福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度及SNP分型的研究

重庆医科大学

硕士学位论文

福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度及SNP分型的

研究

姓名：段晋琦

申请学位级别：硕士

专业：法医学

指导教师：李剑波

20090501

冰冻切片与石蜡切片的区别

1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3：表1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇4℃3～4h 2 80%乙醇4℃3～4h 3 90%乙醇4℃2～3h 4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h 5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h

石蜡包埋组织的dna提取及其应用

石蜡包埋组织的DNA提取及其应用近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或m RNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Du beau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DN A之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤

石蜡切片的基本操作流程

石蜡切片的基本操作流程一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小；二、固定将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天；三、冲水自来水洗几下，泡1小时；四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h；五、透明酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜；二甲苯，1h；六、包埋二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h；新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h；新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h；新鲜石蜡包埋；七、切片切片厚度为5-7um；八、展片温水（40-42 ℃）展片；九、捞片将展好的片子贴于载玻片上；十、烘片42 ℃将片子上的水烘干；十一、烤片60 ℃烤片12-24h；十二、脱腊二甲苯（I）：2min；酒精：二甲苯=1：1溶液：2min；十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min；自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min；十六、透明二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；

石蜡包埋组织的DNA提取

石蜡包埋组织的DNA提取近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对开矿学延伸。通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。 Goelz氏DNA提取方法的主要步骤 .切除多余石错，暴露组织 .将组织切碎（最大径<0.5mm），称重； 3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h ＴＥ９提取液的制备 500mmol/L Tris 20mmol/L EDTA 10mmol/L NaCl 1％SDS 500 μg/ml 蛋白酶Ｋ pH8.0 4.再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h； 5.用等体积酚－氯仿溶液抽提３次； 6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA 7.-70℃放置２－４h 8.9 000xg离心１h 9.沉淀物用70％乙醇洗１次 10.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。Southern 印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提

石蜡切片的制作过程(精)

石蜡切片的制作目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法

石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片

石蜡包埋切片制作法

一、制备显微标本的切片法一石蜡包埋切片制作法这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下： ⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经固定处理。常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。 ⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（AlcohoI ,酒精），浓度递升到100%。此过程还使组织块进一步硬化。 ⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene ）为透明剂。 ⑷浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。 ⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。 ⑹切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是5~6卩m。 ⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。

染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。二冷冻切片法冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。二、显示标本结构成分的染色法一苏木素伊红染色法（HE染色法）为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。 1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。 2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。 3、蒸馏水略洗。

石蜡切片详细步骤

石蜡切片 1.仪器石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡：将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋：先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。

7．粘片将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照

石蜡切片的制片方法

石蜡切片制作基本技术实验器材：转动切片机、镊子、解剖刀、解剖针、玻璃缸或小塑料盆、小烧杯（50ml）、酒精灯、打火机、染色缸、吸管、温台、温箱、毛笔、纱布、双面刀片。试剂：95%的乙醇、无水乙醇、二甲苯、甲醛、石碳酸、甘油、新鲜鸡蛋清、加拿大树胶、番红、铬绿、熔点48~50℃和56~58℃的石蜡。其它：无水CaCl2 、铁帆、苏木精、重铬酸钾、浓硫酸石蜡切片制作基本技术：石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1.取材应根据要求选取材料来源及部位。采下的标本要注意保湿，冲洗干净后截取大小合适的样品迅速投入固定液中。（注意材料切割形状以便于包埋，尤其植物叶片横纵切面） 2.固定卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1）固定24h，70%酒精保存。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。 3.洗涤与脱水从50％开始→70％→85％→95％→无水乙醇（30min）（此步骤需两遍），每次时间为1～2h；如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存。脱水乙醇的用量为材料体积的3~5倍。无水乙醇中要加入不含结晶水的CaCl2 ；用95%的乙醇配制各级脱水乙醇（原浓度95%,要配浓度y%,则取yml95%乙醇加上95-y=？ml蒸馏水即可）。 4.透明经1/2无水乙醇+1/2二甲苯（氯仿）至纯二甲苯（氯仿）两级透明，每级停留2h。在1/2无水乙醇+1/2二甲苯时加入少量番红干粉。 5.浸蜡在浸入有植物材料的透明剂中投入切成小块的低熔点石蜡，加入石蜡的量溶入透明剂的用石蜡溶液=透明剂体积为原则。用浮石蜡（石蜡放入容器中，水浴熔融，取出石蜡，冷却时不断用玻璃棒搅拌，空气进入，冷却后即为浮石蜡）。加蜡后放有材料的有盖容器放入35℃的温箱中6h或更长时间。之后调高温度至56℃，打开盖子让透明剂蒸发，2h后将石蜡溶液倾去。将植物材料移入高熔点的熔融纯石蜡小烧杯中，2~4h再换一次熔融纯石蜡，2~4h即可进行包埋。 6.包埋、切片和粘片（1）折包埋纸盒；（2）材料包埋：熔融的石蜡到入纸盒中，用在酒精灯上烧热的镊子或解剖针将材料排好（快速，避免石蜡结晶），然后将包埋纸盒放入冷水中冷却凝固。（3）修蜡：每块拉一个材料，双面刀片切开。（4）粘蜡快：2*2*2.5~3cm的长方形木块，长轴一端刻出网格；木块具网格一端浸入已溶化的废石蜡中，蜡块修成下宽上窄的台体，用烧热的解剖针一面贴

