生素等（韩建东等2014；钟丽娟等2013），不仅具有较高的营养价值，同时还具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力（曹祖蕊等1985；傅幼英等1995；马岩等1997；Smiderle et al . 2008；刘艳如2011；Carbonero et al . 2012；Finimundy et al . 2013）等多种药理活性。目前有关肺形侧耳人工栽培技术及子实体的药理活性已见报道，但关于液体发酵培养基优化及菌丝体多糖提取工艺研究尚未报道。本文对肺形侧耳深层发酵培养基进行优化及对多糖提取工艺进行研究，以期筛选出能高产肺形侧耳多糖的液体培养基，为进一步人工栽培、开发肺形侧耳资源提供理论依据，同时也为深入研究其菌丝体多糖结构及生物活性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

肺形侧耳菌株：采自四川省红原县。由本实验室保藏菌种。 1.2 培养基

1.2.1 平板培养基（PDA 综合培养基）：马铃薯 200g 、葡萄糖 20g 、KH 2PO 4 1.5g 、MgSO 4 0.75g 、VB 1 0.1g 、琼脂 20g 、水1L ，pH 自然。

1.2.2 液体种子培养基：马铃薯200g 、葡萄糖 20g 、蛋白胨2g 、酵母浸粉2g 、KH 2PO 4 1.5g 、MgSO 4 0.75g 、VB 1 10mg 、水1L ，pH 自然。

1.2.3 液体培养基：葡萄糖 20g 、蛋白胨2g 、酵母浸粉2g 、KH 2PO 4 1.5g 、MgSO 4 0.75g 、VB 1 10mg 、水1L ，pH 自然（邵杰2010）。 1.3 方法

1.3.1 肺形侧耳菌种ITS 鉴定：采用CTAB 法提取肺形侧耳菌丝DNA 并进行序列测定。引物序列为ITS1（5’‐TCC GTA GGT GAA CCT GCG G ‐3’）和ITS4（5’‐TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ‐3’）。PCR 采用50μL 扩增体系，反应条件为：95℃预变性5min ；

95℃变性1min ，53℃退火1min ；72℃延伸1min ，35个循环，72℃温浴10min 。

1.3.2 液体培养：将已活化好的肺形侧耳菌种（0.5cm 2大小2–5块）接入100mL 液体种子培养基中（250mL 三角瓶），25℃、150r/min 摇床培养5d ，制得一级种子液。

1.3.3 碳源单因素实验：分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、麸皮作为碳源，将一级种子液转接入液体培养基中，接种量为10%，25℃、150r/min 摇床培养6d ，每组设3次重复，以菌丝体干重（孙丽君等2013）及胞外多糖产量为指标，筛选最适碳源。

1.3.4 氮源单因素实验：分别以酵母浸粉、蛋白胨、NH 4NO 3、牛肉膏为氮源，方法同1.3.2，筛选最适氮源。

1.3.5 发酵培养基优化：以筛选出的最适碳、氮源为基础，选择蔗糖、麸皮、蛋白胨3个因素，进行正交实验，每个因素3个水平，测定菌丝体干重及胞外粗多糖产量，优化发酵培养基。正交试验设计见表1。

1.3.6 热水浸提法提取多糖工艺：选取对胞内粗多糖提取有较大影响的3个因素，即浸提时间、液料比和浸提温度，每个因素各取3个水平，设计正交试验（郑亚凤等2008），以胞内粗多糖提取率为指标，确定菌丝体胞内多糖提取的最佳工艺，试验设计L 9（33）见表2。提取工艺：将抽滤得到的菌丝体用蒸馏水洗涤至洗涤液无色，放置50℃烘箱中恒温干燥，准确称取1.0000g 烘干菌丝体，研磨成

表1 正交试验因素及水平

Table 1 Factors and levels of the orthogonal test 水平 Levels 因素 Factors A 蔗糖 Saccharose (%) B 麸皮 Bran (%) C 蛋白胨 Peptone (%)1 0.5 3 0.4 2 1 4 0.5 3

