pRS415酵母表达载体说明
pRS415
编号 载体名称
北京华越洋生物VECT2070 pRS415
pRS415载体基本信息
出品公司: Stratagene（Agilent）
载体名称: pRS415
质粒类型: 酿酒酵母载体；酵母着丝粒质粒；穿梭载体 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶
高拷贝/低拷贝: --‐--‐
启动子: --‐--‐
载体大小: 6021 b p
5' 测序引物及序列: --‐--‐
3' 测序引物及序列: --‐--‐
载体标签: --‐--‐
载体抗性: 氨苄青霉素Ampicillin
筛选标记: LEU2
克隆宿主: --‐--‐
备注: 含a b eta--‐gal报告基因；宿主菌株YPH499，YPH500，YPH501
产品目录号: --‐--‐
稳定性: --‐--‐
组成型/诱导型: 组成型
病毒/非病毒: 非病毒
pRS415载体质粒图谱和多克隆位点信息
载体序列
ORIGIN
1 t cgcgcgttt c ggtgatgac g gtgaaaacc t ctgacacat g cagctcccg g agacggtca 61 c agcttgtct g taagcggat g ccgggagca g acaagcccg t cagggcgcg t cagcgggtg 121 t tggcgggtg t cggggctgg c ttaactatg c ggcatcaga g cagattgta c tgagagtgc 181 a ccatatcga c tacgtcgta a ggccgtttc t gacagagta a aattcttga g ggaactttc 241 a ccattatgg g aaatggttc a agaaggtat t gacttaaac t ccatcaaat g gtcaggtca 301 t tgagtgttt t ttatttgtt g tattttttt t tttttagag a aaatcctcc a atatcaaat
361 t aggaatcgt a gtttcatga t tttctgtta c acctaactt t ttgtgtggt g ccctcctcc
421 t tgtcaatat t aatgttaaa g tgcaattct t tttccttat c acgttgagc c attagtatc
481 a atttgctta c ctgtattcc t ttactatcc t cctttttct c cttcttgat a aatgtatgt
541 a gattgcgta t atagtttcg t ctaccctat g aacatattc c attttgtaa t ttcgtgtcg
601 t ttctattat g aatttcatt t ataaagttt a tgtacaaat a tcataaaaa a agagaatct
661 t tttaagcaa g gattttctt a acttcttcg g cgacagcat c accgacttc g gtggtactg
721 t tggaaccac c taaatcacc a gttctgata c ctgcatcca a aaccttttt a actgcatct
781 t caatggcct t accttcttc a ggcaagttc a atgacaatt t caacatcat t gcagcagac
841 a agatagtgg c gatagggtc a accttattc t ttggcaaat c tggagcaga a ccgtggcat 901 g gttcgtaca a accaaatgc g gtgttcttg t ctggcaaag a ggccaagga c gcagatggc 961 a acaaaccca a ggaacctgg g ataacggag g cttcatcgg a gatgatatc a ccaaacatg 1021 t tgctggtga t tataatacc a tttaggtgg g ttgggttct t aactaggat c atggcggca
1081 g aatcaatca a ttgatgttg a accttcaat g tagggaatt c gttcttgat g gtttcctcc
1141 a cagtttttc t ccataatct t gaagaggcc a aaacattag c tttatccaa g gaccaaata 1201 g gcaatggtg g ctcatgttg t agggccatg a aagcggcca t tcttgtgat t ctttgcact
1261 t ctggaacgg t gtattgttc a ctatcccaa g cgacaccat c accatcgtc t tcctttctc
1321 t taccaaagt a aatacctcc c actaattct c tgacaacaa c gaagtcagt a cctttagca 1381 a attgtggct t gattggaga t aagtctaaa a gagagtcgg a tgcaaagtt a catggtctt 1441 a agttggcgt a caattgaag t tctttacgg a tttttagta a accttgttc a ggtctaaca
1501 c taccggtac c ccatttagg a ccacccaca g cacctaaca a aacggcatc a accttcttg 1561 g aggcttcca g cgcctcatc t ggaagtggg a cacctgtag c atcgatagc a gcaccacca 1621 a ttaaatgat t ttcgaaatc g aacttgaca t tggaacgaa c atcagaaat a gctttaaga 1681 a ccttaatgg c ttcggctgt g atttcttga c caacgtggt c acctggcaa a acgacgatc 1741 t tcttagggg c agacatagg g gcagacatt a gaatggtat a tccttgaaa t atatatata 1801 t attgctgaa a tgtaaaagg t aagaaaagt t agaaagtaa g acgattgct a accacctat 1861 t ggaaaaaac a ataggtcct t aaataatat t gtcaacttc a agtattgtg a tgcaagcat 1921 t tagtcatga a cgcttctct a ttctatatg a aaagccggt t ccggcctct c acctttcct