石蜡切片步骤

石蜡切片制作大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇）固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片

组织块石蜡包埋

组织块石蜡包埋的步骤： 1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm） *1.0cm*(0.2-0.3cm) 2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。固定时间以12-24h为宜。（4℃冰箱可放置1-3个月） 3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h. 4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。可将组织放于70%酒精中过夜。 5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。 6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。 7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切片厚度为4-6μm。贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。 HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制： 1.Harris苏木精的配制苏木精 1g 硫酸铝钾 15g 无水乙醇 10ml 蒸馏水 200ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 2.伊红的配制伊红 1g

石蜡切片法

2. 取材取材时，最好用徒手切片等方法，检查一下材料的内部结构是否适合需要，不理想时，再重新取材。要点：（1）在符合观察要求的情况下，材料越小越好，体积尺寸一般不超过0.5cm。（2）进行科研用的，材料样本数量要符合统计学的需要，并留有充分的余地。（3）有特殊需要的材料，如茎尖纵切要看腋芽等结构的，要将材料作好标记——两侧削扁，切片时才有方向性。（4）材料取下后要设法保持材料的新鲜。材料取好后要立即固定。 3. 固定（FAA者可免） FAA固定液的配置：（50-70%乙醇90ml+冰醋酸5ml+37-40%甲醛（即福尔马林）5ml），常温下至少24hr或更长（视材料厚薄、大小而定）。固定后一般的材料都可以在此液中于冰箱长期保存。要点：①固定液的体积为材料体积的20-50倍；②固定液开始浸泡时，要对材料抽气， 5. 脱水材料完成“冲洗”后，将材料上多余的水尽量除去，然后进入第一级脱水剂中。脱水剂的浓度分为6-7级，从低到高逐级进行，每级脱水约2小时。材料小和嫩的脱水时间可以缩短，材料大和硬（木质化程度高的）脱水的时间可以长一些，需要多总结经验。脱水过程长，尤其是在高浓度脱水剂中的时间长，材料会变脆，不利于切片，见下表。注意：用FAA固定的材料，因不经“冲洗”，可以直接从2级脱水剂开始脱水。注意：脱水剂用量不少于材料体积的5倍。叔丁醇脱水所要求的温度，以叔丁醇不凝固材料进入无水的脱水剂中后，若脱水剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到 7. 浸蜡（透蜡）材料从叔丁醇脱水后进入装有适量融化的叔丁醇（恒温箱最好从36-40度缓慢升到56-60℃，透蜡的效果才好）的蜡管中，在蜡管中逐渐多次加入碎蜡（熔点48-50℃），直至

石蜡包埋

一一、首先是开场白：各位老师，上午好！我叫……，是……级……班的学生，我的论文题目是……。论文是在……导师的悉心指点下完成的，在这里我向我的导师表示深深的谢意，向各位老师不辞辛苦参加我的论文答辩表示衷心的感谢，并对四年来我有机会聆听教诲的各位老师表示由衷的敬意。下面我将本论文设计的目的和主要内容向各位老师作一汇报，恳请各位老师批评指导。二、内容首先，我想谈谈这个毕业论文设计的目的及意义。…… 其次，我想谈谈这篇论文的结构和主要内容。本文分成……个部分. 第一部分是……。这部分主要论述…… 第二部分是……。这部分分析…… 第三部分是…… 三、结束语最后，我想谈谈这篇论文和系统存在的不足。这篇论文的写作以及修改的过程，也是我越来越认识到自己知识与经验缺乏的过程。虽然，我尽可能地收集材料，竭尽所能运用自己所学的知识进行论文写作，但论文还是存在许多不足之处，有待改进。请各位评委老师多批评指正，让我在今后的学习中学到更多。谢谢！四、老师提问答辩的准备工作学生可以从下列问题（第4~10题）中，根据自己实际，选取二三个问题，作好汇报准备，（第1~3题必选）。时间一般不超过10分钟。内容最好烂熟于心中，不看稿纸，语言简明流畅。 1．为什么选择这个课题（或题目），研究、写作它有什么学术价值或现实意义。 2．说明这个课题的历史和现状，即前人做过哪些研究，取得哪些成果，有哪些问题没有解决，自己有什么新的看法，提出并解决了哪些问题。 3．文章的基本观点和立论的基本依据。 4．学术界和社会上对某些问题的具体争论，自己的倾向性观点。 5．重要引文的具体出处。 6．本应涉及或解决但因力不从心而未接触的问题；因认为与本文中心关系不大而未写入的新见解。 7．本文提出的见解的可行性。 8．定稿交出后，自己重读审查新发现的缺陷。 9．写作毕业论文（作业）的体会。 10．本文的优缺点。总之，要作好口头表述的准备。不是宣读论文，也不是宣读写作提纲和朗读内容提要。学生答辩注意事项 1．带上自己的论文、资料和笔记本。 2．注意开场白、结束语的礼仪。 3．坦然镇定，声音要大而准确，使在场的所有人都能听到。 4．听取答辩小组成员的提问，精神要高度集中，同时，将提问的问题——记在本上。 5．对提出的问题，要在短时间内迅速做出反应，以自信而流畅的语言，肯定的语气，不慌不忙地—一回答每个问题。 6．对提出的疑问，要审慎地回答，对有把握的疑问要回答或辩解、申明理由；对拿不准的问题，可不进行辩解，而实事求是地回答，态度要谦虚。 7．回答问题要注意的几点：（1）正确、准确。正面回答问题，不转换论题，更不要答非所问。