1.5

0.6

王瑞等 /肺形侧耳发酵培养基优化及多糖提取工艺

菌物学报

表2热水浸提法L 9（33）正交试验因素及水平

Table 2 Factors and levels of the L 9(33) orthogonal test by using hot water extraction method 水平

Levels 因素 Factors

A 浸提时间

Extraction duration (h)

B 液料比 Ratio of liquor

C 浸提温度 Extraction temperature (°C) 1 2 30 70 2 3 40 80 3 4

粉末，按照表1试验设计，提取胞内粗多糖。每组提取3次，合并提取液，浓缩，用4倍体积无水乙醇4℃冰箱沉淀过夜，3 000r/min 离心，分离收集沉淀，45℃恒温干燥，称重，并计算提取率（张凌凌2010）。

提取率=(菌丝体粗多糖总量/菌丝体干重)×100%

2 结果与分析

2.1 肺形侧耳序列分析

将测定的肺形侧耳序列应用BLAST 程序与GenBank 数据库中的已有序列进行同源相似性比较，结果表明：与EU424311.2、HM561983.1、EU424305.2、FJ040174.1、KF724522.1的同源相似性达到100%；表明本实验所用肺形侧耳与GenBank 数据库中的肺形侧耳为同种。

2.2 不同碳源对菌丝体干重及胞外粗多糖产量的影响

由图1可知，肺形侧耳均能很好地利用5种碳源，其中以蔗糖为碳源时，菌丝生物量最多，为2.888g/L ，甘露糖与其较为接近，为2.846g/L 。其余依次为葡萄糖、麦芽糖和麸皮。但以甘露糖为碳源时，胞外粗多糖产量最多，为5.375g/L 。其次为蔗糖和麦芽糖，二者差异较小，葡萄糖处于中间，而麸皮为碳源时胞外多糖产量最低。因此，适宜肺形侧耳液体发酵的最适碳源为甘露糖。但由于甘露糖成本较高，综合成本费用、菌丝生物量和胞外粗

多糖产量等因素，为扩大肺形侧耳液体发酵培养，筛选的最适碳源为蔗糖。

2.3 不同氮源对菌丝体干重及胞外粗多糖产量的影响

肺形侧耳均能很好地利用4种氮源（图2），其中以蛋白胨为氮源时，菌丝生物量最多，为

图1 不同碳源对菌丝干重及胞外粗多糖含量的影响 1：麸皮；2：麦芽糖；3：葡萄糖；4：蔗糖；5：甘露糖. Fig. 1 The effect of different carbon sources on mycelial dry weight and extracellular polysaccharide content of Pleurotus pulmonarius . 1: Bran; 2: Malt sugar; 3: Glucose; 4: Sucrose; 5: Mannose.

图2 不同氮源对菌丝干重及胞外粗多糖含量的影响 1：NH 4NO 3；2：酵母浸粉；3：蛋白胨；4：牛肉膏.

Fig. 2 The effect of different nitrogen sources on mycelial dry weight and extracellular polysaccharide content of Pleurotus pulmonarius . 1: NH 4NO 3; 2: Yeast extract powder; 3: Peptone; 4: Beef extract.

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5.253g/L ，其余依次为酵母浸粉、牛肉膏、NH 4NO 3。从胞外粗多糖产量来看，酵母浸粉为氮源时胞外粗多糖产量最多，为4.325g/L ，其他依次为蛋白胨、牛肉膏和NH 4NO 3。考虑成本费用、菌丝生物量和胞外粗多糖产量等因素，适宜菌丝生长的氮源为蛋白胨。由结果可以看出，有机氮源比无机氮源更适合肺形侧耳液体发酵。蛋白胨有利于菌丝体的生长，而酵母浸粉更有利于积累胞外粗多糖。 2.4 正交试验优化发酵培养基