1981 t tttctccca a tttttcagt t gaaaaaggt a tatgcgtca g gcgacctct g aaattaaca
2041 a aaaatttcc a gtcatcgaa t ttgattctg t gcgatagcg c ccctgtgtg t tctcgttat
2101 g ttgaggaaa a aaataatgg t tgctaagag a ttcgaactc t tgcatctta c gatacctga 2161 g tattcccac a gttaactgc g gtcaagata t ttcttgaat c aggcgcctt a gaccgctcg 2221 g ccaaacaac c aattacttg t tgagaaata g agtataatt a tcctataaa t ataacgttt 2281 t tgaacacac a tgaacaagg a agtacagga c aattgattt t gaagagaat g tggattttg 2341 a tgtaattgt t gggattcca t ttttaataa g gcaataata t taggtatgt g gatatacta
2401 g aagttctcc t cgaccgtcg a tatgcggtg t gaaataccg c acagatgcg t aaggagaaa 2461 a taccgcatc a ggaaattgt a aacgttaat a ttttgttaa a attcgcgtt a aatttttgt
2521 t aaatcagct c attttttaa c caataggcc g aaatcggca a aatccctta t aaatcaaaa
2581 g aatagaccg a gatagggtt g agtgttgtt c cagtttgga a caagagtcc a ctattaaag
2641 a acgtggact c caacgtcaa a gggcgaaaa a ccgtctatc a gggcgatgg c ccactacgt 2701 g aaccatcac c ctaatcaag t tttttgggg t cgaggtgcc g taaagcact a aatcggaac
2761 c ctaaaggga g cccccgatt t agagcttga c ggggaaagc c ggcgaacgt g gcgagaaag 2821 g aagggaaga a agcgaaagg a gcgggcgct a gggcgctgg c aagtgtagc g gtcacgctg 2881 c gcgtaacca c cacacccgc c gcgcttaat g cgccgctac a gggcgcgtc g cgccattcg
2941 c cattcaggc t gcgcaactg t tgggaaggg c gatcggtgc g ggcctcttc g ctattacgc
3001 c agctggcga a agggggatg t gctgcaagg c gattaagtt g ggtaacgcc a gggttttcc
3061 c agtcacgac g ttgtaaaac g acggccagt g agcgcgcgt a atacgactc a ctatagggc 3121 g aattgggta c cgggccccc c ctcgaggtc g acggtatcg a taagcttga t atcgaattc
3181 c tgcagcccg g gggatccac t agttctaga g cggccgcca c cgcggtgga g ctccagctt
3241 t tgttccctt t agtgagggt t aattgcgcg c ttggcgtaa t catggtcat a gctgtttcc
3301 t gtgtgaaat t gttatccgc t cacaattcc a cacaacata g gagccggaa g cataaagtg
3361 t aaagcctgg g gtgcctaat g agtgaggta a ctcacatta a ttgcgttgc g ctcactgcc
3421 c gctttccag t cgggaaacc t gtcgtgcca g ctgcattaa t gaatcggcc a acgcgcggg
3481 g agaggcggt t tgcgtattg g gcgctcttc c gcttcctcg c tcactgact c gctgcgctc
3541 g gtcgttcgg c tgcggcgag c ggtatcagc t cactcaaag g cggtaatac g gttatccac
3601 a gaatcaggg g ataacgcag g aaagaacat g tgagcaaaa g gccagcaaa a ggccaggaa 3661 c cgtaaaaag g ccgcgttgc t ggcgttttt c cataggctc c gcccccctg a cgagcatca
3721 c aaaaatcga c gctcaagtc a gaggtggcg a aacccgaca g gactataaa g ataccaggc 3781 g tttccccct g gaagctccc t cgtgcgctc t cctgttccg a ccctgccgc t taccggata
3841 c ctgtccgcc t ttctccctt c gggaagcgt g gcgctttct c atagctcac g ctgtaggta
3901 t ctcagttcg g tgtaggtcg t tcgctccaa g ctgggctgt g tgcacgaac c ccccgttca
3961 g cccgaccgc t gcgccttat c cggtaacta t cgtcttgag t ccaacccgg t aagacacga
4021 c ttatcgcca c tggcagcag c cactggtaa c aggattagc a gagcgaggt a tgtaggcgg 4081 t gctacagag t tcttgaagt g gtggcctaa c tacggctac a ctagaagga c agtatttgg
4141 t atctgcgct c tgctgaagc c agttacctt c ggaaaaaga g ttggtagct c ttgatccgg