小鼠部分组织的石蜡切片制作

小鼠部分组织的石蜡切片制作一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构。二、材料与用具1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。三、实验内容与步骤 1．取材及固定取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm 的组织块。用先用0.85 ％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr 。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。取下的材料马上进行固定，采用FAA 固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 ，固定时间2 hr 以上，超过24hr 时可继续浸泡或转入70% 酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前用70% 酒精洗去固定液。 3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30 % 50 % 70 % 80 % > 90 % > 95 % > 100 % （I ）100 % （n ）组织块在各级较低浓酒精（小于70 ％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过

石蜡切片步骤

石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。固定时间：4oC固定24小时。注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。（三）脱水与透明漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。（四）透蜡透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。

石蜡包埋和HE染色的制作过程

步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。步骤一：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。步骤四：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。酒精用了2次先有低到高，再有高到低，这是为什么？步骤五：染色 HE染色过程是： ①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。 ②酸水及氨水中分色，各数秒钟。 ③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。

常规石蜡包埋组织切片(常规切片)的制备

常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间） 1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。 2．脱水（常温下）（1）乙醇－甲醛（AF）液固定 60~120min （2）80%乙醇 60~120min （3）95%乙醇Ⅰ 60~120min （4）95%乙醇Ⅱ 60~120min （5）无水乙醇Ⅰ 60~120min （6）无水乙醇Ⅱ 60~120min （7）无水乙醇Ⅲ 60min ［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。 3．透明（1）二甲苯Ⅰ 20min （2）二甲苯Ⅱ 20min （3）二甲苯Ⅲ 20min ［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。③二甲苯应及时过滤、更换。④组织

经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。 4．浸蜡（1）石蜡Ⅰ（45~50℃） 60min （2）石蜡Ⅱ（56~58℃） 60min （3）石蜡Ⅲ（56~58℃） 60min ［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。 5．包埋（1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中；应将组织块平正地置放于包埋模具底面的中央处；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。（2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。（3）待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。（4）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡快），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组织块周围保留1~2mm石蜡为宜）。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。（5）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。（6）把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。（7）使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。（8）注意事项 ①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括亚号）、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。

组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程

组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程一取材和固定取材后经固定24小时（4%PA灌注取材的后固定6~8小时）以后，流水冲洗24小时，置于70%~80%乙醇中，可长期保存。二脱水和包埋 1、95%ALC（二道）Ⅰ2~4h Ⅱ2h 2、无水ALC（二道）Ⅰ1.5h Ⅱ1h 3、二甲苯+无水乙醇（1：1）20min 4、二甲苯（二道）Ⅰ10min （注：脱水透明esp.透明时间可适当延长）Ⅱ10min 5、浸软蜡（50~52℃）（二道）Ⅰ30min Ⅱ1h 6、浸硬蜡（58~60℃）（二道）Ⅰ30min Ⅱ30min 7、包埋：注意温度、切面。三切片修、切、展、贴、烤（烤片55~60℃）3~10h 四HE染色 1、二甲苯脱蜡五道，每道5~10分钟 2、无水乙醇Ⅰ5min Ⅱ5min 3、95%乙醇Ⅰ5min Ⅱ5mn 4、80%乙醇5min 5、70%乙醇5min 6、D．W．3~5min 7、Harris苏木素液5min（冬天可适当延长，eg.20min） 8、水洗 9、0.5%盐酸酒精分色3~10seconds，镜下观察 10、水洗蓝化15~30min（注意换水） 11、70%乙醇5min 12、80%乙醇5min 13、伊红液（95%乙醇溶液）3~30seconds 14、95%乙醇Ⅰ1min Ⅱ5min 15、无水乙醇Ⅰ5min Ⅱ5min 16、二甲苯+乙醇（1：1）5min 17、二甲苯Ⅰ5min Ⅱ5min Ⅲ5min 18、中性树胶封片。

HE染色注意事项： 1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 2.切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。 3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。 5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。 6.最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。