正交试验结果极差分析见表3。由表2可以分析出3个因素对肺形侧耳菌丝体生物量的影响程度由大到小为：B （麸皮）>A （蔗糖）>C （蛋白胨），对肺形侧耳胞外粗多糖产量的影响程度由大到小

为：C （蛋白胨）>A （蔗糖）>B （麸皮），由表3看出积累菌丝体生物量最多的最优组合为A 3B 3C 1，即蔗糖1.5%，麸皮5%，蛋白胨0.4%，KH 2PO 4 0.15%，MgSO 4 0.75%，VB 1 0.01%，获得胞外粗多糖产量最多的最优组合为A 3B 2C 3，即蔗糖1.5%，麸皮4%，蛋白胨0.6%，KH 2PO 4 0.15%，MgSO 4 0.75%，VB 1 0.01%，综合生物量及粗多糖产量两个指标，二者单独分析出的优化条件不一致，根据因素的影响主次，确定发酵培养基中碳、氮源的最佳组合为：A 3B 3C 3，即蔗糖1.5%，麸皮5%，蛋白胨0.6%，KH 2PO 4 0.15%，MgSO 4 0.75%，VB 1 0.01%。 2.5 热水浸提法最佳工艺确定

由表4看出，C （浸提温度）是影响肺形侧耳

表3 正交试验 L 9（33）结果极差分析 Table 3 The analysis of the orthogonal test L 9(33) 编号Number 因素 Factors 菌丝干重

Weight of dry mycelia (g/L)胞外粗多糖产量

Yield of exoplysaccharides (g/L) A B C 1 1 1 1 5.848 3.805 2 1 2 2 5.712 4.233 3 1 3 3 6.393 4.516 4 2 1 2 4.274 5.383 5 2 2 3 5.253 4.793 6 2 3 1 7.053 4.146 7 3 1 3 4.793 5.213 8 3 2 1 6.285 4.672 9 3 3 2 8.613 4.478

生物量 Biomass

K 1 17.953 14.915 19.186 B>A>C

K 2 16.580 17.250 18.599 K 3 19.691 22.059 16.439 k 1 5.984 4.972 6.395 k 2 5.527 5.750 6.200 k 3 6.563 7.353 5.479 R

1.036

2.381 0.916 胞外粗多糖 Exopoly ‐ saccharides

K 1 12.554 14.401 12.623 C>A>B

K 2 14.322 13.698 14.094 K 3 14.363 13.140 14.522 k 1 4.178 4.013 4.107 k 2 4.303 4.459 4.227 k 3 4.378 4.390 4.524 R

1.809

1.561

1.899

王瑞等 /肺形侧耳发酵培养基优化及多糖提取工艺

菌物学报

表4 正交试验 L 9（33）结果极差分析 Table 4 The analysis of the orthogonal test L 9(33) 编号 Number

因素 Factor 提取率 Rate of extraction (%)

B C 1 1 1 1 12.96 2 1 2 2 11.63 3 1 3 3 34.35 4 2 1 2 12.49 5 2 2 3 26.00 6 2 3 1 10.10 7 3 1 3 9.70 8 3 2 1 11.91 9 3 3 2 17.39 生物量 Yield of biomass

K 1 0.5894 0.3515 0.3497 C>B>A A 1B 3C 3

K 2 0.4859 0.4954 0.4154 K 3 0.3900 0.6184 0.7005 k 1 0.1965 0.1172 0.1166 k 2 0.1620 0.1651 0.1385 k 3 0.1300 0.2061 0.2335 R

0.0665

0.0889

0.1169

胞内粗多糖提取率3个因素中最主要的因素，其他依次为B （液料比）和浸提时间（A ）。热水浸提的最佳提取工艺为A 1B 3C 3，即浸提时间2h ，液料比50:1，浸提温度90℃，此条件下多糖的提取率为34.35%。