4201 c aaacaaacc a ccgctggta g cggtggttt t tttgtttgc a agcagcaga t tacgcgcag
4261 a aaaaaagga t ctcaagaag a tcctttgat c ttttctacg g ggtctgacg c tcagtggaa
4321 c gaaaactca c gttaaggga t tttggtcat g agattatca a aaaggatct t cacctagat
4381 c cttttaaat t aaaaatgaa g ttttaaatc a atctaaagt a tatatgagt a aacttggtc
4441 t gacagttac c aatgcttaa t cagtgaggc a cctatctca g cgatctgtc t atttcgttc
4501 a tccatagtt g cctgactcc c cgtcgtgta g ataactacg a tacgggagg g cttaccatc
4561 t ggccccagt g ctgcaatga t accgcgaga c ccacgctca c cggctccag a tttatcagc
4621 a ataaaccag c cagccggaa g ggccgagcg c agaagtggt c ctgcaactt t atccgcctc 4681 c atccagtct a ttaattgtt g ccgggaagc t agagtaagt a gttcgccag t taatagttt
4741 g cgcaacgtt g ttgccattg c tacaggcat c gtggtgtca c gctcgtcgt t tggtatggc
4801 t tcattcagc t ccggttccc a acgatcaag g cgagttaca t gatccccca t gttgtgcaa
4861 a aaagcggtt a gctccttcg g tcctccgat c gttgtcaga a gtaagttgg c cgcagtgtt
4921 a tcactcatg g ttatggcag c actgcataa t tctcttact g tcatgccat c cgtaagatg
4981 c ttttctgtg a ctggtgagt a ctcaaccaa g tcattctga g aatagtgta t gcggcgacc
5041 g agttgctct t gcccggcgt c aatacggga t aataccgcg c cacatagca g aactttaaa
5101 a gtgctcatc a ttggaaaac g ttcttcggg g cgaaaactc t caaggatct t accgctgtt
5161 g agatccagt t cgatgtaac c cactcgtgc a cccaactga t cttcagcat c ttttacttt
5221 c accagcgtt t ctgggtgag c aaaaacagg a aggcaaaat g ccgcaaaaa a gggaataag 5281 g gcgacacgg a aatgttgaa t actcatact c ttccttttt c aatattatt g aagcattta
5341 t cagggttat t gtctcatga g cggatacat a tttgaatgt a tttagaaaa a taaacaaat
5401 a ggggttccg c gcacatttc c ccgaaaagt g ccacctggg t ccttttcat c acgtgctat
5461 a aaaataatt a taatttaaa t tttttaata t aaatatata a attaaaaat a gaaagtaaa
5521 a aaagaaatt a aagaaaaaa t agtttttgt t ttccgaaga t gtaaaagac t ctaggggga 5581 t cgccaacaa a tactacctt t tatcttgct c ttcctgctc t caggtatta a tgccgaatt
5641 g tttcatctt g tctgtgtag a agaccacac a cgaaaatcc t gtgatttta c attttactt
5701 a tcgttaatc g aatgtatat c tatttaatc t gcttttctt g tctaataaa t atatatgta
5761 a agtacgctt t ttgttgaaa t tttttaaac c tttgtttat t tttttttct t cattccgta
5821 a ctcttctac c ttctttatt t actttctaa a atccaaata c aaaacataa a aataaataa
5881 a cacagagta a attcccaaa t tattccatc a ttaaaagat a cgaggcgcg t gtaagttac 5941 a ggcaagcga t ccgtcctaa g aaaccatta t tatcatgac a ttaacctat a aaaataggc 6001 g tatcacgag g ccctttcgt c
//
其他酵母表达载体：
p416GFD pPIC9
p53blue pPIC9K
pACT2-AD pPIC9k-His
pAD-GAL4-2.1 pPICZA
pADH2 pPICZB
pAUR123 pPICZC
pBridge pPICZαA
pCL1 pPICZαB
pDEST32 pPICZαC
pDisplay pPICZαD
pDR195 pPICZαFC
pESC-His pPICZαGB
pESC-Leu pPink-HC
pESC-TRP pPink-LC
pESC-URA pPinkα-HC
pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316
pFLD pRS403
pFLD/CAT pRS405
pFLDαpRS406
pGADT7-T pRS414
pGAG424 pRS415
pGAPZA pRS416
pGAPZB pRS41H
pGAPZαB pRS426
pGAPZαC pRS426gal
pGBKT7 pSEP1
pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3
