qPCR的原理

原理

（1）PCR：Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需

要DNA 聚合酶，DNA 模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及适当的缓冲体系。

PCR 产物的增长形式为２N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是

循环数)。实际中，扩增效率不为100％。

Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。（普通）PCR 包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线（amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以考虑。

普通PCR 是在扩增完以后，（无论多少个循环），进行电泳，染色。对于判

断目的DNA 有没有，是出色的。但对于检测目的DNA 有多少分子（初始的时候），则勉为其难。因为PCR 的理想和实际仍相差一段距离。理论界普遍认为，PCR 的起始若干循环内，由于原料，酶的充足，抑制子（抑制PCR 的因素，如dNTPs 分解产生焦磷酸）的量少，PCR 可以是理想的——即每个循环后扩增子增加一倍。然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，抑制子浓度也相对较高，PCR 的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型的，而不是“J”型。

图2：扩增曲线。

理想：J 型，2N 方程。

实际：S 型。分为：不可检测期，指数期，平台期。

这个扩增曲线，据说最初是用以下办法得到的：配好若干（如40）相同的

PCR 体系，分别进行1，2，3……40 个循环，再用测OD 等定量方法来知道有多

少扩增子产生，作图。

由于对极少量DNA(1~数千？)的直接定量办法还没有，该扩增曲线的最初

若干循环，扩增子的量标为0，表示难以同背景干扰分开。

Real time PCR 同样不能直接测出初始DNA 的分子数，不过，它采用的数据

是在PCR 中期，比末期定量要准确。（更接近理想情况。）

（2）Real time PCR 的化学基础

real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，

使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线

（如，图2，3）。

图3：real time PCR 的扩增曲线。名词解释：

?Rn:一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度。(Normalized with ROX-参比染料。) ?Rn+:反应管含有模板DNA。

?Rn-:反应管不含有模板DNA。

?无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。

?Threshold: 荧光（Rn）超过本底——达到可检测水平时的临界数值。

?Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。

?基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。）