3 讨论

随着市场对食用菌需求的不断加大，传统的野外采食和人工栽培已不能满足食用菌产业的需要，此时发酵工程技术应运而生，其不仅具有培养时间短、产量高、不受季节环境限制等优势，同时解决了采集的野生资源不能实现人工驯化，致使其含有的活性物质无法被开发利用的难题。一些食用菌通过液体发酵得到的发酵产物甚至优于采集或栽培的子实体中含有的成分。席亚丽等（2010）研究

发现荷叶离褶伞发酵菌丝体中粗蛋白、碳水化合物、氨基酸、盐酸含量均高于子实体。因此，不断推进和完善发酵工程技术，发掘其较大的社会潜力将是未来国内外开发食用菌资源的趋势。

20世纪80年代后，食药用菌发酵种类日益增多，广泛应用于医药、农业及食品等领域，国内外市场中纷纷出现了以食药用菌发酵产物为原料的药品及功能食品（灵芝片、安络痛、猴头饼干等）。为适应市场发展，获得高产菌株及代谢产物，应进行菌株筛选及优化培养基、培养条件等，不断提高深层发酵技术。

目前，食药用菌液体培养基优化主要集中在最适碳源、氮源及二者最适比例的筛选。韩国Kim et al.（2005）对毛木耳、金钱菌及蛹虫草等多种食药用菌进行发酵培养基优化，结果发现不同菌株其

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最适碳、氮源均不相同（Lim et al . 2004；Xu & Yun 2003）。孙丽君等（2013）对金毛麟伞液体培养基进行优化，以菌丝干重为指标，筛选出的最适碳源为玉米粉，浓度为50g/L ，最适氮源为豆粕，浓度为50g/L ，通过正交试验优化的液体培养基为葡萄糖2%、玉米粉5%、豆粕5%、K 2HPO 4 3%、MgSO 4?7H 2O 4%。

近几年对肺形侧耳菌丝体及发酵液成分的药理活性已有相关报道，如发酵液乙酸乙酯层能够有效抑制金黄色葡萄球菌、赤皮病病原菌、烂尾病病原菌和枯草芽胞杆菌等细菌的生长；菌丝体多糖能够抑制红细胞氧化溶血以及肝组织脂质过氧化，具有一定的抗氧化能力（曾志恒2010），因此，本文对肺形侧耳发酵培养基进行优化，为高效、快速开发肺形侧耳相关产品提供理论依据，同时也为进一步优化液体发酵条件及发酵罐扩大培养提供技术支持。本文筛选的适宜肺形侧耳液体发酵的最适培养基为蔗糖5%，麸皮1.5%，蛋白胨0.6%，KH 2PO 4 0.15%，MgSO 4 0.75%，VB 1 0.01%。随着微生物学、细胞工程、基因工程及现代发酵工程学的相互渗透，食药用菌发酵技术将向更高科技迈进，服务于人类，其发展前景极为广阔。

多糖是国际公认的天然免疫增强剂，它可参与细胞识别、抗原呈递、调节机体免疫应答及新陈代谢等，加之其无毒、结构相对稳定的特性更使其广泛应用于医药、食品、农业、化妆品等领域。因此，能最大化的获得多糖成分，进而深入研究其结构和活性已是当下研究的热点。多糖产量往往受到提取方法及条件不同的影响，目前多糖的提取方法包括水提法、稀酸、稀碱提取法以及酶法、微波、超声波、膜处理等辅助提取法。本文采用传统的热水浸提法优化多糖提取工艺，避免了稀碱或稀酸浸提法等对多糖糖苷键的破坏，从而造成多糖的损失，本实验得到的肺形侧耳菌丝体多糖最佳提取工艺为提时间2h ，液料比50:1，浸提温度90℃，此条件下多糖提取率为34.35%，这为后续研究肺形侧耳

多糖的结构及药理活性提供理论基础。 [REFERENCES]

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