pHIC-PI pSos
pHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66
pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2
pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7
Ycp22lac-EGFP Ycplac33
pPIC9k-His酵母表达载体说明
pPIC9k-His 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2430 pPIC9k--‐His 载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pPIC9k--‐His 质粒类型: 酵母表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 载体质粒图谱和多克隆位点信息
其他酵母表达载体： p416GFD pPIC9 p53blue pPIC9K pACT2-AD pPIC9k-His pAD-GAL4-2.1 pPICZA pADH2 pPICZB pAUR123 pPICZC pBridge pPICZαA pCL1 pPICZαB pDEST32 pPICZαC pDisplay pPICZαD pDR195 pPICZαFC pESC-His pPICZαGB pESC-Leu pPink-HC pESC-TRP pPink-LC pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3 pHIC-PI pSos pHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66 pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA
酵母表达系统使用心得
精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会 这个 是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由
于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以 的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微
镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等 有 的 余的 （起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年
Pichia酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System
产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码 的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带 的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
p416GFD酵母表达载体
p416GFD 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2740 p416GFD 载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: p416GFD 质粒类型: 酵母表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 其他酵母表达载体： p416GFD pPIC9 p53blue pPIC9K pACT2-AD pPIC9k-His pAD-GAL4-2.1 pPICZA pADH2 pPICZB pAUR123 pPICZC pBridge pPICZαA pCL1 pPICZαB pDEST32 pPICZαC pDisplay pPICZαD pDR195 pPICZαFC pESC-His pPICZαGB pESC-Leu pPink-HC pESC-TRP pPink-LC pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403
pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3 pHIC-PI pSos pHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66 pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2 pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7 Ycp22lac-EGFP Ycplac33
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。为方 便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。 表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。 携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。所以，载体必须整合入酵母基因组中才能实 现异源蛋白的稳定表达。 多数情况下，外源基因多拷贝整合可提高表达水平。一般可采用如下3种方法建立多拷贝 表达株： ①在表达载体中插入首尾相连的多拷贝表达盒； ②在表达载体中插入细菌Tn903Kan基因，因G418抗性水平与载体拷贝数呈正相关；
pPIC ZαFC酵母表达载体说明
pPIC ZαFC 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2460 pPIC ZαFC 载体基本信息 出品公司: --‐--‐ 载体名称: pPIC ZαFC 质粒类型: 酵母表达载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 其他酵母表达载体： p416GFD pPIC9 p53blue pPIC9K pACT2-AD pPIC9k-His pAD-GAL4-2.1 pPICZA pADH2 pPICZB pAUR123 pPICZC pBridge pPICZαA pCL1 pPICZαB pDEST32 pPICZαC pDisplay pPICZαD pDR195 pPICZαFC pESC-His pPICZαGB pESC-Leu pPink-HC pESC-TRP pPink-LC pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405
pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3 pHIC-PI pSos pHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66 pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2 pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7 Ycp22lac-EGFP Ycplac33
pYES2酵母表达载体说明
pYES2 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2980 pYES2 载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pYES2 质粒类型: 酿酒酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 诱导方法: 半乳糖 启动子: GAL1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5857 b p 5' 测序引物及序列: T7: T AATACGACTCACTATAGGG 3' 测序引物及序列: CYC1 T erminator: G TGACATAACTAATTACATGATG 载体标签: / 载体抗性: 氨苄 筛选标记: URA3 备注: 利用半乳糖诱导蛋白在酿酒酵母中表达。 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: 稳定 Stable 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 载体质粒图谱和多克隆位点信息
pYES2多克隆位点 载体简介 pYES2的是一个5.9 kb的载体，设计用来在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中诱导表达重组蛋白。载体的特点在于基因插入载体的构建简单，以及能够使用原养型尿嘧啶进行转化株的筛选。 该载体包含以下元素： 1. 酵母GAL1启动子，能够在酿酒酵母中被半乳糖高水平的诱导蛋白表达目的蛋白，同时能够被葡萄糖抑制表达 2.多克隆位点可以使用的很多限制酶切位点，便于基因插入。
3.CYC1终止子能够有效终止mRNA的转录。 4.能够利用URA3基因筛选带有ura3基因型的酵母宿主菌株转化子。 5.氨苄抗性基因能够方便在大肠杆菌中的进行载体筛选。 载体序列 LOCUS pYES2 5857 bp DNA circular SYN DEFINITION pYES2 ACCESSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI FEATURES Location/Qualifiers source 1..5857 /organism="pYES2" /mol_type="other DNA" terminator complement(12..251) /label="CYC1_terminator" misc_feature 218..236 /label="pYESTrp_rev_primer" misc_feature 218..236 /label="CYC1_primer" promoter complement(368..386) /label="T7_promoter" promoter complement(410..861) /label="GAL1_promoter" misc_feature complement(424..447) /label="GAL1_primer" rep_origin complement(1402..2873) /label="2micron_origin" rep_origin 1404..2283 /label="2micron2_origin" promoter 2876..3101 /label="URA3_promoter" gene 3103..3903 /label="URA3" /gene="URA3" CDS 3103..3906 /label="ORF frame 1" CDS complement(3138..3614) /label="ORF frame 3"
pHis2酵母表达载体说明
pHis2 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2110 pHis2 pHis2载体基本信息 出品公司: Clontech 载体名称: pHis2 质粒类型: 酵母单杂交载体 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 7207bp 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 卡纳霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 含HIS3报告基因 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 载体质粒图谱和多克隆位点信息
载体序列 ORIGIN 1 G AATTCCCGG G GAGCTCACG C GTTCGCGAA T CGATCCGCG G TCTAGAAAT T CCTGGCATT 61 A TCACATAAT G AATTATACA T TATATAAAG T AATGTGATT T CTTCGAAGA A TATACTAAA 121 A AATGAGCAG G CAAGATAAA C GAAGGCAAA G ATGACAGAG C AGAAAGCCC T AGTAAAGCG
181 T ATTACAAAT G AAACCAAGA T TCAGATTGC G ATCTCTTTA A AGGGTGGTC C CCTAGCGAT 241 A GAGCACTCG A TCTTCCCAG A AAAAGAGGC A GAAGCAGTA G CAGAACAGG C CACACAATC 301 G CAAGTGATT A ACGTCCACA C AGGTATAGG G TTTCTGGAC C ATATGATAC A TGCTCTGGC 361 C AAGCATTCC G GCTGGTCGC T AATCGTTGA G TGCATTGGT G ACTTACACA T AGACGACCA 421 T CACACCACT G AAGACTGCG G GATTGCTCT C GGTCAAGCT T TTAAAGAGG C CCTAGGGGC 481 C GTGCGTGGA G TAAAAAGGT T TGGATCAGG A TTTGCGCCT T TGGATGAGG C ACTTTCCAG 541 A GCGGTGGTA G ATCTTTCGA A CAGGCCGTA C GCAGTTGTC G AACTTGGTT T GCAAAGGGA 601 G AAAGTAGGA G ATCTCTCTT G CGAGATGAT C CCGCATTTT C TTGAAAGCT T TGCAGAGGC 661 T AGCAGAATT A CCCTCCACG T TGATTGTCT G CGAGGCAAG A ATGATCATC A CCGTAGTGA 721 G AGTGCGTTC A AGGCTCTTG C GGTTGCCAT A AGAGAAGCC A CCTCGCCCA A TGGTACCAA 781 C GATGTTCCC T CCACCAAAG G TGTTCTTAT G TAGTGACAC C GATTATTTA A AGCTGCAGC 841 A TACGATATA T ATACATGTG T ATATATGTA T ACCTATGAA T GTCAGTAAG T ATGTATACG 901 A ACAGTATGA T ACTGAAGAT G ACAAGGTAA T GCATCATTC T ATACGTGTC A TTCTGAACG 961 A GGCGCGCTT T CCTTTTTTC T TTTTGCTTT T TCTTTTTTT T TCTCTTGAA C TCGAGAAAA 1021 A AAATATAAA A GAGATGGAG G AACGGGAAA A AGTTAGTTG T GGTGATAGG T GGCAAGTGG 1081 T ATTCCGTAA G AACAACAAG A AAAGCATTT C ATATTATGG C TGAACTGAG C GAACAAGTG 1141 C AAAATTTAA G CATCAACGA C AACAACGAG A ATGGTTATG T TCCTCCTCA C TTAAGAGGA 1201 A AACCAAGAA G TGCCAGAAA T AACATGAGC A ACTACAATA A CAACAACGG C GGCTACAAC 1261 G GTGGCCGTG G CGGTGGCAG C TTCTTTAGC A ACAACCGTC G TGGTGGTTA C GGCAACGGT 1321 G GTTTCTTCG G TGGAAACAA C GGTGGCAGC A GATCTAACG G CCGTTCTGG T GGTAGATGG 1381 A TCGATGGCA A ACATGTCCC A GCTCCAAGA A ACGAAAAGG C CGAGATCGC C ATATTTGGT 1441 G TCCCCGAGG A TCCTCTACG C CGGACGCAT C GTGGCCGGC A TCACCGGCG C CACAGGTGC 1501 G GTTGCTGGC G CCTATATCG C CGACATCAC C GATGGGGAA G ATCGGGCTC G CCACTTCGG 1561 G CTCATGAGC G CTTGTTTCG G CGTGGGTAT G GTGGCAGGC C CCGTGGCCG G GGGACTGTT 1621 G GGCGCCATC T CCTTGCATG C ACCATTCCT T GCGGCGGCG G TGCTCAACG G CCTCAACCT 1681 A CTACTGGGC T GCTTCCTAA T GCAGGAGTC G CATAAGGGA G AGCGTCGAC C GATGCCCTT 1741 G AGAGCCTTC A ACCCAGTCA G CTCCTTCCG G TGGGCGCGG G GCATGACTA T CGTCGCCGC 1801 A CTTATGACT G TCTTCTTTA T CATGCAACT C GTAGGACAG G TGCCGGCAG C GCTCTGGGT 1861 C ATTTTCGGC G AGGACCGCT T TCGCTGGAG C GCGACGATG A TCGGCCTGT C GCTTGCGGT 1921 A TTCGGAATC T TGCACGCCC T CGCTCAAGC C TTCGTCACT G GTCCCGCCA C CAAACGTTT 1981 C GGCGAGAAG C AGGCCATTA T CGCCGGCAT G GCGGCCGAC G CGCTGGGCT A CGTCTTGCT 2041 G GCGTTCGCG A CGCGAGGCT G GATGGCCTT C CCCATTATG A TTCTTCTCG C TTCCGGCGG 2101 C ATCGGGATG C CCGCGTTGC A GGCCATGCT G TCCAGGCAG G TAGATGACG A CCATCAGGG 2161 A CAGCTTCAA G GATCGCTCG C GGCTCTTAC C AGCCTAACT T CGATCATTG G ACCGCTGAT 2221 C GTCACGGCG A TTTATGCCG C CTCGGCGAG C ACATGGAAC G GGTTGGCAT G GATTGTAGG 2281 C GCCGCCCTA T ACCTTGTCT G CCTCCCCGC G TTGCGTCGC G GTGCATGGA G CCGGGCCAC 2341 C TCGACCTGA A TGGAAGCCG G CGGCACCTC G CTAACGGAT T CACCACTCC A AGAATTGGA 2401 G CCAATCAAT T CTTGCGGAG A ACTGTGAAT G CGCAAACCA A CCCTTGGCA G AACATATCC 2461 A TCGCGTCCG C CATCTCCAG C AGCCGCACG C GGCGCATCG G GGGGGGGGT T TCAATTCAA 2521 T TCATCATTT T TTTTTTATT C TTTTTTTTG A TTTCGGTTT C TTTGAAATT T TTTTAACGA 2581 C ATTACTATA T ATATAATAT A GGAAGCATT T AATAGAACA G CATCGTAAT A TATGTGTAC 2641 T TTGCAGTTA T GACGCCAGA T GGCAGTAGT G GAAGATATT C TTTATTGAA A AATAGCTTG 2701 T CACCTTACG T ACAATCTTG A TCCGGAGCT T TTCTTTTTT T GCCGATTAA G AATTAATTC 2761 G GTCGAAAAA A GAAAAGGAG A GGGCCAAGA G GGAGGGCAT T GGTGACTAT T GAGCACGTG
pPICZ A酵母表达载体说明
pPICZ A 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2440 pPICZ A pPICZA载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pPICZA, p PICZ A 质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: AOX1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 3329 b p 5' 测序引物及序列: 5′ A OX1:5′--‐GACTGGTTCCAATTGACAAGC--‐3′ 3' 测序引物及序列: 3′ A OX1:5′--‐GCAAATGGCATTCTGACATCC--‐3′ 载体标签: C--‐Myc, C--‐His 载体抗性: Zeocin 博来霉素 筛选标记: HIS4 备注: 插入基因是必需包含起始密码子ATG。 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: 稳定 Stable 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pPICZA载体质粒图谱和多克隆位点信息
pPICZA多克隆位点 pPICZA载体简介 pPICZ A，B和C是3.3 k b的毕赤酵母蛋白载体。表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个C--‐端多肽，多太重含c--‐myc和C--‐His标签。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。 pPICZ系列载体包含以下元素： ?5'片段含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因（Ellis等，1985; Koutz等人，1989;tschopp等人，1987A）。 ?Zeocin抗性基因在大肠杆菌和毕赤酵母都能用于筛选（Baron等人,1992; D rocourt等人，1990）。 ?C--‐端含Myc和His标签，可以用于检测和纯化重组蛋白。 ?pPICZ A, B, C三种读码框使得可以将基因克隆入载体而不发生任何移码突变。 pPICZA载体序列 LOCUS pPICZ A 3329 b p d s--‐DNA circular S YN ORIGIN 1 a gatctaaca t ccaaagacg a aaggttgaa t gaaaccttt t tgccatccg a catccacag 61 g tccattctc a cacataagt g ccaaacgca a caggagggg a tacactagc a gcagaccgt 121 t gcaaacgca g gacctccac t cctcttctc c tcaacaccc a cttttgcca t cgaaaaacc 181 a gcccagtta t tgggcttga t tggagctcg c tcattccaa t tccttctat t aggctacta 241 a caccatgac t ttattagcc t gtctatcct g gcccccctg g cgaggttca t gtttgttta 301 t ttccgaatg c aacaagctc c gcattacac c cgaacatca c tccagatga g ggctttctg 361 a gtgtggggt c aaatagttt c atgttcccc a aatggccca a aactgacag t ttaaacgct 421 g tcttggaac c taatatgac a aaagcgtga t ctcatccaa g atgaactaa g tttggttcg
pPICZα B酵母表达载体
pPICZα B 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT3030 pPICZα B pPICZalpha B载体基本信息 出品公司: Invitrogen 载体名称: pPICZalpha B, p PICZα B, p PICZalphaB, p PICZαB 质粒类型: 毕赤酵母蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: AOX1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 3597 b p 5' 测序引物及序列: 5′ A OX1:5′--‐GACTGGTTCCAATTGACAAGC--‐3′ 3' 测序引物及序列: 3′ A OX1:5′--‐GCAAATGGCATTCTGACATCC--‐3′ 载体标签: C--‐Myc, C--‐His 载体抗性: Zeocin 博来霉素 筛选标记: HIS4 备注: 插入基因是必需包含起始密码子ATG。 产品目录号: V195--‐20 稳定性: 稳定 Stable 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pPICZalpha B载体质粒图谱和多克隆位点信息
pPICZalpha B载体简介 pPICZα A，B和C是3.6 k b的毕赤酵母蛋白分泌表达载体。表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个N--‐端多肽，编码酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α--‐因子分泌信号。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水 平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。 pPICZα A，B和C系列载体包含以下元素：
毕赤酵母表达系统资料整理
Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步： 抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS 115、X- 33、KM71和SMD1168的区别 GS 115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS 115、KM 71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可
pFLD酵母表达载体说明
pFLD 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT2130 pFLD 载体基本信息 出品公司: Invitrigen 载体名称: pFLD 质粒类型: 酵母表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: FLD1 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4409 b p 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag (6x) ; V5 E pitope T ag 载体抗性: Ampicillin 筛选标记: Zeocin 备注: 巴斯德毕赤酵母蛋白表达。诱导剂：甲胺 产品目录号: V942--‐20 稳定性: --‐--‐ 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 载体质粒图谱和多克隆位点信息
载体简介 pFLD and pFLDalpha are Pichia pastoris expression vectors designed for methylamine--‐induced expression a nd r apid p rotein p urification a nd d etection. T he v ectors f eature: 1.FLD p romoter f or i nducible e xpression w ith m ethylamine (1) 2.C--‐terminal V5 e pitope a nd p olyhistidine (6xHis) r egion f or c onvenient d etection w ith a n A nti--‐V5 antibody a nd p urification u sing n ickel--‐chelating r esin 3.α--‐factor s ecretion s ignal f or e fficient t ransport o f p roteins t o t he m edium (pFLDalpha o nly) 载体序列 GCATGCAGGAATCTCTGGCACGGTGCTAATGGTAGTTATCCAACGGAGCTGAGGTAGTCGATATATCTGG ATATGCCGCCTATAGGATAAAAACAGGAGAGGGTGAACCTTGCTTATGGCTACTAGATTGTTCTTGTACT CTGAATTCTCATTATGGGAAACTAAACTAATCTCATCTGTGTGTTGCAGTACTATTGAATCGTTGTAGTA TCTACCTGGAGGGCATTCCATGAATTAGTGAGATAACAGAGTTGGGTAACTAGAGAGAATAATAGACGTA TGCATGATTACTACACAACGGATGTCGCACTCTTTCCTTAGTTAAAACTATCATCCAATCACAAGATGCG GGCTGGAAAGACTTGCTCCCGAAGGATAATCTTCTGCTTCTATCTCCCTTCCTCATATGGTTTCGCAGGG CTCATGCCCCTTCTTCCTTCGAACTGCCCGATGAGGAAGTCCTTAGCCTATCAAAGAATTCGGGACCATC ATCGATTTTTAGAGCCTTACCTGATCGCAATCAGGATTTCACTACTCATATAAATACATCGCTCAAAGCT CCAACTTTGCTTGTTCATACAATTCTTGATATTCACACAATTGTTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGG ATCGGTACCTCGAGCCGCGGCGGCCGCCAGCTTGGGCCCAATTGGGGTGGTAAGCCTATCCCTAACCCTC TCCTCGGTCTCGATTCTACGGGTGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGA CTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCA GAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAG GATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAA TATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTC AGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCGGCGCGCCGATCCGCCTGATGCGGTATT TTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGAT GCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCC CGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATC ACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATG GTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAA TACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAA